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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Presentamos un protocolo para el cultivo ex vivo de tejido miocárdico ventricular humano. Permite un análisis detallado de la fuerza de contracción y la cinética, así como la aplicación de pre y postcarga para imitar más de cerca el entorno fisiológico in vivo .

Resumen

El cultivo de cardiomiocitos ha visto un gran número de desarrollos, que van desde el cultivo de células bidimensionales (2D) hasta los organoides derivados de iPSC. En 2019, se demostró una forma ex vivo de cultivar rebanadas de miocardio obtenidas de muestras de corazón humano, mientras se acercaba a la condición in vivo de contracción miocárdica. Estas muestras se originan principalmente en trasplantes de corazón o colocaciones de dispositivos de asistencia ventricular izquierda. Utilizando un vibratomo y un sistema de cultivo especialmente desarrollado, se colocan rodajas de 300 μm de espesor entre un alambre fijo y un alambre de resorte, lo que permite un cultivo estable y reproducible durante varias semanas. Durante el cultivo, las rebanadas se estimulan continuamente de acuerdo con los entornos individuales. Las contracciones se pueden mostrar y registrar en tiempo real, y los agentes farmacológicos se pueden aplicar fácilmente. Los protocolos de estimulación definidos por el usuario se pueden programar y realizar para evaluar parámetros vitales de contracción como la potenciación posterior a la pausa, el umbral de estimulación, la relación fuerza-frecuencia y el período refractario. Además, el sistema permite un ajuste variable de pre y postcarga para un cultivo más fisiológico.

Aquí, presentamos una guía paso a paso sobre cómo generar un cultivo exitoso a largo plazo de cortes de miocardio del ventrículo izquierdo humano, utilizando una solución de cultivo biomimético comercial.

Introducción

En la última década, el cultivo in vitro de células miocárdicas ha realizado grandes avances, que van desde técnicas 2D y tridimensionales (3D) hasta el uso de organoides y células madre pluripotentes inducidas diferenciadas en miocitos cardíacos 1,2,3. Los cultivos de células primarias y ex vivo han demostrado ser de gran valor, especialmente para estudios genéticos y desarrollo de fármacos 4,5,6. El uso de tejidos humanos mejora el valor traslacional de los result....

Protocolo

La recolección de tejidos para los experimentos descritos aquí fue aprobada por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Munich y la Universidad Ruhr-Bochum. Los estudios se realizaron de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la recolección de tejidos.

1. Adquisición de tejidos

  1. Obtener tejido humano de pacientes sometidos a trasplante de corazón o cirugía cardíaca.
  2. Antes de obtener el tejido, prepare 2 L de solución cardiopléjica (también conocida como tampón de corte (Tabla 1)).

Resultados

La contracción de las rodajas de miocardio se mostró en la pantalla de la computadora después de la inserción de la cámara de cultivo en su conector correspondiente (Figura 3). La contracción de las rebanadas de miocardio humano comenzó inmediatamente después de la estimulación. Las rebanadas hipercontraídas durante 5-10 min. Esto fue visible como un aumento de las fuerzas diastólicas, causadas por una contractura tónica de fracciones de tejido dañadas. Este proceso se revirtió.......

Discusión

En el pasado, la investigación cardiovascular ha hecho grandes avances en el cultivo de cardiomiocitos. Sin embargo, el cultivo 3D de cardiomiocitos con geometría intacta aún no está bien establecido. En comparación con los protocolos anteriores aplicados para el cultivo ex vivo de tejido miocárdico, el protocolo que describimos aquí se asemeja más al entorno in vivo del tejido. Además, la aplicación de pre y postcarga permite un entorno más biomimético. Somos capaces de analizar y comprende.......

Divulgaciones

JH, PS, DM y KL no tienen nada que revelar. AD y TS son accionistas de InVitroSys GmbH, que proporciona el sistema de cultivo Myodish.

Agradecimientos

La investigación fue financiada por las subvenciones DZHK 81Z0600207 (JH, PS y DM) y 81X2600253 (AD y TS).

Los autores desean agradecer a Claudia Fahney, Mei-Ping Wu y Matthias Semisch por su apoyo en la preparación de las configuraciones, así como por el mantenimiento regular del cultivo de tejidos.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Agarose Low melting pointRoth6351.2
Bay-K8644Cayman Chemical19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)SigmaB0753-1kg
CaCl2*H2OMerck2382.1
CalciseptineAlomone LabsSPC-500
Glucose*H2OAppliChemA3730.0500
H2OBBraun3703452
HEPESAppliChemA1069.0500
HistoacrylBBraun1050052
Isopropanol 100%SAV LP GmbHUN1219
ITS-X-supplementGibco5150056
KClMerck1.04933.0500
Medium 199Gibco31150-022
MgCl2*6H2OAppliChemA1036.0500
NaClSigmaS5886-1KG
NaH2PO4*H2OMerck1.06346.0500
NifedipineSigmaN7634-1G
Penicillin / streptomycin x100SigmaP0781-100ML
β-MercaptoethanolAppliChemA1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinetThermo ScientificKS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BMBBraunIn-house made combination of cooling and heating solution.
IncubatorBinderCB240
MyoDish bioreactor systemInVitroSys GmbHMyoDish 1Myodish cultute system
VibratomeLeicaVT1200s
Water bath 37 degreesHaakeSWB25
Water bath 80 degreesDaglef Patz KG7070
Materials
100 mL plastic single-use beakerSarstedt75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick ReleaseMilliporeS2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20GBBraun4665791
Plastic trianglesIn-house made
Razor Derby premiumDerby TokaiB072HJCFK6
Razor Gillette Silver BlueGillette7393560010170
Scalpel disposableFeather02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD DiscarditBBraun309110
Tissue Culture Dish 10 cmFalcon353003
Tissue Culture Dish 3.5 cmFalcon353001
Tubes 50 mLFalcon352070

Referencias

  1. George, S. A., Brennan, J. A., Efimov, I. R. Preclinical cardiac electrophysiology assessment by dual voltage and calcium optical mapping of human organotypic cardiac slices. Journal of Visualized Expereiments: JoVE. (160), e60781 (2020).
  2. Lu, K., et al.

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