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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein neuronales Lysosomen-Proximity-Markierungs-Proteomik-Protokoll wird hier beschrieben, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen zu charakterisieren. Lysosomale Membranproteine und Proteine, die mit Lysosomen interagieren (stabil oder vorübergehend), können in dieser Methode mit hervorragender intrazellulärer räumlicher Auflösung in lebenden menschlichen Neuronen genau quantifiziert werden.

Zusammenfassung

Lysosomen kommunizieren häufig mit einer Vielzahl von Biomolekülen, um den Abbau und andere verschiedene zelluläre Funktionen zu erreichen. Lysosomen sind entscheidend für die menschliche Gehirnfunktion, da Neuronen postmitotisch sind und stark auf den Autophagie-Lysosomen-Weg angewiesen sind, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Trotz Fortschritten im Verständnis verschiedener lysosomaler Funktionen ist die Erfassung der hochdynamischen Kommunikation zwischen Lysosomen und anderen zellulären Komponenten technisch schwierig, insbesondere im Hochdurchsatz. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die kürzlich veröffentlichte endogene (knock-in) Lysosomen-Proximity-Markierungsmethode in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC)-abgeleiteten Neuronen bereitgestellt.

Sowohl lysosomale Membranproteine als auch Proteine, die Lysosomen in einem Umkreis von 10-20 nm umgeben, können in lebenden menschlichen Neuronen sicher identifiziert und genau quantifiziert werden. Jeder Schritt des Protokolls wird detailliert beschrieben, d.h. hiPSC-Neuronenkultur, Proximity-Markierung, Neuronenernte, Fluoreszenzmikroskopie, biotinylierte Proteinanreicherung, Proteinverdauung, LC-MS-Analyse und Datenanalyse. Zusammenfassend bietet diese einzigartige endogene lysosomale Proximity-Markierungsmethode ein robustes Analysewerkzeug mit hohem Durchsatz, um die hochdynamischen lysosomalen Aktivitäten in lebenden menschlichen Neuronen zu untersuchen.

Einleitung

Lysosomen sind katabole Organellen, die Makromoleküle über den lysosomalen Autophagieweg1 abbauen. Neben dem Abbau sind Lysosomen an verschiedenen zellulären Funktionen wie Signaltransduktion, Nährstofferkennung und Sekretion beteiligt 2,3,4. Störungen der lysosomalen Funktion wurden mit lysosomalen Speicherstörungen, Krebs, Alterung und Neurodegeneration in Verbindung gebracht 3,5,6,7. Für postmitotische und stark polarisierte Neuronen spielen Lysosomen eine entscheidende Rolle bei der neuronalen zellulären Homöostase, der Freisetzung von Neurotransmittern und dem Ferntransport entlang der Axone 8,9,10,11. Die Untersuchung von Lysosomen in menschlichen Neuronen war jedoch eine herausfordernde Aufgabe. Jüngste Fortschritte bei induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten Neuronentechnologien haben die Kultur lebender menschlicher Neuronen ermöglicht, die zuvor unzugänglich waren, und die Lücke zwischen Tiermodellen und menschlichen Patienten überbrückt, um das menschliche Gehirn zu untersuchen12,13. Insbesondere integriert die fortschrittliche i3Neuron-Technologie stabil den Neurogenin-2-Transkriptionsfaktor in das iPSC-Genom unter einem Doxycyclin-induzierbaren Promotor, wodurch iPSCs dazu gebracht werden, sich in 2 Wochen in reine kortikale Neuronen zu differenzieren14,15.

Aufgrund der hochdynamischen lysosomalen Aktivität ist die Erfassung lysosomaler Interaktionen mit anderen zellulären Komponenten technisch anspruchsvoll, insbesondere im Hochdurchsatz. Die Proximity-Markierungstechnologie eignet sich gut zur Untersuchung dieser dynamischen Wechselwirkungen, da sie sowohl stabile als auch transiente/schwache Proteininteraktionen mit außergewöhnlicher räumlicher Spezifität erfassen kann16,17. Technisch hergestellte Peroxidase oder Biotinligase können genetisch mit dem Köderprotein verschmolzen werden. Nach der Aktivierung werden hochreaktive Biotinradikale erzeugt, um benachbarte Proteine kovalent zu markieren, die dann durch Streptavidin-beschichtete Beads für die nachgeschaltete Bottom-up-Proteomik über flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Plattformen (LC-MS) 17,18,19,20,21 angereichert werden können.

Eine endogene lysosomale Proximity-Markierungsmethode wurde kürzlich entwickelt, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in i3Neuronen22 zu erfassen. Die technisch hergestellte Ascorbatperoxidase (APEX2) wurde auf den C-Terminus des lysosomal assoziierten Membranproteins 1 (LAMP1) in iPSCs eingeschlagen, die dann in kortikale Neuronen differenziert werden können. LAMP1 ist ein reichlich vorhandenes lysosomales Membranprotein und ein klassischer lysosomaler Marker23. LAMP1 wird auch in späten Endosomen exprimiert, die zu Lysosomen reifen; Diese späten Endosomen-Lysosomen und nicht-degradativen Lysosomen werden in diesem Protokoll alle als Lysosomen bezeichnet. Diese endogene LAMP1-APEX-Sonde, die auf physiologischer Ebene exprimiert wird, kann LAMP1-Fehllokalisations- und Überexpressionsartefakte reduzieren. Hunderte von lysosomalen Membranproteinen und lysosomalen Interaktoren können mit hervorragender räumlicher Auflösung in lebenden menschlichen Neuronen identifiziert und quantifiziert werden.

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Lysosomen-Proximity-Markierungsproteomik in humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen mit weiteren Verbesserungen der kürzlich veröffentlichten Methode22 beschrieben. Der gesamte Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll umfasst die hiPSC-abgeleitete Neuronenkultur, die Aktivierung der Proximity-Markierung in Neuronen, die Validierung der APEX-Aktivität durch Fluoreszenzmikroskopie, die Bestimmung eines optimalen Verhältnisses von Streptavidin-Perlen zu Eingangsproteinen, die Anreicherung biotinylierter Proteine, die Proteinverdauung auf Perlen, die Entsalzung und Quantifizierung von Peptiden, die LC-MS-Analyse und die Analyse von Proteomik-Daten. Richtlinien zur Fehlerbehebung und experimentelle Optimierungen werden ebenfalls diskutiert, um die Qualitätskontrolle und Leistung der Proximity-Kennzeichnung zu verbessern.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der Biosicherheits- und Ethikkommission der George Washington University genehmigt. Die Zusammensetzungen der in diesem Protokoll verwendeten Medien und Puffer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die hier verwendeten kommerziellen Produktinformationen finden Sie im Materialverzeichnis.

1. Humane iPSC-abgeleitete Neuronenkultur

  1. Humane iPSC-Kultur und LAMP1-APEX-Sondenintegration (7 Tage)
    1. Matrigel-Stammlösung in einem Eiskübel bei 4 °C über Nacht auftauen, 500 μL der Lösung in kalte sterile Röhrchen geben und die Aliquots bei −80 °C lagern. Bereiten Sie 50 ml Beschichtungslösung vor, indem Sie 500 μL des Matrigel-Schaftes in 49,5 ml kaltes DMEM/F12-Medium geben.
      HINWEIS: Halten Sie das Matrigel kalt und verwenden Sie vorgekühlte konische Röhrchen und Pipettenspitzen, um eine Polymerisation zu verhindern. Die Beschichtungslösung kann 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
    2. Eine 10 cm große Zellkulturschale mit 4 mL Beschichtungslösung für 1 h in einem 37 °C Inkubator beschichten.
      HINWEIS: Vitronectin kann eine alternative Beschichtungslösung bei 5 μg/ml Konzentration und 2 h Beschichtung für die iPSC-Kultur sein. Vitronectin (einzelne Proteinkomponente) ist teurer als Matrigel, hat aber weniger Chargenvariationen und sauberere Hintergrundsignale als Matrigel, das aus Maustumoren mit zahlreichen extrazellulären Matrixproteinen extrahiert wird. Für die Invitronektin-Beschichtung wird eine unbehandelte Gewebekulturplatte benötigt. Die Matrigelbeschichtung funktioniert sowohl für behandelte als auch für unbehandelte Gewebekulturplatten.
    3. Auftauen und Platte 1-3 Millionen hiPSCs auf jeder beschichteten 10-cm-Schale, die mit 8 mL Essential E8 Komplettmedium vorgeladen ist, ergänzt mit ROCK-Inhibitor (Endkonzentration 10 μM Y-27632 oder 50 nM Chroman1).
      HINWEIS: Die Zugabe von ROCK-Inhibitor (Y-27632 oder Chroman1) zum Stammzellkulturmedium minimiert die dissoziationsinduzierte Apoptose nach Spaltung und kryogener Konservierung. Chroman1 hat sich kürzlich als wirksamer als Y-27632 bei der Hemmung von ROCK1 und ROCK224 erwiesen.
    4. Wechsel zu 10 ml E8 Komplettmedium ohne ROCK-Inhibitor, nachdem die iPSCs Kolonien gebildet haben, typischerweise nach 1-2 Tagen. Pflegen Sie die iPSC-Kultur im E8-Komplettmedium und ersetzen Sie den Überstand jeden zweiten Tag durch frisches Medium.
    5. Integration des Proximity-Markierungsenzyms, technisch hergestellte Ascorbatperoxidase (APEX2), in den C-Terminus des endogenen LAMP1-Gens durch CRISPR-Genom-Engineering. Detaillierte Schritte zur Erzeugung einer technisch stabilen Zelllinie finden Sie in der zuvor veröffentlichten Methode (Frankenfield et al). 22.
  2. Humane iPSC-Neuronendifferenzierung (3 Tage)
    1. Vor der Differenzierung eine 10 cm große Zellkulturschale über Nacht mit 4 ml Matrigel-Beschichtungslösung in einem 37 °C Inkubator beschichten.
    2. Halten Sie die hiPSCs bis ~70% Konfluenz aufrecht. Waschen Sie die hiPSCs vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 2x, um abgestorbene Zellen zu entfernen. Das PBS absaugen und 3 ml Accutase in die 10 cm lange Zellschale geben. Schütteln Sie die Platte für eine gleichmäßige Verteilung und inkubieren Sie für 8 min in einem 37 °C Inkubator.
    3. Fügen Sie 2 ml PBS hinzu, um die Zellen zu waschen und von der Platte zu heben, und sammeln Sie die gesamte Zelllösung in einem 15-ml-konischen Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min. Platte 2-4 × 106 hiPSCs auf eine Matrigel-beschichtete Platte, die mit 8 mL warmem Neuroneninduktionsmedium vorgeladen ist (Tabelle 1). Die Zellen gleichmäßig verteilen und in einen 37 °C heißen Inkubator geben.
      HINWEIS: Die Neuronendifferenzierung wird durch einen Doxycyclin-induzierbaren Transkriptionsfaktor, Neurogenin-2 (NGN2), angetrieben, der in dieser stabilen hiPSC-Zelllinie15 überexprimiert wurde.
    4. Waschen Sie hiPSCs am Tag 1 der Differenzierung vorsichtig mit PBS, um abgestorbene Zellablagerungen zu entfernen. Ersetzen Sie durch 10 ml warmes Induktionsmedium ohne ROCK-Inhibitor.
    5. Wechsel mit warmem Induktionsmedium ohne ROCK-Inhibitor jeden Tag bis Tag 3 der Differenzierung.
      HINWEIS: Neuronen sind bereit, in ein neuronales Medium umgewandelt zu werden.
  3. Plattierung von Neuronen und Aufrechterhaltung der Neuronenkultur (10 Tage)
    1. 0,1 mg/ml Poly-L-Ornithin (PLO)-Beschichtungslösung in Boratpuffer herstellen (Tabelle 1).
    2. Beschichten Sie eine Zellkulturschale mit der PLO-Beschichtungslösung in einem 37 °C-Inkubator für mindestens 1 Stunde oder über Nacht, bevor Sie Tag 3 Neuronen plattieren. Waschen Sie die Schale dreimal mit 4 ml sterilem Wasser und lassen Sie sie vollständig an der Luft trocknen.
    3. Dissoziieren Sie Tag 3 Neuronen von jeder 10 cm Schale mit 3 ml Accutase und Platte 8-10 Millionen Zellen auf jede 10 cm PLO-beschichtete Schale, die mit warmem kortikalem Neuronmedium vorgeladen ist (Tabelle 1).
    4. Führen Sie alle 2-3 Tage einen Halbmittelwechsel mit warmem Neuronenmedium durch, bisdiei3-Neuronen in 2 Wochen nach der Differenzierung die Reifung erreichen.

2. In situ Proximity-Markierung und Neuronenlyse (2 h)

  1. 500 mM Biotin-Phenol (BP)-Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) herstellen und bei −20 °C lagern. Am Tag der Proximity-Markierung die BP-Stammlösung mit warmem Neuronenmedium verdünnen und die Neuronen in einer Endkonzentration von 500 μM für 30 min in einem 37 °C Inkubator behandeln.
    HINWEIS: Doxycyclin wird in das Neuronenmedium gegeben, wodurch die APEX-Enzymexpression aktiviert wird. Doxcyclin muss mindestens 24 Stunden vor dem Proximity-Markierungsexperiment zugegeben werden.
  2. Die Markierungsreaktion wird durch Zugabe vonH2O2in einer Endkonzentration von 1 mM in die Neuronenkultur eingeleitet und genau 1 min inkubiert. Das Medium sofort absaugen und 3-mal mit Abschreckpuffer abspülen (Tabelle 1).
    HINWEIS:H2O2-Lösungsollte vor der Etikettierreaktion frisch hergestellt werden. Die H2O2-Aktivierung muss genau 1 min betragen, um die experimentelle Variation zu reduzieren und oxidativen Stress zu minimieren, der durch eine längereH 2 O2-Behandlungverursacht wird.
  3. Neigen Sie die Platte, um den gesamten Restpuffer abzusaugen. Fügen Sie einen eiskalten Zelllysepuffer (Tabelle 1) direkt auf die Neuronenplatte auf. Verwenden Sie 100 μL Zelllysepuffer pro 1 Million Neuronen. Schwenken Sie die Platte für eine ausreichende Zelllyse und legen Sie sie auf Eis.
  4. Schaben Sie die Zelllysate in kalte 1,5 ml Röhrchen. In einem eiskalten Wasserbad mit einem Badesonikator (>100 W) für 15 min mit abwechselnden 40 s eingeschalteten, 20 s ausgeschalteten Zyklen beschallen.
    HINWEIS: Ausreichend lysierte Proteinlösung sollte ohne Pellets oder übermäßige Blasen klar sein. Eine ausreichende Beschallung von Zelllysat ist entscheidend, um Nukleinsäuren zu scheren und die Klebrigkeit des Zelllysats zu reduzieren, um die unspezifische Bindung in nachgeschalteten Verfahren zu reduzieren. Ein Sondenbeschaller kann auch verwendet werden, um eine stärkere und schnellere Zelllyse zu ermöglichen, aber das Waschen der Sonde zwischen den Proben ist erforderlich, um Kreuzkontamination und Probenverlust zu minimieren.
  5. Kaltes Aceton (−20 °C) wird der Probe mit einem 4-fachen Volumen Lysepuffer zugegeben. Wirbeln Sie kurz und inkubieren Sie bei −20 °C für 3 h.
  6. Bei 16.500 × g 10 min bei 2 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Proteinpellet zu stören. Das Pellet wird 2x mit 1 ml −20 °C Aceton gewaschen und nach dem Zentrifugieren der Überstand entfernt.
  7. Trocknen Sie das Proteinpellet mit einem Vakuumkonzentrator für 1 min. Fügen Sie Zelllysepuffer hinzu, um das Pellet vollständig aufzulösen. Bei Bedarf kurz beschallen. Lagern Sie die Proben bei −80 °C.
    HINWEIS: Acetonfällung kann Rückstände von Biotinphenol in der Probe entfernen, was die nachgeschaltete Anreicherung von biotinylierten Proteinen stören kann.

3. Fluoreszenzmikroskopie zur Validierung der APEX-Lokalisierung und -Aktivität (1,5 Tage)

  1. Inkubieren Sie die i3Neuronen, die endogene LAMP1-APEX exprimieren, mit 500 μM BP für 30 min bei 37 °C. Aktivieren Sie die Markierung mit 1 mMH2O2-Behandlungfür nur 1 s, um die Diffusion der Biotin-Wolke zu begrenzen.
  2. Die Zellen sofort mit 4% Paraformaldehyd im Quenchpuffer fixieren und 3x vorsichtig mit PBS waschen.
    HINWEIS: Für eine 10 cm Schüssel werden 4-6 ml für eine ausreichende Wäsche benötigt.
  3. Blockieren und permeabilisieren Sie die Zellen mit 3% Eselserum und 0,1% Saponin in PBS für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
  4. Inkubieren Sie die Zellen mit primärem Anti-LAMP1-Antikörper (Maus monoklonal H3A4, 1:1.000) über Nacht bei 4 °C.
  5. Waschen Sie die Neuronen 3 x vorsichtig mit PBS. Inkubieren Sie die Neuronen mit sekundären Anti-Maus-AF561-Antikörpern (1:1.000) und Streptavidin-680 (1:1.000) für 1 h bei RT.
  6. 2x mit PBS waschen und mit Hoechst oder 4',4-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Kernmarker für 10 min bei RT inkubieren. Spülen Sie die Zellen 2x mit PBS aus.
  7. Visualisieren Sie die fixierten Neuronen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Beobachten Sie biotinylierte Proteine, die mit Streptavidin gefärbt und mit LAMP1 kolokalisiert sind, außerhalb des Zellkerns, um den korrekten Ort der APEX-Aktivität zu validieren.

4. Bestimmung des Streptavidin-Beads-to-Input-Protein-Verhältnisses (1,5 Tage)

  1. Durchführung eines waschmittelkompatiblen Proteintests (DCA) zur Bestimmung der Gesamtproteinkonzentrationen in Zelllysaten
    1. Rinderserumalbumin (BSA) -Proteinstandard im Zelllysepuffer in einer Konzentration von 4 mg/ml auflösen. Bereiten Sie eine Reihe von BSA-Proteinstandardlösungen (0,2-2 mg / ml, 5 Verdünnungen) unter Verwendung des Zelllysepuffers vor.
    2. Übertragen Sie 5 μL aus jeder Proteinprobe, BSA-Proteinstandardlösung und Leerzelllysepuffer in dreifacher Ausfertigung in jede Vertiefung in einer 96-Well-Platte.
    3. Fügen Sie 2 μL Reagenz S pro 1 ml Reagenz A hinzu, um Reagenz A' zu erhalten. Fügen Sie 25 μL Reagenz A' in jede Vertiefung hinzu. Fügen Sie 200 μL Reagenz B in jede Vertiefung hinzu. Mischen und platzen Sie Blasen, falls vorhanden.
    4. Inkubieren Sie diese 96-Well-Platte bei RT für 15 Minuten, lesen Sie die Absorption bei 750 nm in einem Mikrotiterplattenleser ab und quantifizieren Sie die Konzentrationen von Proteinproben basierend auf der BSA-Standardkurve.
  2. Beads Titration Dot Blot Assay (1,5 Tage)
    1. Übertragen Sie eine Reihe von Streptavidin-Magnetkügelchen (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) in PCR-Streifenröhrchen. Legen Sie die PCR-Streifenröhrchen auf ein Magnetgestell, waschen Sie die Perlen 3x mit 100 μL 2% SDS-Puffer und entfernen Sie den Waschpuffer vollständig, während Sie sich auf dem Magnetgestell befinden.
    2. Fügen Sie 50 μg Proteinprobe in jedes Röhrchen hinzu. Fügen Sie mehr Lysepuffer zu einem Gesamtvolumen von 80 μL hinzu. Verschließen Sie jedes Röhrchen fest und drehen Sie es über Nacht bei 4 °C.
    3. Zentrifugieren Sie die PCR-Streifenröhrchen kurz auf einer Tisch-Mikrozentrifuge. Legen Sie die PCR-Streifenröhrchen für 1 min auf ein Magnetgestell. 2 μL Überstand aus jedem Röhrchen auf eine trockene Nitrozellulosemembran aufspüren und die Membran vollständig trocknen lassen.
      HINWEIS: Wenn die Signalintensität niedrig ist, können mehr als 2 μL auf der Membran entdeckt werden. Das Volumen kann erhöht werden, indem mehrmals an derselben Stelle gespottet wird, nachdem die Membran zwischen jedem Mal luftgetrocknet wurde. Ein Bio-Dot-Gerät kann ebenfalls verwendet werden.
    4. Inkubieren Sie die Membran in Blockierpuffer (TBS) für 1 h. Inkubieren Sie die Membran in Streptavidin Alexa Fluor 680 Konjugat (1:1.000 im Blockierpuffer) für 1 h. Dann waschen Sie die Membran 5x mit TBS-T (Tabelle 1).
      HINWEIS: Eine Alternative zum Dot-Blot-Assay ist das Western Blotting mit einem Streptavidin-Antikörper.
    5. Messen Sie das Fluoreszenzsignal jedes Punktes auf der Membran unter 680 nm Wellenlänge und erzeugen Sie ein Streudiagramm mit Fluoreszenzsignal über das Volumen der Perlen. Wählen Sie das optimale Volumen an Perlen, das für 50 μg der Eingangsproteinprobe benötigt wird, basierend darauf, wo der exponentielle Zerfall der Kurve endet.
      HINWEIS: Die Fluoreszenzintensität stellt die Häufigkeit biotinylierter Proteine im Überstand dar, die mit zunehmender Menge an Perlen abnehmen sollte.

5. Anreicherung biotinylierter Proteine und Aufperlenverdauung (3 Tage)

  1. Proteinlysatproben von −80 °C übertragen und die Proben in 1,5-ml-Röhrchen für 30 s in einem Badsonikator beschallen, um die Lösungen schnell aufzutauen. Vortex und legen Sie die Probenröhrchen auf Eis.
  2. Übertragen Sie 250 μL Streptavidin (SA) magnetische Beads Slurry in jedes 1,5 ml Röhrchen. Stellen Sie die Röhrchen auf ein Magnetgestell, waschen Sie die Perlen 3x mit 1 ml Waschpuffer A (2% SDS) und entfernen Sie den Restpuffer.
  3. Basierend auf den Ergebnissen des Dot-Blot-Assays und des DC-Protein-Assays wird die Menge an Proteinprobe (μg) berechnet, die für 250 μL der Streptavidin-Magnetperlenaufschlämmung benötigt wird.
    HINWEIS: In dieser endogen exprimierten LAMP1-APEX-Sonde werden 5 μL Perlen für 50 μg Eingangsprotein benötigt. Daher werden 2,5 mg Gesamtprotein zu 250 μL Perlen hinzugefügt. Weniger als 250 μL SA-Perlen können für begrenztes Eingangsprobenmaterial verwendet werden.
  4. Das Röhrchen mit dem magnetischen Bead-Lysat-Gemisch wird mit einem Zelllysepuffer auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gefüllt und über Nacht bei 4 °C gedreht.
    HINWEIS: Proben aus verschiedenen Gruppen oder Replikaten sollten auf die gleiche Proteinkonzentration, das gleiche Volumen und die gleiche Menge an Perlen normalisiert werden, um experimentelle Variationen zu reduzieren.
  5. Drehen Sie alle Röhrchen kurz auf einer Tisch-Mikrozentrifuge herunter und legen Sie die Röhrchen für 1 Minute auf ein Magnetgestell. Entfernen Sie den Überstand, während Sie sich auf dem Magnetgestell befinden.
    HINWEIS: Es ist wichtig, jedes Mal 1 Minute zu warten, nachdem die Probenröhrchen auf das Magnetgestell gelegt wurden. Dies kann den Perlenverlust aufgrund der unsichtbaren kleinen Menge von Perlen minimieren, die sich immer noch in Richtung des Magneten in der Lösung bewegen.
  6. Waschen Sie die Perlen 2x mit 1 ml Waschpuffer A bei RT (jeweils 5 min Umdrehung). Wiederholen Sie den Vorgang mit jedem Waschpuffer 2x nacheinander bei 4 °C. (Puffer B, Puffer C und Puffer D; Tabelle 1).
    HINWEIS: Eine hohe Konzentration von SDS-Lösung kann bei kalten Temperaturen ausfallen. Die erste Wäsche muss bei RT durchgeführt werden.
  7. Legen Sie die Schläuche auf das Magnetgestell. Waschen Sie die Perlen 2x mit Buffer D, um den Reinigungsmittelrest vollständig zu entfernen. Resuspendieren Sie die Beads in 100 μL 50 mM Tris-Puffer und fügen Sie 5 mM TCEP (Endkonzentration) hinzu, um 30 min bei 37 °C in einem temperaturgesteuerten Mischer zu inkubieren und bei 1.200 U/min zu schütteln.
  8. Zu jedem Röhrchen 15 mM Iodacetamid (IAA, Endkonzentration) geben und 30 min bei 37 °C in einem temperaturgesteuerten Mischer inkubieren, wobei bei 1.200 U/min im Dunkeln geschüttelt wird (Mischerkappe auf).
    HINWEIS: IAA ist lichtempfindlich und sollte 5 Minuten vor diesem Schritt frisch gemacht werden.
  9. Fügen Sie 5 mM TCEP (Endkonzentration) hinzu, um überschüssige IAA zu löschen. Inkubieren Sie für 10 min bei 37 °C in einem temperaturgesteuerten Mischer mit Schütteln bei 1.200 U/min (Mischerkappe ab).
  10. Zentrifugieren Sie die Probenröhrchen kurz und legen Sie sie für 1 Minute auf ein Magnetgestell, um den Überstand zu entfernen. Fügen Sie 200 μL 5 mM TCEP in 50 mM Tris-Puffer hinzu, um die Beads zu resuspendieren. 1 μg Trypsin/Lys-C-Mischung in die Probe geben und 14 h bei 37 °C in einem temperaturgesteuerten Mischer unter Schütteln bei 1.200 U/min inkubieren.
  11. Fügen Sie weitere 0,2 μg Trypsin/Lys-C-Mischung hinzu und verdauen Sie sie für 3 h.
  12. Drehen Sie die Probenröhrchen kurz herunter und legen Sie die Röhrchen für 1 min auf ein Magnetgestell. Übertragen Sie den Peptidüberstand, um die Röhrchen auf einem Magnetgestell zu reinigen. Waschen Sie die Perlen mit 50 μL 50 mM Tris-Puffer (5 min schütteln) und mischen Sie die Peptidüberstände.
  13. Geben Sie 30 μL 10% Trifluoressigsäure (TFA) in das Röhrchen, das den Peptidüberstand enthält, um einen pH-Wert <3 zu erhalten.

6. Entsalzung und Fraktionierung von Peptiden (2 h)

  1. Befeuchten Sie die Umkehrphasen-Festphasenextraktionsplatte (nur die Vertiefungen zur Verwendung) mit 200 μL Methanol (MeOH) in HPLC-Qualität 3x auf dem Vakuumverteiler. Fügen Sie 200 μL 1% TFA in HPLC-Wasser 3x hinzu, um die Platte auszugleichen.
  2. Laden Sie die Peptidproben in die Platte und schalten Sie das Vakuum langsam für eine Flussgeschwindigkeit von weniger als 3 Tröpfchen / s ein, um den Probenverlust zu minimieren.
  3. Waschen Sie die Absaugplatte 3x mit 200 μL 1% TFA. Waschen Sie die Extraktionsplatte erneut mit 200 μL 1% TFA mit 2% MeOH (v/v). Halten Sie die Strömungsgeschwindigkeit niedriger als 3 Tröpfchen/s.
  4. Ersetzen Sie die Sammelplatte durch eine Sammelplatte mit 96 Vertiefungen. Wenn keine Fraktionierung erforderlich ist, eluieren Sie die Peptidproben 3x mit 100 μL 1% TFA mit 80% MeOH und mischen Sie sie in einem neuen Probenröhrchen. Trocknen Sie die Peptidproben in einem Vakuumkonzentrator ohne Hitze.
    HINWEIS: Wenn eine Fraktionierung gewünscht wird, können Peptidproben anschließend in 4 Fraktionen eluiert werden, wobei 200 μL 1% TFA mit 15%, 35%, 50% bzw. 90% MeOH in einer anderen Sammelplatte verwendet werden.

7. Kolorimetrischer Peptidquantifizierungstest (fakultativ) (1 h)

  1. Resuspendieren Sie Peptidproben in 50 μL LC-MS-Wasser und nehmen Sie 20 μL Aliquots, um den Peptidtest durchzuführen.
    HINWEIS: Dieser Schritt verbraucht eine große Menge an Peptidproben, kann aber eine genaue Quantifizierung der Peptidkonzentration vor der LC-MS-Analyse liefern. Dies wird in der Regel nur einmal pro Probentyp für Tests vor der großflächigen Probenvorbereitung durchgeführt.
  2. Herstellen serieller Verdünnungen der Peptidstandardlösungen (im kolorimetrischen Assay-Kit enthalten) in LC-MS-Wasser. Bereiten Sie das Arbeitsreagenz vor, indem Sie 50% Reagenz A, 48% Reagenz B und 2% Reagenz C mischen.
  3. 20 μL jeder Peptidstandardlösung (drei Replikate) und die unbekannte Peptidprobe werden in eine 96-Well-Mikroplatte überführt. Geben Sie 180 μL des Arbeitsreagenzes in jede Vertiefung, mischen Sie gut und inkubieren Sie die Platte für 30 min bei RT.
  4. Lesen Sie die Absorption bei 480 nm in einem Mikrotiterplatten-Reader ab und quantifizieren Sie die Konzentrationen von Peptidproben basierend auf der Peptidstandardkurve.

8. LC-MS-Analyse

  1. Resuspendieren Sie die Peptidproben in LC-Puffer A (2% Acetonitril und 0,1% Ameisensäure, LC-MS-Qualität). Zentrifugieren Sie bei 16.500 × g für 10 min bei 4 °C, um mögliche Partikel zu entfernen.
  2. Übertragen Sie den Überstand in LC-MS-Durchstechflaschen. Analysieren Sie die Proben mit einem nanoLC-MS-Gerät.
    HINWEIS: Detaillierte LC-MS/MS-Parameter sind geräteabhängig und wurden zuvor22,25,26 beschrieben.
  3. Generieren Sie eine benutzerdefinierte LC-MS-Ausschlussliste mit einer Reihe von Retentionszeiten für sehr häufige kontaminierende Peptidpeaks wie Streptavidin und Trypsin mit einer Massengenauigkeit von 5 ppm 22 (z. B. sind häufige Streptavidinpeptidpeaks m/z 402,5435 [Ladung 3], m/z 603,3117 [Ladung 2], m/z 654,9733 [Ladung 3], m/z 678,6812 [Ladung 3], m/z 1017,5182 [Ladung 2], etc.; Häufige Trypsinpeptid-Peaks sind M/Z 421,7584 [Ladung 2], M/Z 523,2855 [Ladung 2] und M/Z 737,7062 [Ladung 3]).

9. Proteomik-Datenanalyse

  1. Analysieren Sie die LC-MS-Rohdaten mit Proteomik-Datenanalysesoftware wie Proteome Discoverer, MaxQuant27 oder MS-Fragger28. Fügen Sie zwei FASTA-Bibliotheken für die Datenanalyse hinzu: 1) eine Swissprot Homo Sapiens-Referenzdatenbank ; 2) eine neu generierte universelle Schadstoff-FASTA-Bibliothek (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), die nachweislich die Identifizierung der Proteomik verbessert und falsche Entdeckungen verringert29.
  2. Richten Sie die Proteomik-Datenanalyseparameter mit einem FDR-Cutoff (False Discovery Rate) von 1% für Protein- und Peptidspektralvergleichsidentifikationen (PSM) ein. Wählen Sie den Trypsinaufschluss mit maximal drei verpassten Spaltungen, einer festen Modifikation der Cysteincarbamidomethylierung und einer variablen Modifikation der Methioninoxidation und der Protein-N-terminalen Acetylierung. Verwenden Sie Peptid-MS1-Spitzenintensitäten für eine markierungsfreie Quantifizierung. Normalisieren Sie die Peptidintensitäten auf die endogen biotinylierte Carboxylase, Propionyl-CoA-Carboxylase (PCCA), um Variationen der Proximity-Markierung zu reduzieren, wie zuvor beschrieben22.
    HINWEIS: Die PCCA-Normalisierung kann in der Proteome Discoverer-Software ausgewählt werden, indem eine PCCA-Proteinsequenz-FASTA-Datei eingeschlossen wird. Alternativ kann eine PCCA-Normalisierung in der nachgelagerten Datenanalyse durchgeführt werden.
  3. Exportieren Sie Ergebnisse auf Proteinebene aus der Proteomik-Software. Entfernen Sie kontaminierende Proteine vor der statistischen Analyse29. Entfernen Sie Proteine mit nur 1 PSM oder ohne Quantifizierungsergebnis. Führen Sie eine Protein-Gen-Ontologie (GO)-Termanalyse mit Enrichr30 und Proteinnetzwerkanalyse mit STRING31 durch.

Ergebnisse

Diese Lysosomen-Proximity-Markierungs-Proteomik-Studie wurde an humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen durchgeführt, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in situ in lebenden Neuronen zu erfassen. Zellmorphologien von hiPSCs und hiPSC-abgeleiteten Neuronen zu verschiedenen Zeitpunkten sind in Abbildung 2A dargestellt. Humane iPSCs wachsen in Kolonien in E8-Medium. Die Differenzierung wird eingeleitet, indem iPSCs in Doxycyclin-haltiges Neuroneninduktionsmedium plattiert werden. Ne...

Diskussion

Mit dieser LAMP1-APEX-Sonde werden Proteine auf und in der Nähe der lysosomalen Membran biotinyliert und angereichert. Angesichts des typischen Lysosomendurchmessers von 100-1.200 nm bietet diese Methode eine hervorragende intrazelluläre Auflösung mit einem Markierungsradius von 10-20 nm. LAMP1 ist ein reichlich vorhandenes lysosomales Membranprotein und ein klassischer Marker für Lysosomen, der als hervorragendes Köderprotein für die lysosomale APEX-Markierung auf endogener Expressionsebene dient. Einschränkungen...

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Diese Studie wird durch den NIH-Zuschuss (R01NS121608) unterstützt. A.M.F. dankt dem ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship und dem Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Wir danken dem Michael Ward Labor am National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) für die molekularbiologische Unterstützung und die Entwicklung der i3Neuron-Technologie.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
10% (w/v) Saponin solutionAcros Organics419231000Flourescent Microscopy
AccutaseLife TechnologiesA1110501cell detachment solution, Cell Culture
B27 SupplementFisher Scientific17504044Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNFPeproTech450-02Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acidSigma-AldrichB6768Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA8806To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal mediumSTEMCELL Technologies5790Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561Thermo Fisher Scientific505-0452-82Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitorTocris716310Cell Culture
cOmplete mini Protease InhibitorRoche4693123001cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit IIBio-Rad5000112To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11320082Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPESThermo Fisher Scientific11330057Cell Culture, Induction Medium
Donkey serumSigma-AldrichD9663Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC)Sigma-AldrichD9891-1GCell Culture, Induction Medium
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kitWatersWAT097944For Peptide desalting
Formic Acid (FA)Fisher ScientificA11750For LC-MS analysis
GDNFPeproTech450-10Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dyeThermo Fisher Scientific62239Flourescent Microscopy
HPLC grade methanolFisher ScientificA452For Peptide desalting
HPLC grade waterFisher ScientificW5For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cellsCorriell InstituteGM25256Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.Thermo Fisher ScientificAA33323ADProximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA)Millipore SigmaI6125For Protein Digestion
LamininFisher Scientific23017015Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade AcetonitrileFisher ScientificA955For LC-MS analysis
LC-MS grade waterFisher ScientificW64For LC-MS analysis
L-glutamineFisher Scientific25-030-081Cell Culture, Induction Medium
MatrigelThermo Fisher Scientific08-774-552basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bankh4a3Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x)Fisher Scientific17-502-048Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cmBio-Rad1620145To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA)Fisher Scientific11-140-050Cell Culture, Induction Medium
NT-3PeproTech450-03Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plateWaters186000309For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS)LI-COR Biosciences927-50000To conduct dot blot assay for bead titration
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock)Adipogen41994-02-9Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesiumGibco10010049Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Fisher23275Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO)Millipore SigmaP3655Cell Culture, Dish Coating
Sodium AscorbateSigma-AldrichA4034Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azideSigma-AldrichS8032Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificS271500Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Thermo Fisher ScientificBP1311220Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxideSigma-Aldrich415413Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborateSigma-Aldrich221732Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentratorvacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose BeadsCytiva (formal GE)28-9857-99Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 ConjugateThermo Fisher ScientificS32358To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixertemperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA)Millipore Sigma302031For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Millipore SigmaC4706For Protein Digestion
Tris-HClThermo Fisher ScientificBP152500Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-XThermo Fisher ScientificBP151500Beads wash buffer
TROLOXSigma-Aldrich648471Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5073For Protein Digestion
TWEEN 20Millipore SigmaP1379Dot blot assay buffer
UreaThermo Fisher ScientificBP169500Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
VitronectinSTEMCELL Technologies7180Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitorSelleckS1049Cell Culture

Referenzen

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