JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол протеомики по маркировке близости нейронных лизосом описан здесь для характеристики динамического лизосомального микроокружения в индуцированных человеком плюрипотентных нейронах, полученных из стволовых клеток. Лизосомальные мембранные белки и белки, которые взаимодействуют с лизосомами (стабильно или временно), могут быть точно количественно определены в этом методе с отличным внутриклеточным пространственным разрешением в живых нейронах человека.

Аннотация

Лизосомы часто общаются с различными биомолекулами для достижения деградации и других разнообразных клеточных функций. Лизосомы имеют решающее значение для функции человеческого мозга, поскольку нейроны являются постмитотическими и в значительной степени зависят от аутофагии-лизосомного пути для поддержания клеточного гомеостаза. Несмотря на достижения в понимании различных лизосомальных функций, захват высокодинамических связей между лизосомами и другими клеточными компонентами является технически сложным, особенно с высокой пропускной способностью. Здесь представлен подробный протокол для недавно опубликованного эндогенного (knock-in) лизосомного бесконтактного мечения протеомным методом в нейронах, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC).

Как лизосомальные мембранные белки, так и белки, окружающие лизосомы в радиусе 10-20 нм, могут быть уверенно идентифицированы и точно количественно определены в живых нейронах человека. Каждый шаг протокола подробно описан, т.е. культура hiPSC-нейронов, бесконтактная маркировка, сбор нейронов, флуоресцентная микроскопия, обогащение биотинилированного белка, переваривание белка, анализ LC-MS и анализ данных. Таким образом, этот уникальный эндогенный лизосомальный метод бесконтактной маркировки протеомики обеспечивает высокопроизводительный и надежный аналитический инструмент для изучения высокодинамной лизосомальной активности в живых нейронах человека.

Введение

Лизосомы представляют собой катаболические органеллы, которые разлагают макромолекулы через лизосомально-аутофагический путь1. Помимо деградации, лизосомы участвуют в различных клеточных функциях, таких как сигнальная трансдукция, восприятие питательных веществ и секреция 2,3,4. Возмущения в лизосомальной функции были вовлечены в лизосомальные нарушения хранения, рак, старение и нейродегенерацию 3,5,6,7. Для постмитотических и высокополяризованных нейронов лизосомы играют решающую роль в нейрональном клеточном гомеостазе, высвобождении нейротрансмиттеров и переносе на большие расстояния вдоль аксонов 8,9,10,11. Тем не менее, исследование лизосом в нейронах человека было сложной задачей. Недавние достижения в области технологий нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), позволили культуре живых человеческих нейронов, которые ранее были недоступны, преодолев разрыв между животными моделями и пациентами-людьми для изучения человеческого мозга12,13. В частности, передовая технология i3Neuron стабильно интегрирует фактор транскрипции нейрогенина-2 в геном iPSC под действием промотора, индуцируемого доксициклином, заставляя iPSCs дифференцироваться в чистые корковые нейроны за 2 недели14,15.

Из-за высокодинамической лизосомальной активности захват лизосомальных взаимодействий с другими клеточными компонентами является технически сложным, особенно в высокопроизводительном режиме. Технология бесконтактной маркировки хорошо подходит для изучения этих динамических взаимодействий из-за ее способности захватывать как стабильные, так и переходные/слабые белковые взаимодействия с исключительной пространственной специфичностью16,17. Инженерная пероксидаза или биотинлигаза может быть генетически слита с белком приманки. После активации высокореакционноспособные радикалы биотина продуцируются для ковалентной маркировки соседних белков, которые затем могут быть обогащены шариками, покрытыми стрептавидином, для последующей протеомики снизу вверх с помощью платформ жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS) 17,18,19,20,21.

Недавно был разработан эндогенный лизосомальный метод бесконтактной маркировки протеомики для захвата динамического лизосомального микроокружения в i3нейронах22. Сконструированная аскорбатпероксидаза (APEX2) была введена на С-конец лизосомально-ассоциированного мембранного белка 1 (LAMP1) в иПСК, который затем может быть дифференцирован в корковые нейроны. LAMP1 является обильным лизосомальным мембранным белком и классическим лизосомальным маркером23. LAMP1 также экспрессируется в поздних эндосомах, которые созревают в лизосомы; эти поздние эндосомы-лизосомы и недеградирующие лизосомы упоминаются в этом протоколе как лизосомы. Этот эндогенный зонд LAMP1-APEX, выраженный на физиологическом уровне, может уменьшить артефакты неправильной локализации и сверхэкспрессии LAMP1. Сотни лизосомальных мембранных белков и лизосомальных интеракторов могут быть идентифицированы и количественно определены с отличным пространственным разрешением в живых нейронах человека.

Здесь описан подробный протокол для лизосомной бесконтактной маркировки протеомики в нейронах человека, полученных из iPSC, с дальнейшими улучшениями по сравнению с недавно опубликованным методом22. Общий рабочий процесс показан на рисунке 1. Протокол включает в себя культуру нейронов, полученную из hiPSC, активацию бесконтактной маркировки в нейронах, проверку активности APEX с помощью флуоресцентной микроскопии, определение оптимального соотношения бусин стрептавидина к входному белку, обогащение биотинилированных белков, переваривание белка на шариках, обессоливание и количественное определение пептидов, анализ LC-MS и анализ данных протеомики. Также обсуждаются рекомендации по устранению неполадок и экспериментальные оптимизации для улучшения контроля качества и производительности бесконтактной маркировки.

протокол

Все процедуры были одобрены комитетом по биобезопасности и этике Университета Джорджа Вашингтона. Составы сред и буферов, используемых в этом протоколе, приведены в таблице 1. Информация о коммерческом продукте, используемая здесь, приведена в Таблице материалов.

1. Культура нейронов человека, полученная из iPSC

  1. Человеческая культура iPSC и интеграция зонда LAMP1-APEX (7 дней)
    1. Разморозьте раствор матригеля в ведре со льдом при 4 °C на ночь, аликвотируйте 500 мкл раствора в холодных стерильных трубках и храните аликвоты при −80°C. Приготовьте 50 мл раствора для покрытия, добавив 500 мкл запаса Matrigel в 49,5 мл холодной среды DMEM/F12.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите Matrigel холодным и используйте предварительно охлажденные конические трубки и наконечники пипеток для предотвращения полимеризации. Раствор покрытия можно хранить при 4 °C в течение 2 недель.
    2. Покройте чашку для культивирования клеток 10 см 4 мл раствора для нанесения покрытия в течение 1 ч в инкубаторе с температурой 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Витронектин может быть альтернативным раствором покрытия при концентрации 5 мкг/мл и 2-часовом покрытии для культуры iPSC. Витронектин (однобелковый компонент) дороже, чем Matrigel, но имеет меньше вариаций партии и более чистые фоновые сигналы, чем Matrigel, который извлекается из опухоли мыши с многочисленными белками внеклеточного матрикса. Необработанная тканевая культуральная пластина необходима для витронектинового покрытия. Покрытие Matrigel работает как для обработанных, так и для необработанных тканевых культуральных пластин.
    3. Разморозка и тарелка 1-3 миллиона hiPSCs на каждой покрытой 10 см чашке, предварительно загруженной 8 мл полноценной среды Essential E8, дополненной ингибитором ROCK (конечная концентрация 10 мкМ Y-27632 или 50 нМ Chroman1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление ингибитора ROCK (Y-27632 или Chroman1) в среду культивирования стволовых клеток сводит к минимуму диссоциационно-индуцированный апоптоз после расщепления и криогенного сохранения. Недавно было показано, что Chroman1 более эффективен, чем Y-27632, при ингибировании как ROCK1, так и ROCK224.
    4. Изменение до 10 мл полной среды E8 без ингибитора ROCK после образования колоний иПСК, как правило, через 1-2 дня. Поддерживайте культуру iPSC в полной среде E8 и заменяйте супернатант свежей средой через день.
    5. Интегрируйте фермент бесконтактной маркировки, инженерную аскорбатпероксидазу (APEX2), в С-конец эндогенного гена LAMP1 с помощью геномной инженерии CRISPR. Для получения подробных шагов по созданию инженерной стабильной клеточной линии обратитесь к ранее опубликованному методу (Frankenfield et al). 22.
  2. Дифференциация iPSC-нейронов человека (3 дня)
    1. Перед дифференцировкой нанесите 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток на ночь 4 мл раствора с покрытием Matrigel в инкубаторе с температурой 37 °C.
    2. Поддерживайте hiPSCs до ~70% слияния. Аккуратно промыть hiPSCs фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) 2x для удаления мертвых клеток. Аспирировать PBS и добавить 3 мл Accutase в 10 см чашку клеток. Встряхните тарелку для равномерного распределения и инкубируйте в течение 8 минут в инкубаторе при температуре 37 °C.
    3. Добавьте 2 мл PBS для промывки и подъема клеток с пластины и соберите весь клеточный раствор в коническую трубку объемом 15 мл. Гранулируют клетки центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин. Пластина 2-4 × 106 hiPSCs на пластину с покрытием Matrigel, предварительно загруженную 8 мл теплой среды индукции нейронов (таблица 1). Равномерно распределите клетки и поместите в инкубатор при температуре 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференцировка нейронов обусловлена доксициклин-индуцируемым фактором транскрипции, нейрогенином-2 (NGN2), который был переэкспрессирован в этой стабильной клеточной линии hiPSC15.
    4. Осторожно промойте hiPSC pBS на 1-й день дифференцировки, чтобы удалить омертвевшие остатки клеток. Заменить 10 мл теплой индукционной среды без ингибитора ROCK.
    5. Менять теплой индукционной средой без ингибитора ROCK каждый день до 3 дня дифференцировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нейроны готовы к перекладыванию в нейронную среду.
  3. Покрытие нейронов и поддержание культуры нейронов (10 дней)
    1. Приготовьте 0,1 мг/мл раствора поли-L-орнитина (PLO) в боратном буфере (таблица 1).
    2. Покройте чашку для клеточной культуры раствором покрытия PLO в инкубаторе с температурой 37 °C в течение, по меньшей мере, 1 ч или на ночь до покрытия нейронов 3-го дня. Трижды вымойте посуду 4 мл стерильной воды и дайте ей полностью высохнуть на воздухе внутри шкафа биобезопасности.
    3. Диссоциировать 3 нейрона дня из каждой чашки размером 10 см с 3 мл аккутазы и пластиной 8-10 миллионов клеток на каждую 10-сантиметровую чашку, покрытую ПЛО, предварительно загруженную теплой кортикальной нейронной средой (таблица 1).
    4. Выполняйте половинную смену среды каждые 2-3 дня с теплой нейронной средой, пока i3нейрона не достигнут созревания через 2 недели после дифференцировки.

2. Бесконтактная маркировка in situ и лизис нейронов (2 ч)

  1. Готовят 500 мМ раствора биотин-фенола (АД) в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранят при температуре −20 °C. В день бесконтактной маркировки разбавляют раствор запаса АД теплой нейронной средой и обрабатывают нейроны в конечной концентрации 500 мкМ в течение 30 мин в инкубаторе с температурой 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доксициклин добавляется в нейронную среду, которая активирует экспрессию фермента APEX. Докциклин необходимо добавить не менее чем за 24 часа до эксперимента по бесконтактной маркировке.
  2. Инициируют реакцию маркировки, добавляяH2O2 в конечной концентрации 1 мМ в культуру нейронов и инкубируют ровно 1 мин. Сразу же аспирировать среду и промыть 3 раза буфером закалки (табл. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: РастворH2O2 следует сделать свежим перед реакцией маркировки. АктивацияH2O2 должна составлять ровно 1 мин, чтобы уменьшить экспериментальные вариации и свести к минимуму окислительный стресс, вызванный длительной обработкойH2O2.
  3. Наклоните пластину, чтобы аспирировать весь остаточный буфер. Добавьте ледяной буфер лизиса клеток (таблица 1) непосредственно на пластину нейрона. Используйте 100 мкл буфера лизиса клеток на 1 миллион нейронов. Закрутите пластину для достаточного лизиса клеток и поместите на лед.
  4. Соскоблите лизаты клеток в холодные пробирки объемом 1,5 мл. Сонуйте на ледяной водяной бане с помощью ультразвукового аппарата для ванны (>100 Вт) в течение 15 мин с чередованием циклов 40 с включением, 20 с выключением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно лизированный белковый раствор должен быть прозрачным без гранул или избыточных пузырьков. Достаточная обработка клеточным лизатом ультразвуком имеет решающее значение для сдвига нуклеиновых кислот и снижения липкости лизата клеток, чтобы уменьшить неспецифическое связывание в последующих процедурах. Зондовый ультразвуковой аппарат также может использоваться для обеспечения более сильного и быстрого лизиса клеток, но для минимизации перекрестного загрязнения и потери образцов требуется промывка зонда между образцами.
  5. Добавьте холодный ацетон (−20 °C) в образец в 4-кратном объеме лизисного буфера. Вихрь кратковременно и инкубируют при −20 °C в течение 3 ч.
  6. Центрифуга при 16 500 × г в течение 10 мин при 2 °C. Удалите супернатант, не нарушая белковую гранулу. Вымойте гранулу 1 мл ацетона −20 °C 2x и удалите супернатант после центрифугирования.
  7. Высушите белковую гранулу вакуумным концентратором в течение 1 мин. Добавьте буфер лизиса клеток, чтобы полностью растворить гранулу. При необходимости ненадолго соникуйте. Храните образцы при температуре −80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Осаждение ацетона может удалить остаток биотин-фенола в образце, что может помешать последующему обогащению биотинилированных белков.

3. Флуоресцентная микроскопия для проверки локализации и активности APEX (1,5 дня)

  1. Инкубируют i3нейрона, экспрессирующие эндогенный LAMP1-APEX с 500 мкМ АД в течение 30 мин при 37 °C. Активируйте маркировку с помощью обработки 1 мМ H2O2 всего за 1 с, чтобы ограничить диффузию биотинового облака.
  2. Немедленно зафиксируйте клетки с 4% параформальдегидом в буфере закалки и аккуратно промыть 3x PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для посуды размером 10 см необходимо 4-6 мл для достаточного мытья.
  3. Блокируйте и пермеабилизируйте клетки, используя 3% ослиную сыворотку и 0,1% сапонина в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
  4. Инкубировать клетки с первичным антителом против LAMP1 (мышиный моноклональный H3A4, 1:1000) в течение ночи при 4 °C.
  5. Промывайте нейроны 3 x осторожно с помощью PBS. Инкубируют нейроны с антимышевым вторичным антителом AF561 (1:1000) и Стрептавидином-680 (1:1000) в течение 1 ч при РТ.
  6. Промыть 2x с PBS и инкубировать с Hoechst или 4',4-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) ядерным маркером в течение 10 мин на RT. Промыть клетки 2x PBS.
  7. Визуализируйте фиксированные нейроны под флуоресцентным микроскопом. Наблюдайте за биотинилированными белками, окрашенными стрептавидином и колокализованными окрашиванием LAMP1 вне ядра, чтобы подтвердить правильное местоположение активности APEX.

4. Определение соотношения бусин стрептавидина к входному белку (1,5 дня)

  1. Выполнение моющего средства-совместимого анализа белка (DCA) для определения общих концентраций белка в клеточных лизатах
    1. Растворяют стандартный белок бычьего сывороточного альбумина (BSA) в буфере лизиса клеток в концентрации 4 мг/мл. Готовят серию стандартных растворов белка BSA (0,2-2 мг/мл, 5 разведений) с использованием буфера лизиса клеток.
    2. Перенесите 5 мкл из каждого образца белка, стандартного раствора белка BSA и буфера лизиса пустых клеток в трех экземплярах в каждую лунку в 96-луночной пластине.
    3. Добавьте 2 мкл реагента S на 1 мл реагента A, чтобы получить реагент A'. Добавьте 25 мкл реагента А' в каждую лунку. Добавьте 200 мкл реагента В в каждую лунку. Смешайте и лопайте пузырьки, если таковые имеются.
    4. Инкубируйте эту 96-луночную пластину на RT в течение 15 минут, считывайте поглощение при 750 нм в считывателе микропластин и количественно оценивайте концентрации образцов белка на основе стандартной кривой BSA.
  2. Анализ титрования бусин (1,5 дня)
    1. Перенесите серию суспензии магнитных шариков стрептавидина (20 мкл, 15 мкл, 12 мкл, 10 мкл, 8 мкл, 4 мкл, 1 мкл, 0 мкл) в ленточные трубки ПЦР. Поместите трубки для полосы ПЦР на магнитную стойку, вымойте шарики 3x со 100 мкл 2% буфера SDS и полностью снимите буфер стирки, находясь на магнитной стойке.
    2. Добавьте 50 мкг образца белка в каждую пробирку. Добавьте больше буфера лизиса к общему объему 80 мкл. Плотно закройте каждую трубку и вращайте при 4 °C в течение ночи.
    3. Центрифугируйте трубки для полосы ПЦР на настольной микроцентрифуге. Поместите трубки для полосы ПЦР на магнитную стойку на 1 мин. Поместите 2 мкл супернатанта из каждой трубки на сухую нитроцеллюлозную мембрану и дайте мембране полностью высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если интенсивность сигнала низкая, на мембране может быть обнаружено более 2 мкл. Объем может быть увеличен путем пятнистости несколько раз на одном и том же месте после того, как мембрана высушивается на воздухе между каждым разом. Также может быть использован аппарат Bio-Dot.
    4. Инкубируют мембрану в блокирующий буфер (TBS) в течение 1 ч. Инкубируют мембрану в конъюгате Streptavidin Alexa Fluor 680 (1:1000 в блокирующем буфере) в течение 1 ч. Затем промыть мембрану с помощью TBS-T (табл. 1) 5x.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой анализу точечного пятна является вестерн-блоттинг с использованием антитела к стрептавидину.
    5. Измерьте флуоресцентный сигнал каждой точки на мембране под длиной волны 680 нм и сгенерируйте диаграмму рассеяния с флуоресцентным сигналом по объему шариков. Выберите оптимальный объем шариков, необходимый для 50 мкг входного образца белка, исходя из того, где заканчивается экспоненциальный распад кривой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность флуоресценции представляет собой обилие биотинилированных белков в надосадочном веществе, которое должно уменьшаться с увеличением количества шариков.

5. Обогащение биотинилированных белков и переваривание бисера (3 дня)

  1. Перенесите образцы лизата белка от −80 °C и обжайте образцы ультразвуком в пробирках по 1,5 мл в течение 30 с в анализаторе ванны для быстрого размораживания растворов. Вихрь и поместите пробоотборники на лед.
  2. Переложите 250 мкл магнитного шарика стрептавидина (SA) в каждую трубку объемом 1,5 мл. Положите трубки на магнитную стойку, вымойте шарики 3x с 1 мл Wash Buffer A (2% SDS) и удалите остаточный буфер.
  3. Основываясь на результатах анализа точечного пятна и анализа белка DC, рассчитайте количество образца белка (мкг), необходимого для 250 мкл суспензии магнитных шариков стрептавидина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эндогенно экспрессированном зонде LAMP1-APEX на 50 мкг входного белка необходимо 5 мкл шариков. Поэтому к 250 мкл бусин добавляют 2,5 мг общего белка. Менее 250 мкл шариков SA может быть использовано для ограниченного входного образца материала.
  4. Добавьте буфер лизиса клеток в трубку, содержащую магнитную шарико-лизатную смесь, общим объемом 1 мл и вращайте при 4 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы из разных групп или реплик должны быть нормализованы до одинаковой концентрации белка, объема и количества шариков, чтобы уменьшить экспериментальные вариации.
  5. Кратковременно открутите все трубки на настольной микроцентрифуге и поместите трубки на магнитную стойку на 1 мин. Извлеките супернатант, находясь на магнитной стойке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно ждать в течение 1 минуты после размещения пробок на магнитной стойке каждый раз. Это может свести к минимуму потери бусин из-за невидимого небольшого количества бусин, все еще движущихся к магниту в растворе.
  6. Вымойте шарики 2 раза с 1 мл Wash Buffer A при RT (5 мин вращения каждый раз). Повторите процесс с каждым буфером промывки 2 раза последовательно при 4 °C. (Буфер B, Буфер C и Буфер D; Таблица 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Высокая концентрация раствора SDS может выпадать в осадок при низких температурах. Первая стирка должна быть выполнена на RT.
  7. Поместите трубки на магнитную стойку. Вымойте бусины 2x с помощью Buffer D, чтобы полностью удалить остаточное моющее средство. Повторно суспендируют шарики в 100 мкл буфера Tris 50 мМ и добавляют 5 мМ TCEP (конечная концентрация) для инкубации в течение 30 мин при 37 °C в смесителе с контролируемой температурой, встряхивая при 1 200 об/мин.
  8. Добавьте 15 мМ йодоацетамида (IAA, конечная концентрация) в каждую трубку и инкубируйте в течение 30 мин при 37 °C в смесителе с контролируемой температурой, встряхивая при 1 200 об/мин в темноте (крышка смесителя включена).
    ПРИМЕЧАНИЕ: IAA светочувствительна и должна быть сделана свежей за 5 минут до этого шага.
  9. Добавьте 5 мМ TCEP (конечная концентрация) для гашения избытка IAA. Инкубировать в течение 10 мин при 37 °C в смесителе с регулируемой температурой с встряхиванием при 1 200 об/мин (крышка смесителя выключена).
  10. Ненадолго центрифугируйте пробирки для образцов и поместите на магнитную стойку на 1 мин, чтобы удалить супернатант. Добавьте 200 мкл 5 мМ TCEP в буфер Tris 50 мМ для повторного суспендирования шариков. Добавьте к образцу 1 мкг смеси Трипсин/Лис-С и инкубируйте в течение 14 ч при 37 °C в смесителе с контролируемой температурой, встряхивая при 1 200 об/мин.
  11. Добавьте дополнительно 0,2 мкг смеси Трипсина/Лис-С и переваривайте в течение 3 ч.
  12. Кратковременно покрутите пробирки и поместите трубки на магнитную стойку на 1 мин. Перенесите пептидный супернатант для очистки трубок, находясь на магнитной стойке. Вымойте шарики с буфером 50 мКл 50 мМ Tris (встряхивайте в течение 5 мин) и соедините пептидные супернатанты.
  13. Добавьте 30 мкл 10% трифторуксусной кислоты (TFA) в пробирку, содержащую пептидный супернатант, чтобы получить рН <3.

6. Пептидное обессоливание и фракционирование (2 ч)

  1. Смочите обратнофазную твердофазную экстракционную пластину (только скважины для использования) 200 мкл метанола марки ВЭЖХ (MeOH) 3x на вакуумном коллекторе. Добавьте 200 мкл 1% TFA в воду класса ВЭЖХ 3x, чтобы уравновесить пластину.
  2. Загрузите образцы пептидов в пластину, медленно включив вакуум для скорости потока ниже 3 капель / с, чтобы свести к минимуму потери образца.
  3. Вымойте экстракционную пластину 3x с 200 мкл 1% TFA. Снова промыть экстракционную пластину 200 мкл 1% TFA, содержащей 2% MeOH (v/v). Держите скорость потока ниже 3 капель/с.
  4. Замените коллекционную пластину на коллекционную пластину с 96 лунками. Если фракционирование не требуется, элюируют образцы пептидов 3x со 100 мкл 1% TFA, содержащим 80% MeOH, и объединяют в новую пробирку. Высушите образцы пептидов в вакуумном концентраторе без нагрева.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется фракционирование, образцы пептидов могут быть элюированы на 4 фракции впоследствии с использованием 200 мкл 1% TFA, содержащего 15%, 35%, 50% и 90% MeOH, соответственно, в другой коллекционной пластине.

7. Колориметрический количественный анализ пептидов (необязательно) (1 ч)

  1. Повторно суспендируйте образцы пептидов в 50 мкл воды класса LC-MS и возьмите 20 мкл аликвот для выполнения пептидного анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе потребляется большое количество пептидного образца, но может обеспечить точную количественную оценку концентрации пептида перед анализом LC-MS. Обычно это проводится только один раз для каждого типа образца для тестирования перед крупномасштабной пробоподготовкой.
  2. Готовят серийные разведения стандартных растворов пептидов (входят в набор для колориметрического анализа) в воде марки LC-MS. Приготовьте рабочий реагент путем смешивания 50% реагента А, 48% реагента В и 2% реагента С.
  3. Перенос 20 мкл каждого стандартного пептидного раствора (три реплики) и неизвестного образца пептида в 96-луночную микропластину. Добавьте в каждую лунку 180 мкл рабочего реагента, хорошо перемешайте и инкубируйте пластину в течение 30 мин при РТ.
  4. Считайте абсорбцию при 480 нм в считывателе микропластин и количественно оцените концентрации образцов пептидов на основе стандартной кривой пептида.

8. Анализ LC-MS

  1. Повторное суспендирование пептидных образцов в LC Buffer A (2% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты, класс LC-MS). Центрифуга при 16 500 × г в течение 10 мин при 4 °C для избавления от любых возможных частиц.
  2. Переведите супернатант на флаконы LC-MS. Анализируйте образцы с помощью прибора nanoLC-MS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные параметры LC-MS/MS зависят от прибора и были описаны ранее 22,25,26.
  3. Сгенерируйте пользовательский список исключений LC-MS с диапазоном времени удержания для высокообильных пиков загрязняющих пептидов, таких как стрептавидин и трипсин с точностью массы 5 ppm22 (например, общие пики пептида стрептавидина составляют m/z 402.5435 [заряд 3], m/z 603.3117 [заряд 2], m/z 654.9733 [заряд 3], m/z 678.6812 [заряд 3], m/z 1017.5182 [заряд 2], и так далее.; распространенными пиками пептида трипсина являются m/z 421.7584 [заряд 2], m/z 523.2855 [заряд 2] и m/z 737.7062 [заряд 3]).

9. Анализ данных протеомики

  1. Анализируйте необработанные данные LC-MS с помощью программного обеспечения для анализа данных протеомики, такого как Proteome Discoverer, MaxQuant27 или MS-Fragger28. Включить две библиотеки FASTA для анализа данных: 1) справочную базу данных Swissprot Homo Sapiens ; 2) недавно созданная универсальная библиотека загрязняющих веществ FASTA (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), которая, как было доказано, улучшает идентификацию протеомики и уменьшает ложные открытия29.
  2. Настройка параметров анализа данных протеомики с отсечкой 1% ложного обнаружения (FDR) для идентификации спектрального соответствия белков и пептидов (PSM). Выберите переваривание трипсина с максимум тремя пропущенными расщеплениями, фиксированной модификацией карбамидометилирования цистеина и переменной модификацией окисления метионина и N-концевым ацетилированием белка. Используйте пиковые интенсивности пептида MS1 для количественной оценки без маркировки. Нормализовать интенсивность пептидов до эндогенно биотинилированной карбоксилазы, пропионил-КоА-карбоксилазы (PCCA), чтобы уменьшить вариации бесконтактной маркировки, как описано ранее22.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализацию PCCA можно выбрать в программном обеспечении Proteome Discoverer, включив файл FASTA последовательности белков PCCA. В качестве альтернативы, нормализация PCCA может быть проведена в последующем анализе данных.
  3. Экспорт результатов на уровне белка из программного обеспечения протеомики. Удалите загрязняющие белки перед статистическим анализом29. Удалите белки только с 1 PSM или без результата количественной оценки. Проведение анализа онтологии генов белка (GO) с помощью Enrichr30 и анализа белковой сети с помощью STRING31.

Результаты

Это исследование протеомики, маркирующей близость лизосом, было проведено в нейронах человека, полученных из iPSC, для захвата динамического лизосомального микроокружения in situ в живых нейронах. Клеточные морфологии hiPSCs и нейронов, полученных hiPSC, в разные моменты времени проиллюстр...

Обсуждение

Используя этот зонд LAMP1-APEX, белки на лизосомальной мембране и рядом с ней биотинилируются и обогащаются. Учитывая типичный диаметр лизосомы 100-1 200 нм, этот метод обеспечивает отличное внутриклеточное разрешение с радиусом маркировки 10-20 нм. LAMP1 является обильным лизосомальным мембранны?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование поддерживается грантом NIH (R01NS121608). A.M.F. признает стипендию ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship и стипендию Фонда Бурбона Ф. Скрибнера. Мы благодарим лабораторию Майкла Уорда в Национальном институте неврологических расстройств и инсульта (NINDS) за поддержку молекулярной биологии и разработку технологии i3Neuron.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10% (w/v) Saponin solutionAcros Organics419231000Flourescent Microscopy
AccutaseLife TechnologiesA1110501cell detachment solution, Cell Culture
B27 SupplementFisher Scientific17504044Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNFPeproTech450-02Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acidSigma-AldrichB6768Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA8806To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal mediumSTEMCELL Technologies5790Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561Thermo Fisher Scientific505-0452-82Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitorTocris716310Cell Culture
cOmplete mini Protease InhibitorRoche4693123001cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit IIBio-Rad5000112To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11320082Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPESThermo Fisher Scientific11330057Cell Culture, Induction Medium
Donkey serumSigma-AldrichD9663Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC)Sigma-AldrichD9891-1GCell Culture, Induction Medium
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kitWatersWAT097944For Peptide desalting
Formic Acid (FA)Fisher ScientificA11750For LC-MS analysis
GDNFPeproTech450-10Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dyeThermo Fisher Scientific62239Flourescent Microscopy
HPLC grade methanolFisher ScientificA452For Peptide desalting
HPLC grade waterFisher ScientificW5For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cellsCorriell InstituteGM25256Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.Thermo Fisher ScientificAA33323ADProximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA)Millipore SigmaI6125For Protein Digestion
LamininFisher Scientific23017015Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade AcetonitrileFisher ScientificA955For LC-MS analysis
LC-MS grade waterFisher ScientificW64For LC-MS analysis
L-glutamineFisher Scientific25-030-081Cell Culture, Induction Medium
MatrigelThermo Fisher Scientific08-774-552basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bankh4a3Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x)Fisher Scientific17-502-048Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cmBio-Rad1620145To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA)Fisher Scientific11-140-050Cell Culture, Induction Medium
NT-3PeproTech450-03Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plateWaters186000309For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS)LI-COR Biosciences927-50000To conduct dot blot assay for bead titration
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock)Adipogen41994-02-9Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesiumGibco10010049Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Fisher23275Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO)Millipore SigmaP3655Cell Culture, Dish Coating
Sodium AscorbateSigma-AldrichA4034Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azideSigma-AldrichS8032Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificS271500Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Thermo Fisher ScientificBP1311220Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxideSigma-Aldrich415413Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborateSigma-Aldrich221732Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentratorvacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose BeadsCytiva (formal GE)28-9857-99Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 ConjugateThermo Fisher ScientificS32358To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixertemperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA)Millipore Sigma302031For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Millipore SigmaC4706For Protein Digestion
Tris-HClThermo Fisher ScientificBP152500Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-XThermo Fisher ScientificBP151500Beads wash buffer
TROLOXSigma-Aldrich648471Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5073For Protein Digestion
TWEEN 20Millipore SigmaP1379Dot blot assay buffer
UreaThermo Fisher ScientificBP169500Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
VitronectinSTEMCELL Technologies7180Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitorSelleckS1049Cell Culture

Ссылки

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184iPSCLAMP1APEX

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены