Caracterización del interactoma de lisosoma neuronal con proteómica de etiquetado de proximidad

Resumen

Aquí se describe un protocolo proteómico de etiquetado de proximidad de lisosomas neuronales para caracterizar el microambiente lisosomal dinámico en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Las proteínas de membrana lisosomal y las proteínas que interactúan con los lisosomas (de forma estable o transitoria) se pueden cuantificar con precisión en este método con una excelente resolución espacial intracelular en neuronas humanas vivas.

Resumen

Los lisosomas frecuentemente se comunican con una variedad de biomoléculas para lograr la degradación y otras funciones celulares diversas. Los lisosomas son críticos para la función cerebral humana, ya que las neuronas son postmitóticas y dependen en gran medida de la vía autofagia-lisosoma para mantener la homeostasis celular. A pesar de los avances en la comprensión de varias funciones lisosomales, capturar las comunicaciones altamente dinámicas entre los lisosomas y otros componentes celulares es técnicamente desafiante, particularmente en una forma de alto rendimiento. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para el método proteómico de marcado de proximidad de lisosomas endógeno (knock-in) recientemente publicado en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC).

Tanto las proteínas de la membrana lisosomal como las proteínas que rodean los lisosomas dentro de un radio de 10-20 nm se pueden identificar con confianza y cuantificar con precisión en neuronas humanas vivas. Cada paso del protocolo se describe en detalle, es decir, cultivo de neuronas hiPSC, etiquetado de proximidad, recolección de neuronas, microscopía de fluorescencia, enriquecimiento de proteínas biotiniladas, digestión de proteínas, análisis de LC-MS y análisis de datos. En resumen, este método único de proteómica de etiquetado de proximidad lisosomal endógeno proporciona una herramienta analítica robusta y de alto rendimiento para estudiar las actividades lisosomales altamente dinámicas en neuronas humanas vivas.

Introducción

Los lisosomas son orgánulos catabólicos que degradan macromoléculas a través de la vía lisosomal-autofagia¹. Además de la degradación, los lisosomas están involucrados en diversas funciones celulares, como la transducción de señalización, la detección de nutrientes y la secreción ^2,3,4. Las perturbaciones en la función lisosomal han sido implicadas en trastornos de almacenamiento lisosomal, cáncer, envejecimiento y neurodegeneración 3,5,6,7.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de bioseguridad y ética de la Universidad George Washington. Las composiciones de medios y búferes utilizados en este protocolo se proporcionan en la Tabla 1. La información comercial del producto utilizada aquí se proporciona en la Tabla de materiales.

1. Cultivo de neuronas derivadas de iPSC humanas

1. Cultivo iPSC humano e integración de la sonda LAMP1-APEX (7 días)
   1. Descongele la solución madre de Matrigel en una cubitera a 4 °C durante la noche, alícuota 500 μL de la solución en tubos estériles fríos y almacene las al....

Resultados

Este estudio de proteómica de marcado de proximidad lisosómica se realizó en neuronas humanas derivadas de iPSC para capturar el microambiente lisosomal dinámico in situ en neuronas vivas. Las morfologías celulares de las hiPSC y las neuronas derivadas de hiPSC en diferentes puntos de tiempo se ilustran en la Figura 2A. Las iPSCs humanas crecen en colonias en medio E8. La diferenciación se inicia mediante la colocación de iPSCs en un medio de inducción neuronal que contiene .......

Discusión

Usando esta sonda LAMP1-APEX, las proteínas en y cerca de la membrana lisosomal son biotiniladas y enriquecidas. Dado el diámetro típico del lisosoma de 100-1.200 nm, este método proporciona una excelente resolución intracelular con un radio de etiquetado de 10-20 nm. LAMP1 es una proteína de membrana lisosomal abundante y un marcador clásico para lisosomas, que sirve como una excelente proteína de cebo para el marcado lisosomal APEX a nivel de expresión endógena. Sin embargo, también existen limitaciones cuan.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% (w/v) Saponin solution	Acros Organics	419231000	Flourescent Microscopy
Accutase	Life Technologies	A1110501	cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement	Fisher Scientific	17504044	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF	PeproTech	450-02	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A8806	To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium	STEMCELL Technologies	5790	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561	Thermo Fisher Scientific	505-0452-82	Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor	Tocris	716310	Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor	Roche	4693123001	cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000112	To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium	Thermo Fisher Scientific	11320082	Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330057	Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663	Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit	Waters	WAT097944	For Peptide desalting
Formic Acid (FA)	Fisher Scientific	A11750	For LC-MS analysis
GDNF	PeproTech	450-10	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye	Thermo Fisher Scientific	62239	Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol	Fisher Scientific	A452	For Peptide desalting
HPLC grade water	Fisher Scientific	W5	For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells	Corriell Institute	GM25256	Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.	Thermo Fisher Scientific	AA33323AD	Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA)	Millipore Sigma	I6125	For Protein Digestion
Laminin	Fisher Scientific	23017015	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile	Fisher Scientific	A955	For LC-MS analysis
LC-MS grade water	Fisher Scientific	W64	For LC-MS analysis
L-glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	Cell Culture, Induction Medium
Matrigel	Thermo Fisher Scientific	08-774-552	basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	h4a3	Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x)	Fisher Scientific	17-502-048	Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm	Bio-Rad	1620145	To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA)	Fisher Scientific	11-140-050	Cell Culture, Induction Medium
NT-3	PeproTech	450-03	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate	Waters	186000309	For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS)	LI-COR Biosciences	927-50000	To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock)	Adipogen	41994-02-9	Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium	Gibco	10010049	Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Fisher	23275	Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO)	Millipore Sigma	P3655	Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride	Thermo Fisher Scientific	S271500	Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Thermo Fisher Scientific	BP1311220	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413	Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732	Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator			vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads	Cytiva (formal GE)	28-9857-99	Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	S32358	To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer			temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA)	Millipore Sigma	302031	For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Millipore Sigma	C4706	For Protein Digestion
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	BP152500	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X	Thermo Fisher Scientific	BP151500	Beads wash buffer
TROLOX	Sigma-Aldrich	648471	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade	Promega	V5073	For Protein Digestion
TWEEN 20	Millipore Sigma	P1379	Dot blot assay buffer
Urea	Thermo Fisher Scientific	BP169500	Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin	STEMCELL Technologies	7180	Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor	Selleck	S1049	Cell Culture