長期培養のためのヒト心筋組織の作製

要約

我々は、ヒト心室心筋組織の エクスビボ 培養のためのプロトコールを提示する。これは、収縮力および動態の詳細な分析、ならびに インビボ 生理学的環境をより密接に模倣するための前負荷および後負荷の適用を可能にする。

要約

心筋細胞培養は、2次元(2D)細胞培養からiPSC由来オルガノイドまで、膨大な数の開発を見てきました。2019年には、心筋収縮のインビボ状態に近づきながら、ヒト心臓サンプルから得られた心筋スライスを培養するエクスビボ方法が実証されました。これらのサンプルは、主に心臓移植または左心室補助装置の配置に由来する。ビブラトームと特別に開発された栽培システムを使用して、固定ワイヤとスプリングワイヤの間に厚さ300μmのスライスを配置し、数週間安定して再現可能な栽培を可能にします。栽培中、スライスは個々の設定に従って連続的に刺激される。収縮はリアルタイムで表示および記録することができ、薬理学的薬剤を容易に適用することができる。ユーザー定義の刺激プロトコルをスケジュールして実行し、一時停止後増強、刺激閾値、力と周波数の関係、耐火期間などの重要な収縮パラメータを評価することができます。さらに、このシステムは、より生理学的な培養のための可変のプリロードおよびアフターロード設定を可能にする。

ここでは、市販の生体模倣培養溶液を用いて、ヒト左心室心筋スライスの長期培養を成功させる方法に関するステップバイステップガイドを提示する。

概要

過去10年間で、心筋細胞のインビトロ培養は、2Dおよび三次元(3D)技術から、オルガノイドおよび心筋細胞に分化した誘導多能性幹細胞の使用に至るまで、大きな進歩を遂げた^1,2,3。エクスビボおよび初代細胞培養は、特に遺伝学的研究および創薬のために、大きな価値があることが示されている^4,5,6。ヒト組織を使用すると、結果の翻訳価値が向上します。しかし、無傷の形状を有する心筋組織の長期3D培養は十分に確立されていない。インタクトな幾何学的形状は、適切な心機能、異なる細胞間のコミュニケーション、ならびに細胞 - マトリックス相互作用が前提条件であるため、in vivo状態を模倣するための重要な特徴である。心筋組織培養は、発達の様々な段階を経た。エクスビボ心筋組織培養の成功率および安定性は、当初はかなり低かったが、最近のアプローチは有望な結果⁷、⁸、^9、10、11をもたらしている。

その中で、Fischerらは、ヒト心筋組織の生存率および収縮性能が、エキソビボ細胞培養において何週間も維持され得ることを最初に実証した⁷。彼らの技術は、外植されたヒト心筋から切断された薄い組織スライスに基づいており、それらは、定義された生体力学的条件および連続的な電気刺激を提供する新しく開発された培養チャンバーに取り付けられた。この培養方法は、心筋組織のin vivo機能によく似ており、いくつかの独立した研究グループ2、¹²、13、^14、15によって再現されている。重要なことに、Fischerらが使用したチャンバーは、最大4ヶ月間、発達した力の継続的な登録を可能にし、したがって、無傷のヒト心筋に関する生理学的および薬理学的研究のための前例のない機会を開いた⁷。

同様の技術を他のグループによって独立して開発し、ヒト、ラット、ブタ、およびウサギ心筋に適用した^7、10、11。Pitoulisらはその後、収縮サイクル中の法線力-長さ関係を再現するより生理学的方法を開発したが、ハイスループット解析には適していない¹⁶。このように、生物模倣体培養の一般的なアプローチは、動物実験の還元、改良、および置換(3R)へのさらなるステップと見なすことができる。

ただし、この可能性を活用するには、標準化された手順、高コンテンツ分析、および高スループットレベルが必要です。我々は、市販されている生体模倣体培養システムにおいて、生きたヒト心筋の自動スライスと in vitro 維持を組み合わせた技術を提示する( 材料表参照)。提案されたアプローチでは、単一の経壁心筋標本から生成することができる個々のスライスの数は、処理時間によってのみ制限される。十分なサイズと品質(3 cm x 3 cm)の標本は、多くの場合、自動ビブラトームで便利に切断される20〜40の組織スライスを生成します。これらのスライスは、システムに属する培養チャンバに入れることができる。チャンバは、チャンバ内のスプリングワイヤを使用して、変調可能なパラメータ(すなわち、パルス持続時間、極性、レート、および電流)ならびに前負荷および後負荷の調整が可能な電気刺激を可能にする。各スライスの収縮は、ばね線に取り付けられた小さな磁石の動きから登録され、解釈可能なグラフとして表示されます。データはいつでも記録でき、自由に利用できるソフトウェアを使用して分析することができます。一定のベースラインペーシングとは別に、スケジュールされたプロトコルを実行して、それらの耐火性期間、刺激閾値、一時停止後増強、および力 - 周波数の関係を機能的に評価することができる。

個々の心臓から複数の心筋スライスを培養するこの長期の生体模倣体は、ヒトおよび動物組織の両方における将来のエクスビボ研究への道を開き、心血管内科における治療的および心毒性薬物効果のスクリーニングを容易にする。既に様々な実験的アプローチ2^、12、^13、15に適用されている。ここでは、ヒト組織の調製について詳細に段階的に説明し、頻繁に遭遇する培養上の問題に対する解決策を提供する。

プロトコル

ここに記載されている実験のための組織コレクションは、ミュンヘン大学およびルール大学ボーフムの治験審査委員会によって承認されました。研究はヘルシンキ宣言ガイドラインに従って実施された。患者は、組織採取前に書面によるインフォームドコンセントを与えた。

1. 組織取得

1. 心臓移植または心臓手術を受けている患者からヒト組織を得る。
2. 組織を調達する前に、2Lの心筋麻痺溶液(さらにスライスバッファー(表1)と呼ばれる)を調製する。
3. 4cm×4cmサイズの経壁左心室(LV)生検を得た後、直ちに(切除後5分以内に)約70mLの冷(4°C)スライスバッファーを含む閉鎖可能なプラスチック製の使い捨て滅菌ビーカーに組織を置く。4°Cに保ちます。
   メモ:このプロトコルで使用されるスライスバッファーは、組織の冷蔵保存(4°C)を最大36時間可能にします。これにより、実験室の近くにない診療所からの組織の冷たい輸送が可能になります。しかし、24時間≤輸送時間が最適であることが証明されています。

2.アガロースとビブラトームの準備

1. 十分な栽培室が準備され、滅菌されていることを確認してください(図1A)。
   1. チャンバーとグラファイト電極を10%イソプロパノール溶液1Lに沈め、一晩攪拌する。翌日、チャンバーを100%イソプロパノール溶液に3分間移し、グラファイト電極を120°Cで10分間オートクレーブした。
   2. チャンバーとグラファイト電極を層流フードの下で風乾させます。
   3. ロッカーの使用可能な位置に従って、回路基板を各チャンバーに取り付けます。メーカーの説明書に従って、2つのグラファイト電極を回路基板に配置します。
   4. 汚染を防ぐために、チャンバーの上に35 mmのペトリ皿の蓋を置きます。
2. システムをコンピュータに接続して、37°Cおよび5%_CO2のインキュベーター内にMyodish培養システム(材料表を参照)をセットアップします(図1B)。
3. スライスバッファー中で4%低融点アガロースを調製する(グルコースなし; 表2)。アガロースは4°Cで6ヶ月間保存することができる。
   1. 実験当日、80°Cに設定したウォーターバスを用いて原液量のアガロース溶液を融解した。 量にもよりますが、融解には約30分かかります。
   2. アガロースが液体の場合は、8 mLの液体アガロースを10 mLのシリンジに吸い込み、さらに2 mLの空気を入れます。シリンジを滅菌キャップで閉じ、37°Cの水浴中に20分間逆さまに置き、アガロースが固化するのを防ぎ、サンプルの温熱損傷を防ぐためにその温度を平衡化します。
4. 存在する場合は、組織スライスの少なくとも30分前にビブラトームの水冷装置をオンにして、十分な冷却能力を可能にする。水循環の温度を4°Cに設定した。
   メモ:ここで使用した切断トレイと冷却プレートには、どちらも水循環が組み込まれていました。これは、冷却し、汚染リスクを低減するために強く推奨されます。しかし、冷却技術として氷を使用することも可能である。また、プロトコルのこの時点で、水冷装置をビブラトームの切断トレイおよび/または冷却プレートに接続する必要はありません。
5. ビブラトームのスライストレイとサンプルプレートを洗浄するには、すべての表面を100%イソプロパノールで少なくとも3分間洗い流します。
   メモ:使用するビブラトームシステムによっては、ビブラトームのセットアップが異なる場合があります。セットアップおよびブレード校正方法の詳細については、実験室に存在するビブラトームのマニュアルを参照してください。
6. 切断トレイをスライスバッファで最大90%〜95%満たします。現在使用されているセットアップでは、これは約400mLに相当します。水冷装置のチューブをビブラトームの切断トレイと冷却プレートのバルブに接続します。
7. 100%イソプロパノール溶液に5秒間浸して、調製に必要なすべてのツールを消毒します。イソプロパノール溶液から工具を取り外し、層流フードの下で風乾します。

3. サンプルのトリミングと埋め込み

1. 組織サンプルをコールドスライスバッファーで満たされた100 mmペトリ皿に移します。皿を冷却プレートの上で4°Cに保ちます(クーラーに接続するか、氷の上に置きます)。
2. ピンセットで心内膜を保持し、はさみを使用して心内膜組織を約3mm切り取ることによって心内膜線維柱帯を除去する。同様に、心外膜の下にある過剰な脂肪組織がある場合は取り除きます。
3. 切断した組織サンプルを、心内膜側を上にして、正方形の位置に固定された4本の0.9 mm x 70 mm 20 G針(0.9 cm x 0.9 cm; 図1C、D)。各針先の対角線の端が内側を向いていることを確認します。これは固定を強化し、心筋の損傷を防ぎます。
   警告: 上記の正方形の向きは、予想される優勢なミオファイバー方向と直交している必要があります。
4. メスを使用して4本の針の正方形の外側にある余分な組織をすべて切り取ります。元のサンプルのサイズが許す場合は、同じ生サンプルからのこの調製中に2つの心筋組織サンプルを使用します。
5. ピンセットを使用して、トリミングしたサンプルを滅菌組織の上に置き、サンプルに残っている余分なスライスバッファーを除去します。サンプルの乾燥を防ぐため、サンプルを組織上に 10 秒以上保持しないでください。
6. サンプルを35 mmのシャーレに入れ、ブレードが心筋細胞の位置合わせに垂直に切り込み、心外膜が下を向くようにします。試料作製に2つのサンプルが含まれている場合は、サンプルが中央に配置され、互いに接触していないことを確認してください。
7. ウォーターバスからアガロースシリンジを取り出し、サンプルをアガロースに浸します。(図2A)。アガロースを冷却プレート上で5分間固化させます。サンプルはペトリ皿と接触したままでなければならず、切断面が優勢な心筋線維方向に平行になるようにします。
   警告: 気泡を防ぐため、シリンジを完全に空にしないでください。サンプルの浸漬中にシリンジに残るアガロースの量に注意してください。サンプルを含む皿に気泡がある場合は、気泡を慎重にシリンジに戻します。

4. サンプルを切断トレイに置く

1. サンプルを含む固化したアガロースをヘラまたは同様のツールを使用して35 mmのシャーレから取り出し、サンプルとシャーレの側面の間に挟み込みます。サンプルを覆ったままメスを使ってアガロースの一部を切り取ります。
   警告:アガロースをあまり取り除かないでください。X / Z平面の長辺と短辺に少なくとも5mmのアガロースが残っているはずです。
   メモ: 手順 4.2 ~ 4.4 は、すばやく連続して実行する必要があります (つまり、最大 5 秒)。開始する前に、必要なすべてのツールを手の届くところに保管してください。配置後にサンプルを再配置することはできません。空気や湿気への接着剤の暴露を制限するようにしてください。空気や液体と接触すると接着剤が固まり、使用できなくなります。
2. ピペットを使用して、切断プラットフォームの中央とその周囲に60μLの接着剤を配置して分配します。
3. ピンセットを用いて、アガロースに含まれる試料の心外膜側を接着領域の上に置きます。位置を変更しないでください。サンプルの心内膜側はアガロースで見えなければなりません。接着剤を1分間固めます。サンプルを含むアガロースを鈍い工具(ピンセットなど)で上から静かに押しながら、アガロースへの切断や損傷を防ぎます。
4. サンプルプラットフォームを、スライスバッファーで満たされたビブラトームの切断トレイ内の指定された位置に置きます。

5. ビブラトームの開始

1. 振動振幅を 1 mm、初期切削速度を 0.07 mm/s に設定します。スライスの厚さを300μmに設定してスライスを切断します。
2. ブレードがアガロースのみを切断する限り、切断速度を最大(この場合は1.50mm/s)まで上げます。ビブラトームが組織を切断し始めたらすぐに、速度を直ちに0.07mm/sに下げてください。
   メモ:サンプル中に大きな線維性領域がある場合など、組織がスムーズにスライスされない場合は、切断振幅を最大1.5mmまで増やし、切断速度を0.04mm/sに下げると役立ちます。

6.スライス手順中の培地およびインキュベーターの準備

1. 各培養チャンバを2.4 mLの完全な培養培地で満たします(表3)。
2. 培地を充填した培養チャンバーを培養系上に置き、37°C、5%_{CO2、21%O2、湿度}80%に設定したインキュベーター内に置いた。培地を少なくとも20分間平衡化する。
3. 栽培システムをコンピュータに接続し、対応するソフトウェアプログラムを起動します。
4. ロッカー速度を60rpmに設定し、刺激パラメータ(刺激パルスと周波数)をプリセットします。ヒト心臓スライスの場合、標準刺激を、3 msの正電流、1 msの一時停止、および3 msの反転電流パルスからなる50 mA電流の二相性インパルスに設定し、ペーシングレートは30 mb/min(BPM)です。
   注:よく保存された組織では、標準的な刺激閾値は約15mAです。信頼性の高い刺激を確保し、刺激閾値の可能な増加を考慮するために、電流を刺激閾値を2〜3倍超える値に設定することが推奨される。
5. ソフトウェアの電極インジケータをチェックして、栽培チャンバの電極が正しく機能していることを確認します。
   注:栽培ソフトウェアのチャンネルインジケータが赤に変わるたびにアクションが必要です。この場合、バイポーラパルス電荷はバランスが取れていません。

7. スライスの準備

注:初期の心内膜下スライスは、一般に組織培養には適しておらず、不均一な形態のために廃棄する必要がある。最初の5〜10スライスの後、スライスの質感と形態が改善されます。理想的なスライスは、少なくとも1 cm x 1 cmであり、線維性パッチがないか、または制限されているだけで、断片化されておらず、均質な繊維配向を有する(図2B、D)。間質性線維症は、筋細胞線維の間に位置し、しばしば障害のあるヒト心筋に存在する。驚くべきことに、これは栽培の成功の否定的な予測因子ではありません。

1. スライスが乾燥しないように、5cmのペトリ皿の蓋に十分な量のコールドスライスバッファーを注ぎます。コールドスライスバッファーを入れたシャーレの蓋にスライスを置きます。
2. ピンセットを使用して組織からアガロースを分離します。組織に触れないようにしてください。組織に損傷を与えると培養の成功率が低下するため、組織を慎重に取り扱います。
3. 光源に対する綿密な検査によって心筋線維の方向を決定する。これは、ステップ7.6でプラスチック三角形を組織に取り付けるときに重要です。
   メモ: 手順 7.4 および 7.5 は、5 秒以内にすばやく連続して実行する必要があります。
4. 栽培チャンバ内の組織を固定するために、接着剤を使用してサンプルに2つのプラスチック三角形を取り付けます。
   1. 滅菌ペトリ皿の蓋に1μLの接着剤を置きます。フックピンセットを使用して、オートクレーブ処理されたプラスチック製の三角形の1つを拾います。三角形の前端を接着剤に素早く浸し、三角形を心筋細胞の位置合わせに垂直にサンプルに貼り付けます。もう一方の三角形についても同じ手順を繰り返します。
5. 三角形の幅を超える組織をメスで切り取ります(図2C)。2つの三角形が取り付けられたスライスを切断トレイのスライスバッファに戻します。
   注: 栽培チャンバーを満たすのに十分なスライスが準備されるまで、手順 7.2 ~ 7.5 を繰り返します。収縮の悪いスライスを置き換えることができるように、いくつかの追加のスライスを準備することをお勧めします。

8. スライスのマウント

注:後荷重は、栽培チャンバ内のスプリングワイヤーの剛性によって決定されます。スプリングワイヤーの太さに基づいて、3つの異なるタイプが利用可能です。

1. インキュベーターから培地充填培養室を取り出す。準備したスライスの1つを選択し、各ピンに1つの三角形を接続してチャンバに挿入します。
2. サンプルサイズに応じて取り付けピン間の距離を調整します。サンプルが培地に浸されていることを確認してください。チャンバーをインキュベーター内の栽培システムの指定されたソケットに戻します。
   警告: ティッシュを伸ばしすぎたり、スプリングワイヤーを曲げすぎたりしないでください。
3. 皿をロッカーに置いた後のプリロード張力を設定します。
   1. 調整ネジを反時計回りに回して予荷重を下げます。コンピュータ画面上の対応するグラフのベースラインがもう変更されなくなるまで、これを行います。
   2. 調整ネジを時計回りに回して、予荷重を慎重に増やします(つまり、張力を上げます)。剛性が最も高いチャンバの場合、グラフ内の対応するベースラインが 1000 ~ 1200 単位増加し、1 mN の予荷重に相当します。
      注:正確な調整は、栽培チャンバの個々のばね定数に依存し、製造元の指示に従って実験前の較正によって決定することができます。記録ソフトウェアにより、個々のチャンバ校正を考慮することができ、力がμNで均一に表示されるようになります。栽培開始時から電気刺激を加えることをお勧めします。そのため、プリロード調整中にスライスが収縮し始める可能性は十分にあります。この場合、拡張期ベースラインに着目して予負荷を評価します。

9. メディアの変更

1. 表3の処方に従って栽培培地を調製した。培地を使用する直前に、50 μLのβ-メルカプトエタノール(50 mM)を50 mLチューブに加えます。4°Cで保存する。
2. 2日に1回、栽培培地を一部交換する。心筋スライスの長期培養が望まれる場合は、2日ごとに培地をリフレッシュする。
3. 新鮮な培地を37°Cのウォーターバスまたは熱風インキュベーターで30〜45分間予備温める。培養槽から培養室を取り出し、層流フードの下に置きます。
   警告: 低温による過度な拘縮を防ぐために、チャンバーと培地を 37 °C (> 35 °C) で暖かく保つことが不可欠です。あまり明確な損傷は、培地交換後数時間以内に拡張期緊張の増加として存在し得る。これは回復しているように見えるかもしれませんが、ストレスが繰り返されると劣化が蓄積する可能性があります。
4. 培養チャンバから培地を取り出し、チャンバ内に約0.8 mLを残す。同じチャンバーに1.6 mLの新鮮な培地を加える。培地の総容量は、チャンバーあたり約2.4mLでなければならない。
5. チャンバーのカバーを背面に置き、栽培チャンバーをそれぞれの位置に戻します。

結果

心筋スライスの収縮は、培養チャンバを対応するコネクタに挿入した後、コンピュータ画面に表示された(図3)。ヒト心筋切片の収縮は、刺激直後に開始された。スライスは5〜10分間過収縮した。これは、損傷組織画分の強直拘縮によって引き起こされる拡張期力の増加として見られた。このプロセスは、1〜1.5時間以内に様々な程度に戻された。安定化後、ヒトLV組織ス?...

ディスカッション

過去には、心臓血管研究は心筋細胞の培養において大きな進歩を遂げました。しかし、無傷の幾何学的形状を有する心筋細胞の3D培養はまだ十分に確立されていない。心筋組織の エクス ビボ培養に適用された以前のプロトコルと比較して、ここで説明したプロトコルは、組織の インビボ 環境により密接に似ている。さらに、前負荷および後負荷の適用は、より生体模倣的な環?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agarose Low melting point	Roth	6351.2
Bay-K8644	Cayman Chemical	19988
BDM (2,3-Butanedione monoxime)	Sigma	B0753-1kg
CaCl2*H2O	Merck	2382.1
Calciseptine	Alomone Labs	SPC-500
Glucose*H2O	AppliChem	A3730.0500
H2O	BBraun	3703452
HEPES	AppliChem	A1069.0500
Histoacryl	BBraun	1050052
Isopropanol 100%	SAV LP GmbH	UN1219
ITS-X-supplement	Gibco	5150056
KCl	Merck	1.04933.0500
Medium 199	Gibco	31150-022
MgCl2*6H2O	AppliChem	A1036.0500
NaCl	Sigma	S5886-1KG
NaH2PO4*H2O	Merck	1.06346.0500
Nifedipine	Sigma	N7634-1G
Penicillin / streptomycin x100	Sigma	P0781-100ML
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108.0100
Laboratory equipment
Flow cabinet	Thermo Scientific	KS15
Frigomix waterpump and cooling + BBraun Thermomix BM	BBraun		In-house made combination of cooling and heating solution.
Incubator	Binder	CB240
MyoDish culture system	InVitroSys GmbH	MyoDish 1	Myodish cultute system
Vibratome	Leica	VT1200s
Water bath 37 degrees	Haake	SWB25
Water bath 80 degrees	Daglef Patz KG	7070
Materials
100 mL plastic single-use beaker	Sarstedt	75.562.105
Filtration unit, Steritop Quick Release	Millipore	S2GPT05RE
Needles 0.9 x 70 mm 20G	BBraun	4665791
Plastic triangles			In-house made
Razor Derby premium	Derby Tokai	B072HJCFK6
Razor Gillette Silver Blue	Gillette	7393560010170
Scalpel disposable	Feather	02.001.30.020
Syringe 10 mL Luer tip BD Discardit	BBraun	309110
Tissue Culture Dish 10 cm	Falcon	353003
Tissue Culture Dish 3.5 cm	Falcon	353001
Tubes 50 mL	Falcon	352070