JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوصف هنا بروتوكول البروتينات التوأم للجسيمات العصبية الليزوزومية لتوصيف البيئة المكروية الليزوزومية الديناميكية في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. يمكن قياس بروتينات الغشاء الليزوزومي والبروتينات التي تتفاعل مع الليزوزومات (بشكل ثابت أو عابر) بدقة في هذه الطريقة بدقة مكانية ممتازة داخل الخلايا في الخلايا العصبية البشرية الحية.

Abstract

تتواصل الليزوزومات في كثير من الأحيان مع مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية لتحقيق التدهور والوظائف الخلوية المتنوعة الأخرى. تعد الجسيمات الحالة ضرورية لوظيفة الدماغ البشري؛ حيث تكون الخلايا العصبية بعد الانقسام وتعتمد بشكل كبير على مسار الالتهام الذاتي والليزوزوم للحفاظ على الاتزان الخلوي. على الرغم من التقدم في فهم وظائف الليزوزومات المختلفة ، فإن التقاط الاتصالات الديناميكية للغاية بين الجسيمات الحالة والمكونات الخلوية الأخرى يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما بطريقة عالية الإنتاجية. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل لطريقة وسم القرب من الليزوزومات الداخلية (الضربة القاضية) المنشورة مؤخرا في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSC).

يمكن تحديد كل من بروتينات الغشاء الليزوزومي والبروتينات المحيطة بالليزوزومات داخل دائرة نصف قطرها 10-20 نانومتر بثقة وقياسها بدقة في الخلايا العصبية البشرية الحية. يتم وصف كل خطوة من خطوات البروتوكول بالتفصيل ، أي ثقافة الخلايا العصبية hiPSC ، ووضع العلامات على القرب ، وحصاد الخلايا العصبية ، والفحص المجهري الفلوري ، وإثراء البروتين البيوتيني ، وهضم البروتين ، وتحليل LC-MS ، وتحليل البيانات. باختصار ، توفر طريقة البروتينات الفريدة لوضع العلامات على القرب من الليزوزومات الداخلية أداة تحليلية عالية الإنتاجية وقوية لدراسة الأنشطة الليزوزومية الديناميكية للغاية في الخلايا العصبية البشرية الحية.

Introduction

الجسيمات الحالة هي عضيات تقويضية تحلل الجزيئات الكبيرة عبر مسار الالتهام الذاتي الليزوزومي1. إلى جانب التدهور ، تشارك الليزوزومات في وظائف خلوية متنوعة مثل نقل الإشارات واستشعار المغذيات والإفراز2،3،4. تورطت الاضطرابات في وظيفة الليزوزومات في اضطرابات التخزين الليزوزومية والسرطان والشيخوخة والتنكس العصبي3،5،6،7. بالنسبة للخلايا العصبية بعد الانقسام وشديدة الاستقطاب ، تلعب الليزوزومات أدوارا مهمة في الاتزان الخلوي العصبي ، وإطلاق الناقل العصبي ، والنقل لمسافات طويلة على طول المحاور8،9،10،11. ومع ذلك ، فإن التحقيق في الجسيمات الحالة في الخلايا العصبية البشرية كان مهمة صعبة. مكنت التطورات الحديثة في تقنيات الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) من زراعة الخلايا العصبية البشرية الحية التي لم يكن من الممكن الوصول إليها في السابق ، مما أدى إلى سد الفجوة بين النماذج الحيوانية والمرضى من البشر لدراسة الدماغ البشري12,13. على وجه الخصوص ، تدمج تقنية i3Neuron المتقدمة بثبات عامل النسخ neurogenin-2 في جينوم iPSC تحت مروج محفز للدوكسيسيكلين ، مما يدفع iPSCs إلى التمايز إلى خلايا عصبية قشرية نقية في أسبوعين14,15.

نظرا للنشاط الليزوزومي الديناميكي للغاية ، فإن التقاط التفاعلات الليزوزومية مع المكونات الخلوية الأخرى يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما بطريقة عالية الإنتاجية. تقنية وضع العلامات عن قرب مناسبة تماما لدراسة هذه التفاعلات الديناميكية نظرا لقدرتها على التقاط تفاعلات البروتين المستقرة والعابرة / الضعيفة مع خصوصية مكانية استثنائية16,17. يمكن دمج البيروكسيديز المهندسون أو البيوتين ليجاز وراثيا مع بروتين الطعم. عند التنشيط ، يتم إنتاج جذور البيوتين عالية التفاعل لتسمية البروتينات المجاورة تساهميا ، والتي يمكن بعد ذلك تخصيبها بالخرز المطلي بالستربتافيدين للبروتينات من أسفل إلى أعلى عبر منصات قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS)17،18،19،20،21.

تم مؤخرا تطوير طريقة البروتينات لوضع العلامات على القرب من الليزوزومات الذاتية لالتقاط البيئة المكروية الليزوزومية الديناميكية في i3Neurons22. تم ضرب بيروكسيديز الأسكوربات الهندسي (APEX2) على المحطة C لبروتين الغشاء المرتبط بالليزوزومات 1 (LAMP1) في iPSCs ، والتي يمكن بعد ذلك تمييزها إلى خلايا عصبية قشرية. LAMP1 هو بروتين غشاء ليزوزومي وفير وعلامة ليزوزومية كلاسيكية23. يتم التعبير عن LAMP1 أيضا في الإندوسومات المتأخرة ، والتي تنضج إلى الليزوزومات. يشار إلى كل من هذه الليزوزومات اللينزوزومية المتأخرة والليزوزومات غير المتدهورة باسم الليزوزومات في هذا البروتوكول. يمكن لمسبار LAMP1-APEX الداخلي ، الذي يتم التعبير عنه على المستوى الفسيولوجي ، أن يقلل من سوء تحديد موقع LAMP1 والتحف المفرطة في التعبير. يمكن تحديد المئات من بروتينات الغشاء الليزوزومي والمتفاعلات الليزوزومية وقياسها بدقة مكانية ممتازة في الخلايا العصبية البشرية الحية.

هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لبروتينات وسم القرب من الليزوزوم في الخلايا العصبية المشتقة من iPSC البشرية مع مزيد من التحسينات من الطريقة22 المنشورة مؤخرا. يوضح الشكل 1 سير العمل العام. يتضمن البروتوكول زراعة الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC ، وتنشيط وضع العلامات عن قرب في الخلايا العصبية ، والتحقق من نشاط APEX عن طريق الفحص المجهري الفلوري ، وتحديد نسبة البروتين المثلى من حبات الستربتافيدين إلى المدخلات ، وإثراء البروتينات البيوتينيل ، وهضم البروتين على الخرز ، وتحلية الببتيد وتحديدها ، وتحليل LC-MS ، وتحليل بيانات البروتينات. تتم أيضا مناقشة إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسينات التجريبية لتحسين مراقبة جودة وأداء وضع العلامات القريبة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة السلامة البيولوجية والأخلاقيات بجامعة جورج واشنطن. يتم توفير تركيبات الوسائط والمخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول في الجدول 1. يتم توفير معلومات المنتج التجاري المستخدمة هنا في جدول المواد.

1. ثقافة الخلايا العصبية البشرية المشتقة من iPSC

  1. ثقافة iPSC البشرية وتكامل مسبار LAMP1-APEX (7 أيام)
    1. قم بإذابة محلول تخزين Matrigel في دلو ثلج عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، وحاصل 500 ميكرولتر من المحلول في أنابيب معقمة باردة ، وتخزين القسمة عند -80 درجة مئوية. قم بإعداد 50 مل من محلول الطلاء بإضافة 500 ميكرولتر من مخزون Matrigel إلى 49.5 مل من وسط DMEM / F12 البارد.
      ملاحظة: حافظ على برودة Matrigel واستخدم أنابيب مخروطية مبردة مسبقا وأطراف ماصة لمنع البلمرة. يمكن تخزين محلول الطلاء عند 4 °C لمدة 2 أسابيع.
    2. قم بتغطية طبق زراعة الخلايا 10 سم بمحلول طلاء 4 مل لمدة 1 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن يكون Vitronectin محلول طلاء بديل بتركيز 5 ميكروغرام / مل وطلاء 2 ساعة لثقافة iPSC. Vitronectin (مكون بروتين واحد) أغلى من Matrigel ولكن لديه اختلافات أقل في الدفعات وإشارات خلفية أنظف من Matrigel ، الذي يتم استخراجه من ورم الفأر مع العديد من بروتينات المصفوفة خارج الخلية. هناك حاجة إلى لوحة زراعة الأنسجة غير المعالجة لطلاء الفيترونيكتين. يعمل طلاء Matrigel لكل من ألواح زراعة الأنسجة المعالجة وغير المعالجة.
    3. ذوبان الجليد ولوحة 1-3 مليون hiPSCs على كل طبق مغلف 10 سم محمل مسبقا ب 8 مل من الوسط الأساسي E8 الكامل المكمل بمثبط ROCK (التركيز النهائي 10 ميكرومتر Y-27632 أو 50 نانومتر كرومان 1).
      ملاحظة: إضافة مثبط ROCK (Y-27632 أو Chroman1) إلى وسط زراعة الخلايا الجذعية يقلل من موت الخلايا المبرمج الناجم عن التفكك بعد الانقسام والحفظ المبرد. لقد ثبت مؤخرا أن Chroman1 أكثر فعالية من Y-27632 في تثبيط كل من ROCK1 و ROCK224.
    4. قم بالتغيير إلى 10 مل من الوسط الكامل E8 بدون مثبط ROCK بعد أن تشكل iPSCs مستعمرات ، عادة بعد 1-2 أيام. حافظ على ثقافة iPSC في الوسط الكامل E8 واستبدل المادة الطافية بوسط جديد كل يوم.
    5. دمج إنزيم وضع العلامات عن قرب ، بيروكسيديز الأسكوربات المصمم هندسيا (APEX2) ، في النهاية C لجين LAMP1 الداخلي بواسطة هندسة جينوم كريسبر. للحصول على خطوات مفصلة لإنشاء خط خلية مستقر هندسيا ، راجع الطريقة المنشورة مسبقا (Frankenfield et al). 22.
  2. تمايز الخلايا العصبية iPSC البشرية (3 أيام)
    1. قم بتغطية طبق زراعة الخلايا 10 سم طوال الليل ب 4 مل من محلول طلاء Matrigel في حاضنة 37 درجة مئوية قبل التمايز.
    2. الحفاظ على hiPSCs حتى ~ 70 ٪ التقاء. اغسل hiPSCs برفق باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 2x لإزالة الخلايا الميتة. نضح PBS وإضافة 3 مل من Accutase إلى طبق 10 سم من الخلايا. رج الطبق للتوزيع المتساوي واحتضانه لمدة 8 دقائق في حاضنة 37 درجة مئوية.
    3. أضف 2 مل من PBS لغسل الخلايا ورفعها من اللوحة وجمع كل محلول الخلية في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. حبيبات الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة 5 دقائق. لوحة 2-4 × 106 hiPSCs على لوحة مغلفة Matrigel محملة مسبقا ب 8 مل من وسط تحريض الخلايا العصبية الدافئة (الجدول 1). وزعي الخلايا بالتساوي وضعيها في حاضنة 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يتم تمايز الخلايا العصبية بواسطة عامل النسخ المستحث للدوكسيسيكلين ، neurogenin-2 (NGN2) ، والذي تم التعبير عنه بشكل مفرط في خط خلية hiPSCالمستقر 15.
    4. اغسل hiPSCs برفق باستخدام برنامج تلفزيوني في اليوم 1 من التمايز لإزالة حطام الخلايا الميتة. استبدل ب 10 مل من وسط الحث الدافئ بدون مثبط ROCK.
    5. قم بالتغيير باستخدام وسط الحث الدافئ بدون مثبط ROCK كل يوم حتى اليوم 3 من التمايز.
      ملاحظة: الخلايا العصبية جاهزة لإعادة الطلاء في وسط الخلايا العصبية.
  3. تصفيح الخلايا العصبية والحفاظ على ثقافة الخلايا العصبية (10 أيام)
    1. تحضير محلول طلاء بولي-إل-أورنيثين (PLO) 0.1 ملغم/مل في محلول بورات (الجدول 1).
    2. قم بتغطية طبق زراعة الخلايا بمحلول طلاء PLO في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو طوال الليل قبل يوم الطلاء 3 الخلايا العصبية. اغسل الطبق ب 4 مل من الماء المعقم ثلاث مرات واتركه يجف في الهواء تماما داخل خزانة السلامة الحيوية.
    3. افصل الخلايا العصبية في اليوم الثالث من كل طبق طوله 10 سم مع 3 مل من Accutase وطبق 8-10 ملايين خلية على كل طبق مغلف ب PLO مقاس 10 سم محمل مسبقا بوسط عصبي قشري دافئ (الجدول 1).
    4. قم بإجراء تغيير نصف متوسط كل 2-3 أيام باستخدام وسط الخلايا العصبية الدافئ حتى تصل الخلايا العصبية3إلى مرحلة النضج في غضون أسبوعين بعد التمايز.

2. وضع العلامات على القرب في الموقع وتحلل الخلايا العصبية (2 ساعة)

  1. تحضير 500 مليمول من محلول مخزون البيوتين الفينول (BP) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وتخزينه في -20 درجة مئوية. في يوم وضع العلامات على القرب ، قم بتخفيف محلول مخزون BP بوسط عصبي دافئ وعالج الخلايا العصبية بتركيز نهائي يبلغ 500 ميكرومتر لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يضاف الدوكسيسيكلين في وسط الخلايا العصبية ، والذي سينشط تعبير إنزيم APEX. يجب إضافة دوكسيكلين قبل 24 ساعة على الأقل من تجربة وضع العلامات على القرب.
  2. ابدأ تفاعل وضع العلامات بإضافة H 2 O2 بتركيزنهائي قدره 1 mM في مزرعة الخلايا العصبية واحتضانها لمدة دقيقة واحدة بالضبط. استنشاق الوسط على الفور وشطفه 3 مرات باستخدام العازلة إخماد (الجدول 1).
    ملاحظة: يجب أن يكونمحلول H 2 O2 طازجا قبل تفاعل وضع العلامات. يجب أن يكونتنشيط H 2 O 2 دقيقة واحدة بالضبط لتقليل التباين التجريبي وتقليل الإجهاد التأكسدي الناجم عن علاج H 2 O 2 لفترات طويلة.
  3. قم بإمالة اللوحة لشفط كل المخزن المؤقت المتبقي. أضف مخزن تحلل الخلايا الباردة (الجدول 1) مباشرة على لوحة الخلايا العصبية. استخدم 100 ميكرولتر من محلول تحلل الخلايا لكل 1 مليون خلية عصبية. حرك اللوح للحصول على تحلل كاف للخلايا وضعه على الثلج.
  4. كشط الخلية المحللة في أنابيب باردة 1.5 مل. سونيك في حمام ماء مثلج باستخدام سونيكاتور الحمام (>100 واط) لمدة 15 دقيقة مع تناوب 40 ثانية ، 20 ثانية من الدورات.
    ملاحظة: يجب أن يكون محلول البروتين المتحلل بدرجة كافية صافيا بدون كريات أو فقاعات مفرطة. يعد الصوتنة الكافية لتحلل الخلية أمرا بالغ الأهمية لقص الأحماض النووية وتقليل الالتصاق في محللة الخلية لتقليل الارتباط غير المحدد في إجراءات المصب. يمكن أيضا استخدام صوتي المسبار لتوفير تحلل خلايا أقوى وأسرع ، ولكن غسل المسبار بين العينات مطلوب لتقليل التلوث المتبادل وفقدان العينة.
  5. أضف الأسيتون البارد (-20 درجة مئوية) إلى العينة بحجم 4 أضعاف من محلول التحلل. دوامة لفترة وجيزة واحتضان في -20 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
  6. جهاز طرد مركزي عند 16500 × جم لمدة 10 دقائق عند 2 درجة مئوية. إزالة الطافت دون إزعاج بيليه البروتين. اغسل الحبيبات ب 1 مل من الأسيتون 2x -20 درجة مئوية وقم بإزالة المادة الطافية بعد الطرد المركزي.
  7. تجفيف بيليه البروتين مع مكثف فراغ لمدة 1 دقيقة. أضف محلول تحلل الخلية لإذابة الحبيبات تماما. سونيك لفترة وجيزة إذا لزم الأمر. قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن يزيل ترسيب الأسيتون بقايا البيوتين الفينول في العينة ، والتي يمكن أن تتداخل مع إثراء المصب للبروتينات البيوتينيل.

3. الفحص المجهري الفلوري للتحقق من توطين APEX ونشاطه (1.5 يوم)

  1. احتضان الخلايا العصبية i3التي تعبر عن LAMP1-APEX الذاتية مع 500 ميكرومتر BP لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. قم بتنشيط الملصقات باستخدام علاج 1 mM H 2 O2لمدة 1 ثانية فقط للحد من انتشار سحابة البيوتين.
  2. إصلاح الخلايا على الفور مع 4 ٪ بارافورمالدهيد في العازلة إخماد وغسل بلطف 3x مع PBS.
    ملاحظة: بالنسبة لطبق 10 سم ، هناك حاجة إلى 4-6 مل لغسل كاف.
  3. قم بحظر الخلايا واختراقها باستخدام مصل حمار 3٪ وسابونين 0.1٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. احتضان الخلايا بالجسم المضاد الأولي المضاد ل LAMP1 (الفأر أحادي النسيلة H3A4 ، 1: 1000) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  5. اغسل الخلايا العصبية 3 × بلطف باستخدام برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا العصبية بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر AF561 (1: 1000) و Streptavidin-680 (1: 1000) لمدة ساعة واحدة في RT.
  6. اغسل 2x باستخدام PBS واحتضن باستخدام علامة نووية Hoechst أو 4'،4-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لمدة 10 دقائق في RT. شطف الخلايا 2x مع PBS.
  7. تصور الخلايا العصبية الثابتة تحت المجهر مضان. راقب البروتينات البيوتينية الملطخة بالستربتافيدين والموضعية مع تلطيخ LAMP1 خارج النواة للتحقق من الموقع الصحيح لنشاط APEX.

4. تحديد نسبة بروتين حبات الستربتافيدين إلى المدخلات (1.5 يوم)

  1. إجراء فحص البروتين المتوافق مع المنظفات (DCA) لتحديد تركيزات البروتين الكلية في محللات الخلايا
    1. قم بإذابة معيار بروتين ألبومين مصل الأبقار (BSA) في محلول تحلل الخلية بتركيز 4 مجم / مل. تحضير سلسلة من المحاليل القياسية لبروتين BSA (0.2-2 مجم / مل ، 5 تخفيفات) باستخدام محلول تحلل الخلية.
    2. انقل 5 ميكرولتر من كل عينة بروتين ، ومحلول بروتين BSA القياسي ، ومخزن تحلل الخلية الفارغ في ثلاث نسخ إلى كل بئر في لوحة 96 بئر.
    3. أضف 2 ميكرولتر من الكاشف S لكل 1 مل من الكاشف A للحصول على الكاشف A'. أضف 25 ميكرولتر من الكاشف A إلى كل بئر. أضف 200 ميكرولتر من الكاشف B إلى كل بئر. امزج الفقاعات وفرقعها إذا كانت موجودة.
    4. احتضان تلك اللوحة المكونة من 96 بئرا في RT لمدة 15 دقيقة ، وقراءة الامتصاص عند 750 نانومتر في قارئ الصفائح الدقيقة ، وتحديد تركيزات عينات البروتين بناء على منحنى BSA القياسي.
  2. مقايسة المعايرة بالتحليل الحجمي بالتحليل الحجمي (1.5 يوم)
    1. نقل سلسلة من ملاط حبات الستربتافيدين المغناطيسية (20 ميكرولتر ، 15 ميكرولتر ، 12 ميكرولتر ، 10 ميكرولتر ، 8 ميكرولتر ، 4 ميكرولتر ، 1 ميكرولتر ، 0 ميكرولتر) إلى أنابيب شريط PCR. ضع أنابيب شريط PCR على رف مغناطيسي ، واغسل الخرز 3x مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت SDS بنسبة 2٪ ، وقم بإزالة المخزن المؤقت للغسيل تماما أثناء وجوده على الرف المغناطيسي.
    2. أضف 50 ميكروغرام من عينة البروتين إلى كل أنبوب. أضف المزيد من محلول التحلل إلى الحجم الكلي 80 ميكرولتر. أغلق كل أنبوب بإحكام وقم بتدويره عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    3. أجهزة الطرد المركزي أنابيب شريط PCR لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي دقيق على الطاولة. ضع أنابيب شريط PCR على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة. ضع 2 ميكرولتر من المادة الطافية من كل أنبوب على غشاء نيتروسليلوز جاف واترك الغشاء يجف تماما.
      ملاحظة: إذا كانت شدة الإشارة منخفضة ، فيمكن رصد أكثر من 2 ميكرولتر على الغشاء. يمكن زيادة الحجم عن طريق اكتشاف عدة مرات في نفس المكان بعد تجفيف الغشاء بالهواء بين كل مرة. يمكن أيضا استخدام جهاز Bio-Dot.
    4. احتضان الغشاء في حجب العازلة (TBS) لمدة 1 ساعة. احتضان الغشاء في Streptavidin Alexa Fluor 680 مترافق (1: 1000 في مانع العازلة) لمدة ساعة واحدة. ثم اغسل الغشاء باستخدام TBS-T (الجدول 1) 5x.
      ملاحظة: بديل لمقايسة اللطخة النقطية هو النشاف الغربي باستخدام جسم مضاد للستربتافيدين.
    5. قم بقياس إشارة الفلورسنت لكل نقطة على الغشاء تحت الطول الموجي 680 نانومتر ، وقم بإنشاء مخطط مبعثر مع إشارة الفلورسنت على حجم الخرز. حدد الحجم الأمثل للخرزات اللازمة ل 50 ميكروغرام من عينة البروتين المدخلات بناء على المكان الذي ينتهي فيه الاضمحلال الأسي للمنحنى.
      ملاحظة: تمثل شدة التألق وفرة البروتينات البيوتينيل في المادة الطافية ، والتي يجب أن تنخفض مع زيادة كميات الخرز.

5. إثراء البروتينات الحيوية وهضم الخرز (3 أيام)

  1. نقل عينات تحلل البروتين من -80 °C وسونيكات العينات في أنابيب 1.5 مل لمدة 30 ثانية في سونيكاتور الحمام لإذابة المحاليل بسرعة. دوامة ووضع أنابيب العينة على الجليد.
  2. نقل 250 ميكرولتر من ملاط الخرز المغناطيسي ستربتافيدين (SA) إلى كل أنبوب 1.5 مل. ضع الأنابيب على رف مغناطيسي ، واغسل الخرز 3x مع 1 مل من Wash Buffer A (2٪ SDS) ، وقم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي.
  3. بناء على نتائج مقايسة اللطخة النقطية ومقايسة بروتين DC ، احسب كمية عينة البروتين (ميكروغرام) اللازمة ل 250 ميكرولتر من ملاط حبات الستربتافيدين المغناطيسية.
    ملاحظة: في مسبار LAMP1-APEX المعبر عنه داخليا ، هناك حاجة إلى 5 ميكرولتر من الخرز مقابل 50 ميكروغرام من بروتين الإدخال. لذلك ، يضاف 2.5 ملغ من البروتين الكلي إلى 250 ميكرولتر من الخرز. يمكن استخدام أقل من 250 ميكرولتر من خرز SA لمواد عينة إدخال محدودة.
  4. أضف محلول تحلل الخلية إلى الأنبوب الذي يحتوي على خليط محللة الخرزة المغناطيسية إلى حجم إجمالي قدره 1 مل وقم بتدويره عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: يجب تطبيع العينات من مجموعات مختلفة أو مكررات إلى نفس تركيز البروتين وحجمه وكمية الخرز لتقليل الاختلافات التجريبية.
  5. قم بتدوير جميع الأنابيب لفترة وجيزة على جهاز طرد مركزي دقيق على سطح الطاولة وضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية أثناء وجودها على الرف المغناطيسي.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان الانتظار لمدة 1 دقيقة بعد وضع أنابيب العينة على الرف المغناطيسي في كل مرة. يمكن أن يقلل هذا من فقدان الخرزة بسبب الكمية الصغيرة غير المرئية من الخرز التي لا تزال تتحرك نحو المغناطيس في المحلول.
  6. اغسل الخرز 2x مع 1 مل من Wash Buffer A عند RT (5 دقائق دوران في كل مرة). كرر العملية مع كل محلول غسيل 2x بالتتابع عند 4 درجات مئوية. (المخزن المؤقت B و Buffer C و Buffer D ؛ الجدول 1).
    ملاحظة: يمكن أن يترسب تركيز عال من محلول SDS في درجات الحرارة الباردة. يجب إجراء الغسيل الأول في RT.
  7. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي. اغسل الخرز 2x باستخدام Buffer D لإزالة المنظفات المتبقية تماما. أعد تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من محلول Tris سعة 50 مللي متر وأضف 5 مللي مول TCEP (التركيز النهائي) لاحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في خلاط يتم التحكم في درجة حرارته ، مع الاهتزاز عند 1200 دورة في الدقيقة.
  8. أضف 15 مللي مول يودوأسيتاميد (إندول حمض الأسيتيك ، التركيز النهائي) إلى كل أنبوب واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في خلاط يتم التحكم في درجة حرارته ، مع الاهتزاز عند 1200 دورة في الدقيقة في الظلام (غطاء الخلاط قيد التشغيل).
    ملاحظة: إندول حمض الأسيتيك حساس للضوء ويجب أن يكون طازجا قبل 5 دقائق من هذه الخطوة.
  9. أضف 5 mM TCEP (التركيز النهائي) لإخماد إندول حمض الأسيتيك الزائد. احتضن لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في خلاط يمكن التحكم في درجة حرارته مع الاهتزاز عند 1200 دورة في الدقيقة (غطاء الخلاط مغلق).
  10. أجهزة الطرد المركزي أنابيب العينة لفترة وجيزة ووضعها على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة لإزالة المادة الطافية. أضف 200 ميكرولتر من 5 mM TCEP في مخزن مؤقت Tris 50 mM لإعادة تعليق الخرزات. أضف 1 ميكروغرام من مزيج Trypsin / Lys-C إلى العينة ، واحتضانها لمدة 14 ساعة عند 37 درجة مئوية في خلاط يتم التحكم في درجة حرارته ، مع رجه عند 1200 دورة في الدقيقة.
  11. أضف 0.2 ميكروغرام إضافية من مزيج Trypsin / Lys-C وهضمه لمدة 3 ساعات.
  12. قم بتدوير أنابيب العينة لفترة وجيزة ووضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة 1 دقيقة. انقل طافت الببتيد لتنظيف الأنابيب أثناء وجوده على رف مغناطيسي. اغسل الخرز ب 50 ميكرولتر من محلول Tris سعة 50 مللي متر (يهتز لمدة 5 دقائق) ويمزج المواد الطافية الببتيدية.
  13. أضف 30 ميكرولتر من 10٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) إلى الأنبوب الذي يحتوي على طاف الببتيد للحصول على درجة الحموضة <3.

6. تحلية الببتيد والتجزئة (2 ساعة)

  1. بلل لوحة استخراج الطور الصلب ذات الطور العكسي (فقط الآبار للاستخدام) ب 200 ميكرولتر من الميثانول بدرجة HPLC (MeOH) 3x على مشعب الفراغ. أضف 200 ميكرولتر من 1٪ TFA في الماء بدرجة HPLC 3x لموازنة اللوحة.
  2. قم بتحميل عينات الببتيد في اللوحة ، وقم بتشغيل الفراغ ببطء للحصول على سرعة تدفق أقل من 3 قطرات / ثانية لتقليل فقد العينة.
  3. اغسل لوحة الاستخراج 3x ب 200 ميكرولتر من 1٪ TFA. اغسل لوحة الاستخراج مرة أخرى ب 200 ميكرولتر من 1٪ TFA تحتوي على 2٪ MeOH (v / v). حافظ على سرعة التدفق أقل من 3 قطرات / ثانية.
  4. استبدل لوحة التجميع بلوحة تجميع من 96 بئرا. إذا لم تكن هناك حاجة إلى تجزئة ، فقم بتخفيف عينات الببتيد 3x مع 100 ميكرولتر من 1٪ TFA تحتوي على 80٪ MeOH وادمجها في أنبوب عينة جديد. جفف عينات الببتيد في مكثف فراغ بدون حرارة.
    ملاحظة: إذا كانت التجزئة مطلوبة ، يمكن استخلاص عينات الببتيد إلى 4 أجزاء لاحقا باستخدام 200 ميكرولتر من 1٪ TFA تحتوي على 15٪ و 35٪ و 50٪ و 90٪ MeOH ، على التوالي ، في لوحة تجميع مختلفة.

7. مقايسة قياس كمية الببتيد اللوني (اختياري) (1 ساعة)

  1. أعد تعليق عينات الببتيد في 50 ميكرولتر من الماء بدرجة LC-MS وخذ 20 ميكرولتر من القسمة لإجراء فحص الببتيد.
    ملاحظة: تستهلك هذه الخطوة كمية كبيرة من عينة الببتيد ولكن يمكن أن توفر تقديرا دقيقا لتركيز الببتيد قبل تحليل LC-MS. يتم إجراء هذا عادة مرة واحدة فقط لكل نوع عينة للاختبار قبل إعداد العينة على نطاق واسع.
  2. قم بإعداد التخفيفات التسلسلية لمحاليل الببتيد القياسية (المتوفرة في مجموعة الفحص اللوني) في الماء بدرجة LC-MS. قم بإعداد كاشف العمل عن طريق خلط 50٪ كاشف A و 48٪ كاشف B و 2٪ كاشف C.
  3. انقل 20 ميكرولتر من كل محلول قياسي ببتيدي (ثلاث نسخ متماثلة) وعينة الببتيد غير المعروفة إلى صفيحة مجهرية ذات 96 بئرا. أضف 180 ميكرولتر من كاشف العمل إلى كل بئر ، واخلطه جيدا ، واحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في RT.
  4. اقرأ الامتصاص عند 480 نانومتر في قارئ الصفيحة الدقيقة وحدد تركيزات عينات الببتيد بناء على منحنى الببتيد القياسي.

8. تحليل LC-MS

  1. أعد تعليق عينات الببتيد في LC Buffer A (2٪ أسيتونيتريل و 0.1٪ حمض الفورميك ، درجة LC-MS). جهاز طرد مركزي عند 16500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للتخلص من أي جسيمات محتملة.
  2. انقل المادة الطافية إلى قوارير LC-MS. تحليل العينات باستخدام أداة nanoLC-MS.
    ملاحظة: تعتمد معلمات LC-MS/MS التفصيلية على الأداة وقد تم وصفها سابقا22،25،26.
  3. إنشاء قائمة استبعاد LC-MS مخصصة مع مجموعة من أوقات الاحتفاظ لقمم الببتيد الملوثة عالية الوفرة مثل الستربتافيدين والتربسين بدقة كتلة 5 جزء في المليون 22 (على سبيل المثال ، قمم ببتيد الستربتافيدين الشائعة هي m / z 402.5435 [الشحنة 3] ، m / z 603.3117 [الشحنة 2] ، m / z 654.9733 [الشحنة 3] ، m / z 678.6812 [الشحنة 3] ، m / z 1017.5182 [الشحنة 2] ، الخ.; قمم ببتيد التربسين الشائعة هي M / Z 421.7584 [الشحنة 2] ، M / Z 523.2855 [الشحنة 2] ، و m / z 737.7062 [الشحنة 3]).

9. تحليل بيانات البروتينات

  1. قم بتحليل البيانات الأولية LC-MS باستخدام برنامج تحليل بيانات البروتينات مثل Proteome Discoverer أو MaxQuant27 أو MS-Fragger28. تضمين مكتبتين FASTA لتحليل البيانات: 1) قاعدة بيانات مرجعية Swissprot Homo Sapiens ؛ 2) مكتبة FASTA العالمية للملوثات التي تم إنشاؤها حديثا (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib) ، والتي ثبت أنها تحسن تحديد البروتينات وتقلل من الاكتشافات الخاطئة29.
  2. قم بإعداد معلمات تحليل بيانات البروتينات مع قطع معدل اكتشاف خاطئ بنسبة 1٪ (FDR) لتحديد مطابقة طيف البروتين والببتيد (PSM). حدد هضم التربسين بحد أقصى ثلاثة انشقاقات مفقودة ، وتعديل ثابت لكارباميدوميثيل السيستين ، وتعديل متغير لأكسدة الميثيونين وأستلة البروتين N-terminal. استخدم شدة ذروة الببتيد MS1 للقياس الكمي الخالي من الملصقات. تطبيع شدة الببتيد إلى الكربوكسيلاز البيوتينيل الداخلي ، كربوكسيلاز البروبيونيل-CoA (PCCA) ، لتقليل اختلافات وضع العلامات القريبة ، كما هو موضح سابقا22.
    ملاحظة: يمكن تحديد تطبيع PCCA في برنامج Proteome Discoverer عن طريق تضمين ملف FASTA تسلسل بروتين PCCA. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء تطبيع PCCA في تحليل البيانات النهائية.
  3. تصدير نتائج مستوى البروتين من برنامج البروتينات. إزالة البروتينات الملوثة قبل التحليل الإحصائي29. إزالة البروتينات مع 1 PSM فقط أو بدون نتيجة الكمية. إجراء تحليل مصطلح أنطولوجيا الجينات البروتينية (GO) باستخدام Enrichr30 وتحليل شبكة البروتين باستخدام STRING31.

النتائج

أجريت دراسة البروتينات ذات العلامات المقربة من الليزوزوم هذه في الخلايا العصبية البشرية المشتقة من iPSC لالتقاط البيئة المكروية الليزوزومية الديناميكية في الموقع في الخلايا العصبية الحية. يوضح الشكل 2 أ مورفولوجيا الخلايا ل hiPSCs والخلايا العصبية المشتقة من hiPSC في نقاط ...

Discussion

باستخدام مسبار LAMP1-APEX هذا ، يتم إثراء البروتينات الموجودة على الغشاء الليزوزومي وبالقرب منه. بالنظر إلى قطر الليزوزوم النموذجي من 100-1200 نانومتر ، توفر هذه الطريقة دقة ممتازة داخل الخلايا مع نصف قطر وضع العلامات 10-20 نانومتر. LAMP1 هو بروتين غشاء ليزوزومي وفير وعلامة كلاسيكية للليزوزومات ، ويع?...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

هذه الدراسة مدعومة بمنحة المعاهد الوطنية للصحة (R01NS121608). تعترف AMF بمنحة ARCS-Metro Washington Chapter الدراسية وزمالة Bourbon F. Scribner Endowment. نشكر مختبر مايكل وارد في المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) على دعم البيولوجيا الجزيئية وتطوير تقنية i3Neuron.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% (w/v) Saponin solutionAcros Organics419231000Flourescent Microscopy
AccutaseLife TechnologiesA1110501cell detachment solution, Cell Culture
B27 SupplementFisher Scientific17504044Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNFPeproTech450-02Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acidSigma-AldrichB6768Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA8806To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal mediumSTEMCELL Technologies5790Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561Thermo Fisher Scientific505-0452-82Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitorTocris716310Cell Culture
cOmplete mini Protease InhibitorRoche4693123001cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit IIBio-Rad5000112To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11320082Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPESThermo Fisher Scientific11330057Cell Culture, Induction Medium
Donkey serumSigma-AldrichD9663Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC)Sigma-AldrichD9891-1GCell Culture, Induction Medium
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kitWatersWAT097944For Peptide desalting
Formic Acid (FA)Fisher ScientificA11750For LC-MS analysis
GDNFPeproTech450-10Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dyeThermo Fisher Scientific62239Flourescent Microscopy
HPLC grade methanolFisher ScientificA452For Peptide desalting
HPLC grade waterFisher ScientificW5For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cellsCorriell InstituteGM25256Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.Thermo Fisher ScientificAA33323ADProximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA)Millipore SigmaI6125For Protein Digestion
LamininFisher Scientific23017015Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade AcetonitrileFisher ScientificA955For LC-MS analysis
LC-MS grade waterFisher ScientificW64For LC-MS analysis
L-glutamineFisher Scientific25-030-081Cell Culture, Induction Medium
MatrigelThermo Fisher Scientific08-774-552basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bankh4a3Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x)Fisher Scientific17-502-048Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cmBio-Rad1620145To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA)Fisher Scientific11-140-050Cell Culture, Induction Medium
NT-3PeproTech450-03Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plateWaters186000309For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS)LI-COR Biosciences927-50000To conduct dot blot assay for bead titration
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock)Adipogen41994-02-9Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesiumGibco10010049Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Fisher23275Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO)Millipore SigmaP3655Cell Culture, Dish Coating
Sodium AscorbateSigma-AldrichA4034Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azideSigma-AldrichS8032Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificS271500Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Thermo Fisher ScientificBP1311220Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxideSigma-Aldrich415413Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborateSigma-Aldrich221732Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentratorvacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose BeadsCytiva (formal GE)28-9857-99Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 ConjugateThermo Fisher ScientificS32358To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixertemperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA)Millipore Sigma302031For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Millipore SigmaC4706For Protein Digestion
Tris-HClThermo Fisher ScientificBP152500Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-XThermo Fisher ScientificBP151500Beads wash buffer
TROLOXSigma-Aldrich648471Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5073For Protein Digestion
TWEEN 20Millipore SigmaP1379Dot blot assay buffer
UreaThermo Fisher ScientificBP169500Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
VitronectinSTEMCELL Technologies7180Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitorSelleckS1049Cell Culture

References

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

184 iPSC LAMP1 APEX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved