Preparación del tejido miocárdico humano para el cultivo a largo plazo

Resumen

Presentamos un protocolo para el cultivo ex vivo de tejido miocárdico ventricular humano. Permite un análisis detallado de la fuerza de contracción y la cinética, así como la aplicación de pre y postcarga para imitar más de cerca el entorno fisiológico in vivo .

Resumen

El cultivo de cardiomiocitos ha visto un gran número de desarrollos, que van desde el cultivo de células bidimensionales (2D) hasta los organoides derivados de iPSC. En 2019, se demostró una forma ex vivo de cultivar rebanadas de miocardio obtenidas de muestras de corazón humano, mientras se acercaba a la condición in vivo de contracción miocárdica. Estas muestras se originan principalmente en trasplantes de corazón o colocaciones de dispositivos de asistencia ventricular izquierda. Utilizando un vibratomo y un sistema de cultivo especialmente desarrollado, se colocan rodajas de 300 μm de espesor entre un alambre fijo y un alambre de resorte, lo que permite un cultivo estable y reproducible durante varias semanas. Durante el cultivo, las rebanadas se estimulan continuamente de acuerdo con los entornos individuales. Las contracciones se pueden mostrar y registrar en tiempo real, y los agentes farmacológicos se pueden aplicar fácilmente. Los protocolos de estimulación definidos por el usuario se pueden programar y realizar para evaluar parámetros vitales de contracción como la potenciación posterior a la pausa, el umbral de estimulación, la relación fuerza-frecuencia y el período refractario. Además, el sistema permite un ajuste variable de pre y postcarga para un cultivo más fisiológico.

Aquí, presentamos una guía paso a paso sobre cómo generar un cultivo exitoso a largo plazo de cortes de miocardio del ventrículo izquierdo humano, utilizando una solución de cultivo biomimético comercial.

Introducción

En la última década, el cultivo in vitro de células miocárdicas ha realizado grandes avances, que van desde técnicas 2D y tridimensionales (3D) hasta el uso de organoides y células madre pluripotentes inducidas diferenciadas en miocitos cardíacos ^1,2,3. Los cultivos de células primarias y ex vivo han demostrado ser de gran valor, especialmente para estudios genéticos y desarrollo de fármacos ^4,5,6. El uso de tejidos humanos mejora el valor traslacional de los result....

Protocolo

La recolección de tejidos para los experimentos descritos aquí fue aprobada por las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Munich y la Universidad Ruhr-Bochum. Los estudios se realizaron de acuerdo con las directrices de la Declaración de Helsinki. Los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito antes de la recolección de tejidos.

1. Adquisición de tejidos

1. Obtener tejido humano de pacientes sometidos a trasplante de corazón o cirugía cardíaca.
2. Antes de obtener el tejido, prepare 2 L de solución cardiopléjica (también conocida como tampón de corte (Tabla 1)).

Resultados

La contracción de las rodajas de miocardio se mostró en la pantalla de la computadora después de la inserción de la cámara de cultivo en su conector correspondiente (Figura 3). La contracción de las rebanadas de miocardio humano comenzó inmediatamente después de la estimulación. Las rebanadas hipercontraídas durante 5-10 min. Esto fue visible como un aumento de las fuerzas diastólicas, causadas por una contractura tónica de fracciones de tejido dañadas. Este proceso se revirtió.......

Discusión

En el pasado, la investigación cardiovascular ha hecho grandes avances en el cultivo de cardiomiocitos. Sin embargo, el cultivo 3D de cardiomiocitos con geometría intacta aún no está bien establecido. En comparación con los protocolos anteriores aplicados para el cultivo ex vivo de tejido miocárdico, el protocolo que describimos aquí se asemeja más al entorno in vivo del tejido. Además, la aplicación de pre y postcarga permite un entorno más biomimético. Somos capaces de analizar y comprende.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agarose Low melting point	Roth	6351.2
Bay-K8644	Cayman Chemical	19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)	Sigma	B0753-1kg
CaCl2*H2O	Merck	2382.1
Calciseptine	Alomone Labs	SPC-500
Glucose*H2O	AppliChem	A3730.0500
H2O	BBraun	3703452
HEPES	AppliChem	A1069.0500
Histoacryl	BBraun	1050052
Isopropanol 100%	SAV LP GmbH	UN1219
ITS-X-supplement	Gibco	5150056
KCl	Merck	1.04933.0500
Medium 199	Gibco	31150-022
MgCl2*6H2O	AppliChem	A1036.0500
NaCl	Sigma	S5886-1KG
NaH2PO4*H2O	Merck	1.06346.0500
Nifedipine	Sigma	N7634-1G
Penicillin / streptomycin x100	Sigma	P0781-100ML
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinet	Thermo Scientific	KS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM	BBraun		In-house made combination of cooling and heating solution.
Incubator	Binder	CB240
MyoDish bioreactor system	InVitroSys GmbH	MyoDish 1	Myodish cultute system
Vibratome	Leica	VT1200s
Water bath 37 degrees	Haake	SWB25
Water bath 80 degrees	Daglef Patz KG	7070
Materials
100 mL plastic single-use beaker	Sarstedt	75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick Release	Millipore	S2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20G	BBraun	4665791
Plastic triangles			In-house made
Razor Derby premium	Derby Tokai	B072HJCFK6
Razor Gillette Silver Blue	Gillette	7393560010170
Scalpel disposable	Feather	02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit	BBraun	309110
Tissue Culture Dish 10 cm	Falcon	353003
Tissue Culture Dish 3.5 cm	Falcon	353001
Tubes 50 mL	Falcon	352070