Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí se describe un protocolo proteómico de etiquetado de proximidad de lisosomas neuronales para caracterizar el microambiente lisosomal dinámico en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Las proteínas de membrana lisosomal y las proteínas que interactúan con los lisosomas (de forma estable o transitoria) se pueden cuantificar con precisión en este método con una excelente resolución espacial intracelular en neuronas humanas vivas.

Resumen

Los lisosomas frecuentemente se comunican con una variedad de biomoléculas para lograr la degradación y otras funciones celulares diversas. Los lisosomas son críticos para la función cerebral humana, ya que las neuronas son postmitóticas y dependen en gran medida de la vía autofagia-lisosoma para mantener la homeostasis celular. A pesar de los avances en la comprensión de varias funciones lisosomales, capturar las comunicaciones altamente dinámicas entre los lisosomas y otros componentes celulares es técnicamente desafiante, particularmente en una forma de alto rendimiento. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para el método proteómico de marcado de proximidad de lisosomas endógeno (knock-in) recientemente publicado en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC).

Tanto las proteínas de la membrana lisosomal como las proteínas que rodean los lisosomas dentro de un radio de 10-20 nm se pueden identificar con confianza y cuantificar con precisión en neuronas humanas vivas. Cada paso del protocolo se describe en detalle, es decir, cultivo de neuronas hiPSC, etiquetado de proximidad, recolección de neuronas, microscopía de fluorescencia, enriquecimiento de proteínas biotiniladas, digestión de proteínas, análisis de LC-MS y análisis de datos. En resumen, este método único de proteómica de etiquetado de proximidad lisosomal endógeno proporciona una herramienta analítica robusta y de alto rendimiento para estudiar las actividades lisosomales altamente dinámicas en neuronas humanas vivas.

Introducción

Los lisosomas son orgánulos catabólicos que degradan macromoléculas a través de la vía lisosomal-autofagia1. Además de la degradación, los lisosomas están involucrados en diversas funciones celulares, como la transducción de señalización, la detección de nutrientes y la secreción 2,3,4. Las perturbaciones en la función lisosomal han sido implicadas en trastornos de almacenamiento lisosomal, cáncer, envejecimiento y neurodegeneración 3,5,6,7. Para las neuronas postmitóticas y altamente polarizadas, los lisosomas juegan un papel crítico en la homeostasis celular neuronal, la liberación de neurotransmisores y el transporte a larga distancia a lo largo de los axones 8,9,10,11. Sin embargo, investigar los lisosomas en las neuronas humanas ha sido una tarea difícil. Los avances recientes en las tecnologías de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han permitido el cultivo de neuronas humanas vivas que antes eran inaccesibles, cerrando la brecha entre los modelos animales y los pacientes humanos para estudiar el cerebro humano12,13. En particular, la avanzada tecnología i3Neuron integra de manera estable el factor de transcripción de neurogenina-2 en el genoma iPSC bajo un promotor inducible por doxiciclina, lo que lleva a las iPSC a diferenciarse en neuronas corticales puras en 2 semanas14,15.

Debido a la actividad lisosomal altamente dinámica, capturar las interacciones lisosomales con otros componentes celulares es técnicamente desafiante, particularmente en una forma de alto rendimiento. La tecnología de etiquetado de proximidad es adecuada para estudiar estas interacciones dinámicas debido a su capacidad para capturar interacciones de proteínas estables y transitorias / débiles con una especificidad espacial excepcional16,17. La peroxidasa modificada o la biotina ligasa pueden fusionarse genéticamente con la proteína del cebo. Tras la activación, se producen radicales de biotina altamente reactivos para marcar covalentemente las proteínas vecinas, que luego pueden enriquecerse con perlas recubiertas de estreptavidina para la proteómica ascendente aguas abajo a través de plataformas de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) 17,18,19,20,21.

Recientemente se desarrolló un método proteómico de marcado de proximidad lisosomal endógeno para capturar el microambiente lisosomal dinámico en i3Neuronas22. La ascorbato peroxidasa diseñada (APEX2) se introdujo en el extremo C de la proteína de membrana asociada lisosomal 1 (LAMP1) en iPSC, que luego se puede diferenciar en neuronas corticales. LAMP1 es una proteína de membrana lisosomal abundante y un marcador lisosomal clásico23. LAMP1 también se expresa en endosomas tardíos, que maduran en lisosomas; Estos endosomas-lisosomas tardíos y lisosomas no degradativos se conocen como lisosomas en este protocolo. Esta sonda endógena LAMP1-APEX, expresada a nivel fisiológico, puede reducir la mala localización de LAMP1 y los artefactos de sobreexpresión. Cientos de proteínas de membrana lisosomal e interactores lisosomales pueden ser identificados y cuantificados con una excelente resolución espacial en neuronas humanas vivas.

Aquí, se describe un protocolo detallado para la proteómica de marcado de proximidad lisosómica en neuronas humanas derivadas de iPSC con mejoras adicionales del método22 recientemente publicado. El flujo de trabajo general se ilustra en la figura 1. El protocolo incluye cultivo de neuronas derivadas de hiPSC, activación de marcado de proximidad en neuronas, validación de la actividad APEX por microscopía de fluorescencia, determinación de una proporción óptima de perlas de estreptavidina a proteína de entrada, enriquecimiento de proteínas biotiniladas, digestión de proteínas en perlas, desalinización y cuantificación de péptidos, análisis LC-MS y análisis de datos proteómicos. También se discuten las pautas de solución de problemas y las optimizaciones experimentales para mejorar el control de calidad y el rendimiento del etiquetado de proximidad.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de bioseguridad y ética de la Universidad George Washington. Las composiciones de medios y búferes utilizados en este protocolo se proporcionan en la Tabla 1. La información comercial del producto utilizada aquí se proporciona en la Tabla de materiales.

1. Cultivo de neuronas derivadas de iPSC humanas

  1. Cultivo iPSC humano e integración de la sonda LAMP1-APEX (7 días)
    1. Descongele la solución madre de Matrigel en una cubitera a 4 °C durante la noche, alícuota 500 μL de la solución en tubos estériles fríos y almacene las alícuotas a -80 °C. Preparar 50 ml de solución de recubrimiento añadiendo 500 μL de la cepa Matrigel en 49,5 ml de medio DMEM/F12 frío.
      NOTA: Mantenga el Matrigel frío y utilice tubos cónicos preenfriados y puntas de pipeta para evitar la polimerización. La solución de recubrimiento se puede almacenar a 4 °C durante 2 semanas.
    2. Cubrir una placa de cultivo celular de 10 cm con 4 ml de solución de recubrimiento durante 1 h en una incubadora a 37 °C.
      NOTA: La vitronectina puede ser una solución de recubrimiento alternativa a una concentración de 5 μg/ml y un recubrimiento de 2 h para cultivo de iPSC. La vitronectina (componente de proteína única) es más cara que Matrigel pero tiene menos variaciones de lote y señales de fondo más limpias que Matrigel, que se extrae del tumor de ratón con numerosas proteínas de matriz extracelular. Se necesita una placa de cultivo de tejidos no tratados para el recubrimiento de vitronectina. El recubrimiento Matrigel funciona tanto para placas de cultivo de tejidos tratados como no tratados.
    3. Descongelar y colocar en placa 1-3 millones de hiPSCs en cada plato recubierto de 10 cm precargado con 8 ml de medio completo Essential E8 suplementado con inhibidor ROCK (concentración final 10 μM Y-27632 o 50 nM Chroman1).
      NOTA: La adición del inhibidor de ROCK (Y-27632 o Chroman1) al medio de cultivo de células madre minimiza la apoptosis inducida por disociación después de la división y la preservación criogénica. Chroman1 ha demostrado recientemente ser más potente que Y-27632 en la inhibición de ROCK1 y ROCK224.
    4. Cambiar a 10 ml de medio completo E8 sin inhibidor de ROCK después de que las iPSC formen colonias, generalmente después de 1-2 días. Mantenga el cultivo iPSC en medio completo E8 y reemplace el sobrenadante con medio fresco cada dos días.
    5. Integrar la enzima de etiquetado de proximidad, ascorbato peroxidasa diseñada (APEX2), en el extremo C del gen endógeno LAMP1 mediante ingeniería genómica CRISPR. Para conocer los pasos detallados para generar una línea celular estable diseñada, consulte el método publicado anteriormente (Frankenfield et al). 22.
  2. Diferenciación iPSC-neurona humana (3 días)
    1. Cubra una placa de cultivo celular de 10 cm durante la noche con 4 ml de solución de recubrimiento Matrigel en una incubadora a 37 °C antes de la diferenciación.
    2. Mantenga las hiPSC hasta ~70% de confluencia. Lave suavemente las hiPSC con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 2x para eliminar las células muertas. Aspirar el PBS y añadir 3 ml de Accutase a la placa de 10 cm de células. Agitar el plato para una distribución uniforme e incubar durante 8 minutos en una incubadora a 37 °C.
    3. Agregue 2 ml de PBS para lavar y levantar las células de la placa y recoja toda la solución celular en un tubo cónico de 15 ml. Granular las células por centrifugación a 300 × g durante 5 min. Placa 2-4 × 106 hiPSCs sobre una placa recubierta de Matrigel precargada con 8 mL de medio de inducción de neuronas calientes (Tabla 1). Distribuir uniformemente las células y colocarlas en una incubadora a 37 °C.
      NOTA: La diferenciación neuronal es impulsada por un factor de transcripción inducible por doxiciclina, neurogenina-2 (NGN2), que se sobreexpresó en esta línea celular hiPSC estable15.
    4. Lave las hiPSC suavemente con PBS el día 1 de diferenciación para eliminar los restos de células muertas. Reemplácese con 10 ml de medio de inducción caliente sin inhibidor de ROCK.
    5. Cambiar con medio de inducción caliente sin inhibidor de ROCK todos los días hasta el día 3 de diferenciación.
      NOTA: Las neuronas están listas para ser convertidas en medio neuronal.
  3. Recubrimiento de neuronas y mantenimiento del cultivo de neuronas (10 días)
    1. Preparar una solución de recubrimiento de 0,1 mg/ml de poli-L-ornitina (PLO) en tampón de borato (Tabla 1).
    2. Cubra una placa de cultivo celular con la solución de recubrimiento de PLO en una incubadora de 37 °C durante al menos 1 h o durante la noche anterior a la colocación de las neuronas del día 3. Lave el plato con 4 ml de agua estéril tres veces y déjelo secar completamente al aire dentro del gabinete de bioseguridad.
    3. Disociar las neuronas del día 3 de cada plato de 10 cm con 3 ml de Accutase y placar 8-10 millones de células en cada plato recubierto con OLP de 10 cm precargado con medio de neurona cortical caliente (Tabla 1).
    4. Realizar un cambio medio-medio cada 2-3 días con medio neuronal caliente hasta que lasi 3neuronas alcancen la maduración en 2 semanas después de la diferenciación.

2. Etiquetado de proximidad in situ y lisis neuronal (2 h)

  1. Preparar una solución madre de biotina-fenol (BP) de 500 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) y almacenar a -20 °C. El día del etiquetado de proximidad, diluir la solución madre de PA con medio neuronal caliente y tratar las neuronas a una concentración final de 500 μM durante 30 min en una incubadora a 37 °C.
    NOTA: La doxiciclina se agrega en el medio neuronal, lo que activará la expresión de la enzima APEX. La doxciclina debe agregarse al menos 24 h antes del experimento de etiquetado de proximidad.
  2. Iniciar la reacción de etiquetado añadiendoH2O2a una concentración final de 1 mM en el cultivo neuronal e incubar durante exactamente 1 min. Aspirar inmediatamente el medio y enjuagar 3 veces con tampón de enfriamiento (Tabla 1).
    NOTA: La solución deH2O2debe hacerse fresca antes de la reacción de etiquetado. La activación deH2O2debe ser exactamente de 1 minuto para reducir la variación experimental y minimizar el estrés oxidativo causado por el tratamiento prolongado conH2O2.
  3. Incline la placa para aspirar todo el tampón residual. Agregue un tampón de lisis de células heladas (Tabla 1) directamente sobre la placa neuronal. Use 100 μL de tampón de lisis celular por 1 millón de neuronas. Agite la placa para obtener suficiente lisis celular y colóquela en hielo.
  4. Raspa los lisados celulares en tubos fríos de 1,5 ml. Sonicar en un baño de agua helada usando un sonicador de baño (>100 W) durante 15 minutos con ciclos alternos de 40 s encendido y apagado de 20 s.
    NOTA: La solución de proteína suficientemente lisada debe ser transparente sin pellets ni burbujas excesivas. La sonicación suficiente del lisado celular es crucial para cortar los ácidos nucleicos y reducir la pegajosidad del lisado celular para reducir la unión no específica en los procedimientos posteriores. También se puede usar un sonicador de sonda para proporcionar una lisis celular más fuerte y rápida, pero se requiere lavar la sonda entre muestras para minimizar la contaminación cruzada y la pérdida de muestras.
  5. Añadir acetona fría (-20 °C) a la muestra a un volumen de tampón de lisis 4 veces mayor. Vórtice brevemente e incubar a −20 °C durante 3 h.
  6. Centrifugadora a 16.500 × g durante 10 min a 2 °C. Retire el sobrenadante sin alterar el pellet de proteína. Lavar el pellet con 1 ml de -20 °C de acetona 2x y retirar el sobrenadante después de la centrifugación.
  7. Secar el pellet de proteína con un concentrador de vacío durante 1 min. Agregue tampón de lisis celular para disolver completamente el pellet. Sonicate brevemente si es necesario. Conservar las muestras a -80 °C.
    NOTA: La precipitación de acetona puede eliminar el residuo de biotina-fenol en la muestra, lo que puede interferir con el enriquecimiento posterior de proteínas biotiniladas.

3. Microscopía de fluorescencia para validar la localización y actividad de APEX (1,5 días)

  1. Incubar las i3neuronas que expresan LAMP1-APEX endógeno con 500 μM BP durante 30 min a 37 °C. Active el etiquetado con tratamiento de 1 mMH2O2durante solo 1 s para limitar la difusión de la nube de biotina.
  2. Fije las células inmediatamente con paraformaldehído al 4% en el tampón de enfriamiento y lave suavemente 3 veces con PBS.
    NOTA: Para un plato de 10 cm, se necesitan 4-6 ml para un lavado suficiente.
  3. Bloquear y permeabilizar las células usando 3% de suero de burro y 0,1% de saponina en PBS durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
  4. Incubar las células con el anticuerpo primario anti-LAMP1 (H3A4 monoclonal de ratón, 1:1.000) durante la noche a 4 °C.
  5. Lave las neuronas 3 veces suavemente con PBS. Incubar las neuronas con anticuerpo secundario anti-ratón AF561 (1:1.000) y Streptavidin-680 (1:1.000) durante 1 h en RT.
  6. Lavar 2x con PBS e incubar con el marcador nuclear Hoechst o 4',4-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min en RT. Enjuague las celdas 2x con PBS.
  7. Visualice las neuronas fijas bajo un microscopio de fluorescencia. Observar proteínas biotiniladas teñidas con estreptavidina y colocalizadas con tinción LAMP1 fuera del núcleo para validar la correcta ubicación de la actividad APEX.

4. Determinación de la relación perlas-proteína de entrada de estreptavidina (1,5 días)

  1. Realizar un ensayo de proteínas compatibles con detergentes (DCA) para determinar las concentraciones totales de proteínas en los lisados celulares
    1. Disuelva el estándar de proteína de albúmina sérica bovina (BSA) en el tampón de lisis celular a una concentración de 4 mg / ml. Preparar una serie de soluciones patrón de proteína BSA (0,2-2 mg/ml, 5 diluciones) utilizando el tampón de lisis celular.
    2. Transfiera 5 μL de cada muestra de proteína, solución estándar de proteína BSA y tampón de lisis de células blancas por triplicado a cada pocillo en una placa de 96 pocillos.
    3. Añadir 2 μL de reactivo S por 1 ml de reactivo A para obtener el reactivo A'. Añadir 25 μL de reactivo A' a cada pocillo. Agregue 200 μL de reactivo B a cada pocillo. Mezcle y haga estallar burbujas si están presentes.
    4. Incubar esa placa de 96 pocillos en RT durante 15 min, leer la absorbancia a 750 nm en un lector de microplacas y cuantificar las concentraciones de muestras de proteínas basadas en la curva estándar BSA.
  2. Ensayo de valoración de perlas de puntos (1,5 días)
    1. Transfiera una serie de perlas magnéticas de estreptavidina (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) a tubos de tira de PCR. Coloque los tubos de tira de PCR en una rejilla magnética, lave las perlas 3 veces con 100 μL de tampón SDS al 2% y retire el tampón de lavado completamente mientras está en la rejilla magnética.
    2. Añadir 50 μg de muestra de proteína a cada tubo. Añadir más tampón de lisis a un volumen total de 80 μL. Cerrar bien cada tubo y girar a 4 °C durante la noche.
    3. Centrifugar brevemente los tubos de tiras de PCR en una microcentrífuga de sobremesa. Coloque los tubos de tira de PCR en un bastidor magnético durante 1 min. Coloque 2 μL de sobrenadante de cada tubo en una membrana seca de nitrocelulosa y permita que la membrana se seque completamente.
      NOTA: Si la intensidad de la señal es baja, se pueden detectar más de 2 μL en la membrana. El volumen se puede aumentar manchando varias veces en el mismo lugar después de que la membrana se seque al aire entre cada vez. También se puede utilizar un aparato Bio-Dot.
    4. Incubar la membrana en tampón de bloqueo (TBS) durante 1 h. Incubar la membrana en Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugado (1:1.000 en tampón de bloqueo) durante 1 h. Luego, lave la membrana con TBS-T (Tabla 1) 5x.
      NOTA: Una alternativa al ensayo dot blot es el western blot usando un anticuerpo estreptavidina.
    5. Mida la señal fluorescente de cada punto en la membrana por debajo de 680 nm de longitud de onda y genere un diagrama de dispersión con señal fluorescente sobre el volumen de las perlas. Seleccione el volumen óptimo de perlas necesarias para 50 μg de muestra de proteína de entrada en función de dónde termina la decaimiento exponencial de la curva.
      NOTA: La intensidad de fluorescencia representa la abundancia de proteínas biotiniladas en el sobrenadante, que debería disminuir con cantidades crecientes de perlas.

5. Enriquecimiento de proteínas biotiniladas y digestión en perlas (3 días)

  1. Transfiera muestras de lisado de proteínas de −80 °C y sonicar las muestras en tubos de 1,5 ml durante 30 s en un sonicador de baño para descongelar rápidamente las soluciones. Vortex y coloque los tubos de muestra en hielo.
  2. Transfiera 250 μL de suspensión de perlas magnéticas de estreptavidina (SA) a cada tubo de 1,5 ml. Coloque los tubos en una rejilla magnética, lave las perlas 3 veces con 1 ml de tampón de lavado A (2% SDS) y retire el tampón residual.
  3. Basándose en los resultados del ensayo de transferencia de puntos y el ensayo de proteína DC, calcule la cantidad de muestra de proteína (μg) necesaria para 250 μL de la suspensión de perlas magnéticas de estreptavidina.
    NOTA: En esta sonda LAMP1-APEX expresada endógenamente, se necesitan 5 μL de perlas para 50 μg de proteína de entrada. Por lo tanto, se agregan 2,5 mg de proteína total a 250 μL de perlas. Se pueden utilizar menos de 250 μL de perlas SA para material de muestra de entrada limitada.
  4. Añadir tampón de lisis celular al tubo que contiene la mezcla magnética de lisado de perlas hasta un volumen total de 1 ml y rotar a 4 °C durante la noche.
    NOTA: Las muestras de diferentes grupos o réplicas deben normalizarse a la misma concentración de proteína, volumen y cantidad de perlas para reducir las variaciones experimentales.
  5. Haga girar todos los tubos brevemente en una microcentrífuga de sobremesa y coloque los tubos en un bastidor magnético durante 1 minuto. Retire el sobrenadante mientras está en la rejilla magnética.
    NOTA: Es fundamental esperar 1 minuto después de colocar los tubos de muestra en el bastidor magnético cada vez. Esto puede minimizar la pérdida de perlas debido a la pequeña cantidad invisible de perlas que aún se mueven hacia el imán en la solución.
  6. Lave las perlas 2 veces con 1 ml de tampón de lavado A a RT (rotación de 5 minutos cada vez). Repita el proceso con cada tampón de lavado 2 veces secuencialmente a 4 °C. (Buffer B, Buffer C y Buffer D; Tabla 1).
    NOTA: Una alta concentración de solución de SDS puede precipitar a temperaturas frías. El primer lavado debe realizarse en RT.
  7. Coloque los tubos en la rejilla magnética. Lave las perlas 2 veces con Buffer D para eliminar completamente el detergente residual. Resuspender las perlas en 100 μL de tampón Tris de 50 mM y añadir 5 mM TCEP (concentración final) para incubar durante 30 min a 37 °C en un mezclador con temperatura controlada, agitando a 1.200 rpm.
  8. Añadir 15 mM de yodoacetamida (IAA, concentración final) a cada tubo e incubar durante 30 min a 37 °C en una batidora con temperatura controlada, agitando a 1.200 rpm en la oscuridad (tapa del mezclador encendida).
    NOTA: IAA es sensible a la luz y debe hacerse fresco 5 minutos antes de este paso.
  9. Agregue 5 mM TCEP (concentración final) para calmar el exceso de IAA. Incubar durante 10 min a 37 °C en una batidora con temperatura controlada agitando a 1.200 rpm (tapa del mezclador apagada).
  10. Centrifugar brevemente los tubos de muestra y colocarlos en una rejilla magnética durante 1 minuto para extraer el sobrenadante. Agregue 200 μL de TCEP de 5 mM en tampón Tris de 50 mM para resuspender las perlas. Añadir 1 μg de mezcla tripsina/Lys-C a la muestra e incubar durante 14 h a 37 °C en una batidora con temperatura controlada, agitando a 1.200 rpm.
  11. Añadir 0,2 μg adicionales de mezcla de tripsina/Lys-C y digerir durante 3 h.
  12. Gire brevemente los tubos de muestra y coloque los tubos en una rejilla magnética durante 1 minuto. Transfiera el sobrenadante peptídico para limpiar los tubos mientras está en una rejilla magnética. Lave las perlas con 50 μL de tampón Tris de 50 mM (agitando durante 5 min) y combine los sobrenadantes peptídicos.
  13. Agregue 30 μL de ácido trifluoroacético (TFA) al 10% al tubo que contiene sobrenadante peptídico para obtener un pH <3.

6. Desalinización y fraccionamiento de péptidos (2 h)

  1. Mojar la placa de extracción en fase sólida de fase inversa (solo los pocillos para su uso) con 200 μL de metanol de grado HPLC (MeOH) 3x en el colector de vacío. Agregue 200 μL de TFA al 1% en agua de grado HPLC 3x para equilibrar la placa.
  2. Cargue las muestras de péptidos en la placa, encendiendo lentamente el vacío para una velocidad de flujo inferior a 3 gotas / s para minimizar la pérdida de muestra.
  3. Lave la placa de extracción 3x con 200 μL de TFA al 1%. Lave de nuevo la placa de extracción con 200 μL de TFA al 1% que contenga 2% de MeOH (v/v). Mantenga la velocidad de flujo inferior a 3 gotas/s.
  4. Reemplace la placa de recolección con una placa de recolección de 96 pocillos. Si no se necesita fraccionamiento, eluir las muestras de péptidos 3x con 100 μL de TFA al 1% que contiene 80% de MeOH y combinar en un nuevo tubo de muestra. Seque las muestras de péptidos en un concentrador de vacío sin calor.
    NOTA: Si se desea el fraccionamiento, las muestras de péptidos se pueden eluir en 4 fracciones posteriormente utilizando 200 μL de TFA al 1% que contiene 15%, 35%, 50% y 90% de MeOH, respectivamente, en una placa de recolección diferente.

7. Ensayo de cuantificación de péptidos colorimétricos (opcional) (1 h)

  1. Resuspender muestras de péptidos en 50 μL de agua de grado LC-MS y tomar 20 μL de alícuotas para realizar el ensayo peptídico.
    NOTA: Este paso consume una gran cantidad de muestra de péptidos, pero puede proporcionar una cuantificación precisa de la concentración de péptidos antes del análisis LC-MS. Por lo general, esto se realiza solo una vez por tipo de muestra para realizar pruebas antes de la preparación de muestras a gran escala.
  2. Preparar diluciones seriadas de las soluciones patrón peptídicas (proporcionadas en el kit de ensayo colorimétrico) en el agua de grado LC-MS. Prepare el reactivo de trabajo mezclando 50% de reactivo A, 48% de reactivo B y 2% de reactivo C.
  3. Transfiera 20 μL de cada solución patrón peptídica (tres réplicas) y la muestra de péptidos desconocidos a una microplaca de 96 pocillos. Agregue 180 μL del reactivo de trabajo a cada pocillo, mezcle bien e incube la placa durante 30 minutos a RT.
  4. Lea la absorbancia a 480 nm en un lector de microplacas y cuantifique las concentraciones de muestras de péptidos en función de la curva estándar del péptido.

8. Análisis LC-MS

  1. Resuspender las muestras de péptidos en LC Buffer A (2% de acetonitrilo y 0,1% de ácido fórmico, grado LC-MS). Centrifugar a 16.500 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar cualquier posible partícula.
  2. Transfiera el sobrenadante a los viales LC-MS. Analizar las muestras utilizando un instrumento nanoLC-MS.
    NOTA: Los parámetros detallados de LC-MS/MS dependen del instrumento y se han descrito anteriormente22,25,26.
  3. Generar una lista de exclusión LC-MS personalizada con un rango de tiempos de retención para picos de péptidos contaminantes altamente abundantes como la estreptavidina y la tripsina con una precisión de masa de 5 ppm 22 (por ejemplo, los picos comunes del péptido de estreptavidina son m/z 402.5435 [carga 3], m/z 603.3117 [carga 2], m/z 654.9733 [carga 3], m/z 678.6812 [carga 3], m/z 1017.5182 [carga 2], etc.; Los picos comunes del péptido de tripsina son M/z 421.7584 [carga 2], m/z 523.2855 [carga 2] y m/z 737.7062 [carga 3]).

9. Análisis de datos proteómicos

  1. Analice los datos sin procesar de LC-MS con software de análisis de datos proteómicos como Proteome Discoverer, MaxQuant27 o MS-Fragger28. Incluir dos bibliotecas FASTA para el análisis de datos: 1) una base de datos de referencia Swissprot Homo Sapiens ; 2) una biblioteca FASTA de contaminantes universales (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib) recién generada, que ha demostrado mejorar la identificación proteómica y disminuir los falsos descubrimientos29.
  2. Configure los parámetros de análisis de datos proteómicos con un límite de tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1% para las identificaciones de coincidencia espectral de proteínas y péptidos (PSM). Seleccione la digestión de tripsina con un máximo de tres divisiones perdidas, una modificación fija de la carbamidometilación de cisteína y una modificación variable de la oxidación de metionina y la acetilación de proteínas N-terminales. Utilice las intensidades máximas del péptido MS1 para la cuantificación sin etiqueta. Normalizar las intensidades peptídicas a la carboxilasa endógenamente biotinilada, propionil-CoA carboxilasa (PCCA), para reducir las variaciones de etiquetado de proximidad, como se describió anteriormente22.
    NOTA: La normalización PCCA se puede seleccionar en el software Proteome Discoverer incluyendo un archivo FASTA de secuencia de proteínas PCCA. Alternativamente, la normalización de PCCA se puede llevar a cabo en el análisis de datos aguas abajo.
  3. Exporte los resultados a nivel de proteína desde el software de proteómica. Eliminar las proteínas contaminantes antes del análisis estadístico29. Eliminar proteínas con solo 1 PSM o sin resultado de cuantificación. Realice análisis a plazo de ontología génica de proteínas (GO) con Enrichr30 y análisis de redes de proteínas con STRING31.

Resultados

Este estudio de proteómica de marcado de proximidad lisosómica se realizó en neuronas humanas derivadas de iPSC para capturar el microambiente lisosomal dinámico in situ en neuronas vivas. Las morfologías celulares de las hiPSC y las neuronas derivadas de hiPSC en diferentes puntos de tiempo se ilustran en la Figura 2A. Las iPSCs humanas crecen en colonias en medio E8. La diferenciación se inicia mediante la colocación de iPSCs en un medio de inducción neuronal que contiene ...

Discusión

Usando esta sonda LAMP1-APEX, las proteínas en y cerca de la membrana lisosomal son biotiniladas y enriquecidas. Dado el diámetro típico del lisosoma de 100-1.200 nm, este método proporciona una excelente resolución intracelular con un radio de etiquetado de 10-20 nm. LAMP1 es una proteína de membrana lisosomal abundante y un marcador clásico para lisosomas, que sirve como una excelente proteína de cebo para el marcado lisosomal APEX a nivel de expresión endógena. Sin embargo, también existen limitaciones cuan...

Divulgaciones

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este estudio cuenta con el apoyo de la subvención de los NIH (R01NS121608). A.M.F. reconoce la beca ARCS-Metro Washington Chapter y la beca Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Agradecemos al laboratorio Michael Ward en el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) por el apoyo en biología molecular y el desarrollo de la tecnología i3Neuron.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
10% (w/v) Saponin solutionAcros Organics419231000Flourescent Microscopy
AccutaseLife TechnologiesA1110501cell detachment solution, Cell Culture
B27 SupplementFisher Scientific17504044Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNFPeproTech450-02Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acidSigma-AldrichB6768Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA8806To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal mediumSTEMCELL Technologies5790Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561Thermo Fisher Scientific505-0452-82Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitorTocris716310Cell Culture
cOmplete mini Protease InhibitorRoche4693123001cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit IIBio-Rad5000112To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11320082Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPESThermo Fisher Scientific11330057Cell Culture, Induction Medium
Donkey serumSigma-AldrichD9663Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC)Sigma-AldrichD9891-1GCell Culture, Induction Medium
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kitWatersWAT097944For Peptide desalting
Formic Acid (FA)Fisher ScientificA11750For LC-MS analysis
GDNFPeproTech450-10Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dyeThermo Fisher Scientific62239Flourescent Microscopy
HPLC grade methanolFisher ScientificA452For Peptide desalting
HPLC grade waterFisher ScientificW5For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cellsCorriell InstituteGM25256Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.Thermo Fisher ScientificAA33323ADProximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA)Millipore SigmaI6125For Protein Digestion
LamininFisher Scientific23017015Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade AcetonitrileFisher ScientificA955For LC-MS analysis
LC-MS grade waterFisher ScientificW64For LC-MS analysis
L-glutamineFisher Scientific25-030-081Cell Culture, Induction Medium
MatrigelThermo Fisher Scientific08-774-552basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bankh4a3Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x)Fisher Scientific17-502-048Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cmBio-Rad1620145To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA)Fisher Scientific11-140-050Cell Culture, Induction Medium
NT-3PeproTech450-03Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plateWaters186000309For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS)LI-COR Biosciences927-50000To conduct dot blot assay for bead titration
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock)Adipogen41994-02-9Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesiumGibco10010049Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Fisher23275Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO)Millipore SigmaP3655Cell Culture, Dish Coating
Sodium AscorbateSigma-AldrichA4034Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azideSigma-AldrichS8032Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificS271500Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Thermo Fisher ScientificBP1311220Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxideSigma-Aldrich415413Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborateSigma-Aldrich221732Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentratorvacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose BeadsCytiva (formal GE)28-9857-99Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 ConjugateThermo Fisher ScientificS32358To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixertemperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA)Millipore Sigma302031For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Millipore SigmaC4706For Protein Digestion
Tris-HClThermo Fisher ScientificBP152500Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-XThermo Fisher ScientificBP151500Beads wash buffer
TROLOXSigma-Aldrich648471Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5073For Protein Digestion
TWEEN 20Millipore SigmaP1379Dot blot assay buffer
UreaThermo Fisher ScientificBP169500Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
VitronectinSTEMCELL Technologies7180Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitorSelleckS1049Cell Culture

Referencias

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

NeurocienciaN mero 184Etiquetado de proximidadlisosomaprote micaneuronas derivadas de iPSCLAMP1APEXinteracci n de prote nasmembrana lisosomal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados