Preparación del tejido miocárdico humano para el cultivo a largo plazo

Resumen

Presentamos un protocolo para el cultivo ex vivo de tejido miocárdico ventricular humano. Permite un análisis detallado de la fuerza de contracción y la cinética, así como la aplicación de pre y postcarga para imitar más de cerca el entorno fisiológico in vivo .

Resumen

El cultivo de cardiomiocitos ha visto un gran número de desarrollos, que van desde el cultivo de células bidimensionales (2D) hasta los organoides derivados de iPSC. En 2019, se demostró una forma ex vivo de cultivar rebanadas de miocardio obtenidas de muestras de corazón humano, mientras se acercaba a la condición in vivo de contracción miocárdica. Estas muestras se originan principalmente en trasplantes de corazón o colocaciones de dispositivos de asistencia ventricular izquierda. Utilizando un vibratomo y un sistema de cultivo especialmente desarrollado, se colocan rodajas de 300 μm de espesor entre un alambre fijo y un alambre de resorte, lo que permite un cultivo estable y reproducible durante varias semanas. Durante el cultivo, las rebanadas se estimulan continuamente de acuerdo con los entornos individuales. Las contracciones se pueden mostrar y registrar en tiempo real, y los agentes farmacológicos se pueden aplicar fácilmente. Los protocolos de estimulación definidos por el usuario se pueden programar y realizar para evaluar parámetros vitales de contracción como la potenciación posterior a la pausa, el umbral de estimulación, la relación fuerza-frecuencia y el período refractario. Además, el sistema permite un ajuste variable de pre y postcarga para un cultivo más fisiológico.

Aquí, presentamos una guía paso a paso sobre cómo generar un cultivo exitoso a largo plazo de cortes de miocardio del ventrículo izquierdo humano, utilizando una solución de cultivo biomimético comercial.

Introducción

En la última década, el cultivo in vitro de células miocárdicas ha realizado grandes avances, que van desde técnicas 2D y tridimensionales (3D) hasta el uso de organoides y células madre pluripotentes inducidas diferenciadas en miocitos cardíacos ^1,2,3. Los cultivos de células primarias y ex vivo han demostrado ser de gran valor, especialmente para estudios genéticos y desarrollo de fármacos ^4,5,6. El uso de tejidos humanos mejora el valor traslacional de los resultados. Sin embargo, el cultivo 3D a largo plazo de tejidos miocárdicos con geometría intacta no está bien establecido. La geometría intacta es una característica clave para imitar las condiciones in vivo, ya que la función cardíaca adecuada, la comunicación entre diferentes células, así como las interacciones célula-matriz son requisitos previos. El cultivo de tejido miocárdico pasó por varias fases de desarrollo. La tasa de éxito y la estabilidad del cultivo de tejido miocárdico ex vivo fueron inicialmente bastante bajas, pero los enfoques recientes han arrojado resultados prometedores 7,8,9,10,11.

Entre ellos, Fischer et al. fueron los primeros en demostrar que la viabilidad y el rendimiento contráctil del tejido miocárdico humano se pueden mantener en el cultivo de células ex vivo durante muchas semanas⁷. Su técnica se basaba en finas rebanadas de tejido cortadas a partir de miocardio humano explantado, que se montaban en cámaras de cultivo recientemente desarrolladas que proporcionaban condiciones biomecánicas definidas y estimulación eléctrica continua. Este método de cultivo se asemeja mucho a la función in vivo del tejido miocárdico, y ha sido reproducido por varios grupos de investigación independientes 2,12,13,14,15. Es importante destacar que las cámaras utilizadas por Fischer et al. también permitieron el registro continuo de las fuerzas desarrolladas durante un máximo de 4 meses, y por lo tanto abrieron oportunidades sin precedentes para la investigación fisiológica y farmacológica sobre el miocardio humano intacto⁷.

Técnicas similares fueron desarrolladas de forma independiente por otros grupos y aplicadas al miocardio humano, de ratas, porcinos y^{conejos 7,10,11}. Pitoulis et al. desarrollaron posteriormente un método más fisiológico, que reproduce la relación fuerza-longitud normal durante un ciclo de contracción, pero es menos adecuado para el análisis de alto rendimiento¹⁶. Como tal, el enfoque general del cultivo biomimético puede considerarse como un paso más en la reducción, refinamiento y reemplazo (3R) de los experimentos con animales.

Sin embargo, la explotación de este potencial requiere procedimientos estandarizados, análisis de alto contenido y un alto nivel de rendimiento. Presentamos una técnica que combina el corte automatizado de miocardio humano vivo con el mantenimiento in vitro en un sistema de cultivo biomimético que ha llegado a estar disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales). Con el enfoque propuesto, el número de rebanadas individuales que se pueden generar a partir de una sola muestra transmural de miocardio solo está limitado por el tiempo de procesamiento. Una muestra de tamaño y calidad suficientes (3 cm x 3 cm) a menudo produce 20-40 rebanadas de tejido que se cortan convenientemente con un vibratomo automatizado. Estas rodajas se pueden colocar en cámaras de cultivo pertenecientes al sistema. Las cámaras permiten la estimulación eléctrica, cuyos parámetros se pueden modular (es decir, la duración del pulso, la polaridad, la velocidad y la corriente), así como el ajuste de la precarga y la poscarga, utilizando cables de resorte dentro de las cámaras. La contracción de cada rebanada se registra a partir del movimiento de un pequeño imán unido a un cable de resorte y se muestra como un gráfico interpretable. Los datos se pueden registrar en todo momento y analizar utilizando software disponible gratuitamente. Además de la estimulación basal constante, se pueden realizar protocolos programados para evaluar funcionalmente su período refractario, umbral de estimulación, potenciación posterior a la pausa y relación fuerza-frecuencia.

Este cultivo biomimético a largo plazo de múltiples rebanadas de miocardio de un corazón individual allana el camino para futuras investigaciones ex vivo en tejidos humanos y animales, y facilita la detección de efectos farmacológicos terapéuticos y cardiotóxicos en medicina cardiovascular. Ya se ha aplicado a diversos enfoques experimentales 2,12,13,15. Aquí, damos una descripción detallada paso a paso de la preparación del tejido humano y proporcionamos soluciones para los problemas de cultivo que se encuentran con frecuencia.

Protocolo

La recolección de tejidos para los experimentos descritos aquí fue aprobada por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Munich y la Universidad Ruhr-Bochum. Los estudios se realizaron de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la recolección de tejidos.

1. Adquisición de tejidos

1. Obtener tejido humano de pacientes sometidos a trasplante de corazón o cirugía cardíaca.
2. Antes de obtener el tejido, prepare 2 L de solución cardiopléjica (también conocida como tampón de corte (Tabla 1)).
3. Después de obtener una biopsia transmural del ventrículo izquierdo (VI) transmural de 4 cm x 4 cm de tamaño, coloque el tejido inmediatamente (dentro de los 5 minutos posteriores a la escisión) en un vaso de precipitados estéril de plástico de un solo uso que contenga aproximadamente 70 ml de tampón de corte frío (4 ° C). Mantener a 4 °C.
   NOTA: El tampón de corte utilizado en este protocolo permite el almacenamiento en frío (4 °C) del tejido durante un máximo de 36 h. Esto permite el transporte en frío del tejido desde clínicas que no están cerca del laboratorio. Sin embargo, los tiempos de transporte ≤ 24 h han demostrado ser óptimos.

2. Preparación de la agarosa y el vibratomo

1. Asegúrese de que se preparen y esterilizen suficientes cámaras de cultivo (Figura 1A).
   1. Sumergir las cámaras y los electrodos de grafito en 1 L de una solución de isopropanol al 10% y agitar durante la noche. Al día siguiente, transfiera las cámaras a una solución de isopropanol al 100% durante 3 min y autoclave los electrodos de grafito a 120 °C durante 10 min.
   2. Deje que las cámaras y los electrodos de grafito se sequen al aire bajo una campana de flujo laminar.
   3. Conecte una placa de circuito a cada una de las cámaras de acuerdo con las posiciones disponibles en el balancín. Coloque dos electrodos de grafito en la placa de circuito según las instrucciones del fabricante.
   4. Coloque una tapa de placa de Petri de 35 mm en la parte superior de la cámara para evitar la contaminación.
2. Configure el sistema de cultivo Myodish (ver Tabla de Materiales) en una incubadora a 37 °C y 5% CO₂ conectando el sistema a una computadora (Figura 1B).
3. Prepare la agarosa de baja fusión al 4% en tampón de corte (sin glucosa; Tabla 2). La agarosa se puede almacenar a 4 °C durante 6 meses.
   1. El día del experimento, derrita un volumen de caldo de solución de agarosa utilizando un baño de agua a 80 ° C. Dependiendo de la cantidad, la fusión tarda aproximadamente 30 min.
   2. Cuando la agarosa es líquida, extraiga 8 ml de agarosa líquida en una jeringa de 10 ml, con 2 ml adicionales de aire. Cierre la jeringa con una tapa estéril y colóquela boca abajo en un baño de agua a 37 °C durante 20 min, para evitar que la agarosa se solidifique y para equilibrar su temperatura para evitar el daño por hipertermia de la muestra.
4. Si está presente, encienda el dispositivo de enfriamiento por agua del vibratomo al menos 30 minutos antes de cortar el tejido para permitir una capacidad de enfriamiento suficiente. Ajuste la temperatura de la circulación del agua a 4 °C.
   NOTA: La bandeja de corte y la placa de enfriamiento utilizadas aquí contenían una circulación de agua incorporada. Esto es muy recomendable para el enfriamiento y para reducir los riesgos de contaminación. Sin embargo, también es posible utilizar el hielo como técnica de enfriamiento. Además, el dispositivo de enfriamiento por agua no necesita estar conectado a la bandeja de corte y / o placa de enfriamiento del vibratomo en este punto del protocolo.
5. Limpie la bandeja de corte y la placa de muestra del vibratomo enjuagando todas las superficies con 100% de isopropanol durante al menos 3 min.
   NOTA: Dependiendo del sistema vibratome utilizado, la configuración del vibratome puede diferir. Consulte el manual del vibratomo presente en el laboratorio para obtener información sobre la configuración y los métodos de calibración de la cuchilla.
6. Llene la bandeja de corte hasta un 90%-95% con tampón de corte. En la configuración utilizada actualmente, esto corresponde a aproximadamente 400 ml. Conecte el tubo del dispositivo de enfriamiento por agua a las válvulas de la bandeja de corte y la placa de enfriamiento del vibratomo.
7. Desinfectar todas las herramientas necesarias para la preparación sumergiéndolas en una solución 100% isopropanol durante 5 s. Retire las herramientas de la solución de isopropanol y séquelas al aire debajo de la campana de flujo laminar.

3. Recorte e incrustación de las muestras

1. Transfiera la muestra de tejido a una placa de Petri de 100 mm llena de tampón de corte frío. Mantenga el plato en una placa de enfriamiento a 4 ° C (conectado al refrigerador o colocado sobre hielo).
2. Retire las trabéculas endocárdicas sosteniendo el endocardio con pinzas y usando tijeras para cortar aproximadamente 3 mm de tejido endocárdico. De la misma manera, elimine el exceso de tejido adiposo debajo del epicardio si está presente.
3. Fijar la muestra de tejido cortado, lado endocárdico hacia arriba, a un parche de goma de 2 cm x 2 cm utilizando cuatro agujas de 0,9 mm x 70 mm 20 G que se fijan en posición cuadrada (0,9 cm x 0,9 cm; Figura 1C, D). Asegúrese de que el borde diagonal de cada punta de la aguja apunte hacia adentro. Esto mejora la fijación y previene el daño al miocardio.
   PRECAUCIÓN: La orientación del cuadrado mencionado anteriormente debe ser ortogonal a la dirección miofibra predominante esperada.
4. Corte todo el exceso de tejido fuera del cuadrado de cuatro agujas con un bisturí. Si el tamaño de la muestra original lo permite, utilice dos muestras de tejidos miocárdicos durante esta preparación a partir de la misma muestra cruda.
5. Usando pinzas, coloque la muestra recortada en un pedazo estéril de tejido para eliminar cualquier exceso de tampón de corte que quede en la muestra. Para evitar que se seque la muestra, no la mantenga en el tejido por más de 10 s.
6. Coloque la(s) muestra(s) en una placa de Petri de 35 mm, de modo que la cuchilla corte perpendicularmente a la alineación de los cardiomiocitos y el epicardio esté mirando hacia abajo. Si la preparación incluye dos muestras, asegúrese de que las muestras estén centradas y no se toquen entre sí.
7. Tome la jeringa de agarosa del baño de agua y sumerja la(s) muestra(s) en agarosa. (Figura 2A). Deje que la agarosa se solidifique durante 5 minutos en una placa de enfriamiento. La(s) muestra(s) debe(n) permanecer en contacto con la placa de Petri, lo que asegurará que el plano de corte sea paralelo a la dirección predominante de la fibra miocárdica.
   PRECAUCIÓN: No vacíe completamente la jeringa, con el fin de evitar burbujas de aire. Preste atención a la cantidad de agarosa que queda en la jeringa durante la inmersión de las muestras. En el caso de burbujas de aire en el plato con las muestras, tire cuidadosamente de las burbujas de aire hacia la jeringa.

4. Colocación de las muestras en la bandeja de corte

1. Retire la agarosa solidificada que contiene la(s) muestra(s) de la placa de Petri de 35 mm utilizando una espátula o herramienta similar, encajándola entre la muestra y el lado de la placa de Petri. Corte parte de la agarosa con un bisturí mientras mantiene las muestras cubiertas.
   PRECAUCIÓN: No retire demasiado de la agarosa. Debe quedar al menos 5 mm de agarosa en los lados largo y corto en el plano X / Z.
   NOTA: Los pasos 4.2-4.4 deben realizarse en rápida sucesión (es decir, máximo de 5 s). Tener todas las herramientas necesarias a su alcance antes de comenzar. No es posible el reposicionamiento de la muestra después de la colocación. Trate de limitar la exposición del pegamento al aire y la humedad. El contacto con el aire o los fluidos solidificará el pegamento, haciéndolo inutilizable.
2. Con una pipeta, coloque y distribuya 60 μL de pegamento dentro y alrededor del centro de la plataforma de corte.
3. Coloque el lado epicárdico de la muestra contenida en la agarosa sobre el área pegada con pinzas. No reposicionar. El lado endocárdico de la muestra debe ser visible en la agarosa. Deje que el pegamento se solidifique durante 1 min. Presione suavemente la agarosa que contiene la muestra desde la parte superior con una herramienta roma (por ejemplo, pinzas) mientras evita cortar o dañar la agarosa.
4. Coloque la plataforma de muestra en su posición designada en la bandeja de corte del vibrátomo, llena de tampón de corte.

5. Arranque del vibratomo

1. Ajuste la amplitud de vibración a 1 mm y la velocidad de corte inicial a 0,07 mm/s. Ajuste el grosor de la rebanada a 300 μm para cortar las rodajas.
2. Siempre que la cuchilla solo corte la agarosa, aumente la velocidad de corte a su máximo, que en este caso es de 1.50 mm / s. Tan pronto como el vibratome comience a cortar el tejido, disminuya la velocidad a 0.07 mm / s inmediatamente.
   NOTA: Si el tejido no se corta suavemente, por ejemplo, si hay grandes áreas fibróticas en la muestra, puede ayudar a aumentar la amplitud de corte hasta 1,5 mm y reducir la velocidad de corte a 0,04 mm / s.

6. Preparación del medio y la incubadora durante el procedimiento de corte

1. Llene cada cámara de cultivo con 2,4 ml de medio de cultivo completo (Tabla 3).
2. Coloque las cámaras de cultivo llenas de medio en el sistema de cultivo en la incubadora a 37 ° C, 5% CO₂, 21% O₂ y una humedad del 80%. Equilibrar el medio durante al menos 20 min.
3. Conecte el sistema de cultivo con una computadora e inicie el programa de software correspondiente.
4. Ajuste la velocidad del balancín a 60 rpm y preestablezca los parámetros de estimulación (pulsos de estimulación y frecuencia). Para las rebanadas cardíacas humanas, establezca la estimulación estándar a impulsos bifásicos con corriente de 50 mA, cada una de las cuales consiste en 3 ms de corriente positiva, una pausa de 1 ms y un pulso de 3 ms de corriente invertida, a una velocidad de ritmo de 30 latidos por minuto (BPM).
   NOTA: En tejidos bien conservados, el umbral de estimulación típico es de alrededor de 15 mA. Para garantizar una estimulación fiable y tener en cuenta cualquier posible aumento del umbral de estimulación, se recomienda establecer la corriente en un valor que supere el umbral de estimulación de dos a tres veces.
5. Verifique los indicadores de electrodos del software para verificar que los electrodos de las cámaras de cultivo funcionen correctamente.
   NOTA: Se necesita acción cada vez que el indicador de canal en el software de cultivo se vuelve rojo. En este caso, las cargas de pulso bipolar no están equilibradas.

7. Preparación de las rodajas

NOTA: Las rebanadas subendocárdicas iniciales comúnmente no son adecuadas para el cultivo de tejidos y deben descartarse debido a la morfología desigual. Después de las primeras cinco a 10 rebanadas, la textura y la morfología de la rebanada mejoran. La rebanada ideal es de al menos 1 cm x 1 cm, no tiene parches fibróticos o solo tiene parches fibróticos limitados, no está fragmentado y tiene una alineación de fibra homogénea (Figura 2B, D). La fibrosis intersticial, ubicada entre las fibras de los miocitos, a menudo está presente en el miocardio humano fallido. Sorprendentemente, esto no es un predictor negativo del éxito del cultivo.

1. Vierta una cantidad adecuada de tampón de corte frío en una tapa de placa de Petri de 5 cm para asegurarse de que las rebanadas no se sequen. Coloque las rodajas en la tapa de la placa de Petri que contiene el tampón de corte en frío.
2. Separe la agarosa del tejido usando pinzas. Evite tocar el tejido. Maneje el tejido con cuidado, ya que cualquier daño al tejido reducirá la tasa de éxito del cultivo.
3. Determine la dirección de las fibras miocárdicas mediante una inspección cercana contra una fuente de luz. Esto es importante cuando se unen los triángulos de plástico al tejido en el paso 7.6.
   NOTA: Los pasos 7.4 y 7.5 deben realizarse en rápida sucesión, dentro de los 5 s.
4. Conecte dos triángulos de plástico a una muestra con pegamento para anclar el tejido dentro de las cámaras de cultivo.
   1. Coloque 1 μL de pegamento en una tapa estéril de placa de Petri. Use una pinza enganchada para recoger uno de los triángulos de plástico en autoclave. Sumerja rápidamente el borde frontal del triángulo en el pegamento y pegue el triángulo sobre la muestra, perpendicular a la alineación de los cardiomiocitos. Repita para el otro triángulo.
5. Recorte el tejido que exceda el ancho del triángulo con un bisturí (Figura 2C). Coloque la rodaja con los dos triángulos montados de nuevo en el búfer de corte de la bandeja de corte.
   NOTA: Repita los pasos 7.2 a 7.5 hasta que se preparen suficientes rebanadas para llenar las cámaras de cultivo. Recomendamos preparar algunas rebanadas adicionales para permitir el reemplazo de las rebanadas con una contracción deficiente.

8. Montaje de las rodajas

NOTA: La poscarga está determinada por la rigidez del alambre de resorte en las cámaras de cultivo. Hay tres tipos diferentes disponibles, según el grosor del cable de resorte.

1. Tome una cámara de cultivo de llenado medio de la incubadora. Seleccione una de las rodajas preparadas e insértela en la cámara conectando un triángulo a cada pasador.
2. Ajuste la distancia entre los pasadores de montaje de acuerdo con el tamaño de la muestra. Asegúrese de que la muestra esté sumergida en medio. Vuelva a colocar la cámara en su zócalo designado del sistema de cultivo en la incubadora.
   PRECAUCIÓN: ¡No estire demasiado el tejido y no doble demasiado el alambre del resorte!
3. Ajuste la tensión de precarga después de colocar el plato en el balancín.
   1. Disminuya la precarga girando el tornillo de ajuste en sentido contrario a las agujas del reloj. Haga esto hasta que la línea de base del gráfico correspondiente en la pantalla de la computadora ya no cambie.
   2. Aumente cuidadosamente la precarga (es decir, aumente la tensión) girando el tornillo de ajuste en el sentido de las agujas del reloj. Para las cámaras con mayor rigidez, continúe hasta que la línea de base correspondiente en el gráfico haya aumentado en 1000-1200 unidades, lo que corresponde a 1 mN de precarga.
      NOTA: El ajuste exacto dependerá de la constante de resorte individual de una cámara de cultivo, que se puede determinar mediante calibración antes de un experimento de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El software de grabación permite considerar la calibración de la cámara individual para que las fuerzas se muestren uniformemente en μN. Se recomienda aplicar estimulación eléctrica desde el inicio del cultivo. Como tal, es muy posible que la rebanada comience a contraerse durante el ajuste de precarga. En este caso, concéntrese en la línea de base diastólica para evaluar la precarga.

9. Cambiar el medio

1. Prepare el medio de cultivo de acuerdo con la receta de la Tabla 3. Poco antes de usar el medio, agregue 50 μL de β-mercaptoetanol (50 mM) a un tubo de 50 mL. Conservar a 4 °C.
2. Una vez cada 2 días, intercambie parcialmente el medio de cultivo. Refresque el medio cada 2 días, si se desea el cultivo a largo plazo de las rodajas de miocardio.
3. Precaliente el medio fresco en un baño de agua o incubadora de aire caliente a 37 °C durante 30-45 min. Retire una cámara de cultivo de la incubadora y colóquela debajo de una campana de flujo laminar.
   PRECAUCIÓN: Es esencial mantener la cámara, así como el medio, caliente a 37 °C (> 35 °C) para evitar hipercontracciones debido a la baja temperatura. El daño menos distintivo puede estar presente como un aumento de la tensión diastólica dentro de unas pocas horas después del intercambio medio. Esto puede parecer que se recupera, pero el estrés repetido puede resultar en un deterioro acumulado.
4. Retire el medio de la cámara de cultivo, dejando aproximadamente 0,8 ml en la cámara. Añadir 1,6 ml de medio fresco a la misma cámara. El volumen total del medio debe ser de alrededor de 2,4 ml por cámara.
5. Coloque la cubierta de la cámara hacia atrás y vuelva a colocar la cámara de cultivo en su posición respectiva.

Resultados

La contracción de las rodajas de miocardio se mostró en la pantalla de la computadora después de la inserción de la cámara de cultivo en su conector correspondiente (Figura 3). La contracción de las rebanadas de miocardio humano comenzó inmediatamente después de la estimulación. Las rebanadas hipercontraídas durante 5-10 min. Esto fue visible como un aumento de las fuerzas diastólicas, causadas por una contractura tónica de fracciones de tejido dañadas. Este proceso se revirtió...

Discusión

En el pasado, la investigación cardiovascular ha hecho grandes avances en el cultivo de cardiomiocitos. Sin embargo, el cultivo 3D de cardiomiocitos con geometría intacta aún no está bien establecido. En comparación con los protocolos anteriores aplicados para el cultivo ex vivo de tejido miocárdico, el protocolo que describimos aquí se asemeja más al entorno in vivo del tejido. Además, la aplicación de pre y postcarga permite un entorno más biomimético. Somos capaces de analizar y comprende...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agarose Low melting point	Roth	6351.2
Bay-K8644	Cayman Chemical	19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)	Sigma	B0753-1kg
CaCl2*H2O	Merck	2382.1
Calciseptine	Alomone Labs	SPC-500
Glucose*H2O	AppliChem	A3730.0500
H2O	BBraun	3703452
HEPES	AppliChem	A1069.0500
Histoacryl	BBraun	1050052
Isopropanol 100%	SAV LP GmbH	UN1219
ITS-X-supplement	Gibco	5150056
KCl	Merck	1.04933.0500
Medium 199	Gibco	31150-022
MgCl2*6H2O	AppliChem	A1036.0500
NaCl	Sigma	S5886-1KG
NaH2PO4*H2O	Merck	1.06346.0500
Nifedipine	Sigma	N7634-1G
Penicillin / streptomycin x100	Sigma	P0781-100ML
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinet	Thermo Scientific	KS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM	BBraun		In-house made combination of cooling and heating solution.
Incubator	Binder	CB240
MyoDish bioreactor system	InVitroSys GmbH	MyoDish 1	Myodish cultute system
Vibratome	Leica	VT1200s
Water bath 37 degrees	Haake	SWB25
Water bath 80 degrees	Daglef Patz KG	7070
Materials
100 mL plastic single-use beaker	Sarstedt	75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick Release	Millipore	S2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20G	BBraun	4665791
Plastic triangles			In-house made
Razor Derby premium	Derby Tokai	B072HJCFK6
Razor Gillette Silver Blue	Gillette	7393560010170
Scalpel disposable	Feather	02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit	BBraun	309110
Tissue Culture Dish 10 cm	Falcon	353003
Tissue Culture Dish 3.5 cm	Falcon	353001
Tubes 50 mL	Falcon	352070