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* Estos autores han contribuido por igual
Aquí se describe un protocolo proteómico de etiquetado de proximidad de lisosomas neuronales para caracterizar el microambiente lisosomal dinámico en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Las proteínas de membrana lisosomal y las proteínas que interactúan con los lisosomas (de forma estable o transitoria) se pueden cuantificar con precisión en este método con una excelente resolución espacial intracelular en neuronas humanas vivas.
Los lisosomas frecuentemente se comunican con una variedad de biomoléculas para lograr la degradación y otras funciones celulares diversas. Los lisosomas son críticos para la función cerebral humana, ya que las neuronas son postmitóticas y dependen en gran medida de la vía autofagia-lisosoma para mantener la homeostasis celular. A pesar de los avances en la comprensión de varias funciones lisosomales, capturar las comunicaciones altamente dinámicas entre los lisosomas y otros componentes celulares es técnicamente desafiante, particularmente en una forma de alto rendimiento. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para el método proteómico de marcado de proximidad de lisosomas endógeno (knock-in) recientemente publicado en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC).
Tanto las proteínas de la membrana lisosomal como las proteínas que rodean los lisosomas dentro de un radio de 10-20 nm se pueden identificar con confianza y cuantificar con precisión en neuronas humanas vivas. Cada paso del protocolo se describe en detalle, es decir, cultivo de neuronas hiPSC, etiquetado de proximidad, recolección de neuronas, microscopía de fluorescencia, enriquecimiento de proteínas biotiniladas, digestión de proteínas, análisis de LC-MS y análisis de datos. En resumen, este método único de proteómica de etiquetado de proximidad lisosomal endógeno proporciona una herramienta analítica robusta y de alto rendimiento para estudiar las actividades lisosomales altamente dinámicas en neuronas humanas vivas.
Los lisosomas son orgánulos catabólicos que degradan macromoléculas a través de la vía lisosomal-autofagia1. Además de la degradación, los lisosomas están involucrados en diversas funciones celulares, como la transducción de señalización, la detección de nutrientes y la secreción 2,3,4. Las perturbaciones en la función lisosomal han sido implicadas en trastornos de almacenamiento lisosomal, cáncer, envejecimiento y neurodegeneración 3,5,6,7.
Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de bioseguridad y ética de la Universidad George Washington. Las composiciones de medios y búferes utilizados en este protocolo se proporcionan en la Tabla 1. La información comercial del producto utilizada aquí se proporciona en la Tabla de materiales.
1. Cultivo de neuronas derivadas de iPSC humanas
Este estudio de proteómica de marcado de proximidad lisosómica se realizó en neuronas humanas derivadas de iPSC para capturar el microambiente lisosomal dinámico in situ en neuronas vivas. Las morfologías celulares de las hiPSC y las neuronas derivadas de hiPSC en diferentes puntos de tiempo se ilustran en la Figura 2A. Las iPSCs humanas crecen en colonias en medio E8. La diferenciación se inicia mediante la colocación de iPSCs en un medio de inducción neuronal que contiene .......
Usando esta sonda LAMP1-APEX, las proteínas en y cerca de la membrana lisosomal son biotiniladas y enriquecidas. Dado el diámetro típico del lisosoma de 100-1.200 nm, este método proporciona una excelente resolución intracelular con un radio de etiquetado de 10-20 nm. LAMP1 es una proteína de membrana lisosomal abundante y un marcador clásico para lisosomas, que sirve como una excelente proteína de cebo para el marcado lisosomal APEX a nivel de expresión endógena. Sin embargo, también existen limitaciones cuan.......
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Este estudio cuenta con el apoyo de la subvención de los NIH (R01NS121608). A.M.F. reconoce la beca ARCS-Metro Washington Chapter y la beca Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Agradecemos al laboratorio Michael Ward en el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) por el apoyo en biología molecular y el desarrollo de la tecnología i3Neuron.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
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