長期培養のためのヒト心筋組織の作製

要約

我々は、ヒト心室心筋組織の エクスビボ 培養のためのプロトコールを提示する。これは、収縮力および動態の詳細な分析、ならびに インビボ 生理学的環境をより密接に模倣するための前負荷および後負荷の適用を可能にする。

要約

心筋細胞培養は、2次元(2D)細胞培養からiPSC由来オルガノイドまで、膨大な数の開発を見てきました。2019年には、心筋収縮のインビボ状態に近づきながら、ヒト心臓サンプルから得られた心筋スライスを培養するエクスビボ方法が実証されました。これらのサンプルは、主に心臓移植または左心室補助装置の配置に由来する。ビブラトームと特別に開発された栽培システムを使用して、固定ワイヤとスプリングワイヤの間に厚さ300μmのスライスを配置し、数週間安定して再現可能な栽培を可能にします。栽培中、スライスは個々の設定に従って連続的に刺激される。収縮はリアルタイムで表示および記録することができ、薬理学的薬剤を容易に適用することができる。ユーザー定義の刺激プロトコルをスケジュールして実行し、一時停止後増強、刺激閾値、力と周波数の関係、耐火期間などの重要な収縮パラメータを評価することができます。さらに、このシステムは、より生理学的な培養のための可変のプリロードおよびアフターロード設定を可能にする。

ここでは、市販の生体模倣培養溶液を用いて、ヒト左心室心筋スライスの長期培養を成功させる方法に関するステップバイステップガイドを提示する。

概要

過去10年間で、心筋細胞のインビトロ培養は、2Dおよび三次元(3D)技術から、オルガノイドおよび心筋細胞に分化した誘導多能性幹細胞の使用に至るまで、大きな進歩を遂げた^1,2,3。エクスビボおよび初代細胞培養は、特に遺伝学的研究および創薬のために、大きな価値があることが示されている^4,5,6。ヒト組織を使用すると、結果の翻訳価値が向上します。しかし、無傷の形状を有する心筋組織の長期3D培養は十分に確立されていない。インタクトな幾何学的形状は、適切な心機能、異なる細胞間のコミュニケーション、ならびに細胞 - マトリックス相互作用が前提条件であるため、in vivo状態を模倣するための重要な特徴である。心筋組織培養は、発達の様々な段階を経た。エクスビボ心筋組織培養の成功率および安定性は、当初はかなり低かったが、最近のアプローチは有望な結果⁷、⁸、⁹

プロトコル

ここに記載されている実験のための組織コレクションは、ミュンヘン大学およびルール大学ボーフムの治験審査委員会によって承認されました。研究はヘルシンキ宣言ガイドラインに従って実施された。患者は、組織採取前に書面によるインフォームドコンセントを与えた。

1. 組織取得

1. 心臓移植または心臓手術を受けている患者からヒト組織を得る。
2. 組織を調達する前に、2Lの心筋麻痺溶液(さらにスライスバッファー(表1)と呼ばれる)を調製する。
3. 4cm×4cmサイズの経壁左心室(LV)生検を得た後、直ちに(切除後5分以内に)約70mLの冷(4°C)スライスバッファーを含む閉鎖可能なプラスチック製の使い捨て滅菌ビーカーに組織を置く。4°Cに保ちます。
   メモ:このプロトコルで使用されるスライスバッファーは、組織の冷蔵保存(4°C)を最大36時間可能にします。これにより、実験室の近くにない診療所からの組織の冷たい輸送が可能になります。しかし、24時間≤輸送時間が最適であることが証明されています。

2.アガロースとビブラトームの準備

1. 十分な栽培室が準備され、滅菌されていることを確認してください(図1A....

結果

心筋スライスの収縮は、培養チャンバを対応するコネクタに挿入した後、コンピュータ画面に表示された(図3)。ヒト心筋切片の収縮は、刺激直後に開始された。スライスは5〜10分間過収縮した。これは、損傷組織画分の強直拘縮によって引き起こされる拡張期力の増加として見られた。このプロセスは、1〜1.5時間以内に様々な程度に戻された。安定化後、ヒトLV組織ス?.......

ディスカッション

過去には、心臓血管研究は心筋細胞の培養において大きな進歩を遂げました。しかし、無傷の幾何学的形状を有する心筋細胞の3D培養はまだ十分に確立されていない。心筋組織の エクス ビボ培養に適用された以前のプロトコルと比較して、ここで説明したプロトコルは、組織の インビボ 環境により密接に似ている。さらに、前負荷および後負荷の適用は、より生体模倣的な環?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agarose Low melting point	Roth	6351.2
Bay-K8644	Cayman Chemical	19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)	Sigma	B0753-1kg
CaCl2*H2O	Merck	2382.1
Calciseptine	Alomone Labs	SPC-500
Glucose*H2O	AppliChem	A3730.0500
H2O	BBraun	3703452
HEPES	AppliChem	A1069.0500
Histoacryl	BBraun	1050052
Isopropanol 100%	SAV LP GmbH	UN1219
ITS-X-supplement	Gibco	5150056
KCl	Merck	1.04933.0500
Medium 199	Gibco	31150-022
MgCl2*6H2O	AppliChem	A1036.0500
NaCl	Sigma	S5886-1KG
NaH2PO4*H2O	Merck	1.06346.0500
Nifedipine	Sigma	N7634-1G
Penicillin / streptomycin x100	Sigma	P0781-100ML
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinet	Thermo Scientific	KS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM	BBraun		In-house made combination of cooling and heating solution.
Incubator	Binder	CB240
MyoDish bioreactor system	InVitroSys GmbH	MyoDish 1	Myodish cultute system
Vibratome	Leica	VT1200s
Water bath 37 degrees	Haake	SWB25
Water bath 80 degrees	Daglef Patz KG	7070
Materials
100 mL plastic single-use beaker	Sarstedt	75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick Release	Millipore	S2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20G	BBraun	4665791
Plastic triangles			In-house made
Razor Derby premium	Derby Tokai	B072HJCFK6
Razor Gillette Silver Blue	Gillette	7393560010170
Scalpel disposable	Feather	02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit	BBraun	309110
Tissue Culture Dish 10 cm	Falcon	353003
Tissue Culture Dish 3.5 cm	Falcon	353001
Tubes 50 mL	Falcon	352070