Caractérisation de l’interactome du lysosome neuronal avec protéomique de marquage de proximité

Résumé

Un protocole protéomique de marquage de proximité des lysosomes neuronaux est décrit ici pour caractériser le microenvironnement lysosomal dynamique dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Les protéines de la membrane lysosomale et les protéines qui interagissent avec les lysosomes (de manière stable ou transitoire) peuvent être quantifiées avec précision dans cette méthode avec une excellente résolution spatiale intracellulaire dans les neurones humains vivants.

Résumé

Les lysosomes communiquent fréquemment avec une variété de biomolécules pour obtenir la dégradation et d’autres fonctions cellulaires diverses. Les lysosomes sont essentiels au fonctionnement du cerveau humain, car les neurones sont postmitotiques et dépendent fortement de la voie autophagie-lysosome pour maintenir l’homéostasie cellulaire. Malgré les progrès réalisés dans la compréhension de diverses fonctions lysosomales, la capture des communications hautement dynamiques entre les lysosomes et d’autres composants cellulaires est techniquement difficile, en particulier à haut débit. Ici, un protocole détaillé est fourni pour la méthode protéomique de marquage de proximité des lysosomes endogènes (knock-in) récemment publiée dans les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC).

Les protéines de la membrane lysosomale et les protéines entourant les lysosomes dans un rayon de 10 à 20 nm peuvent être identifiées avec confiance et quantifiées avec précision dans les neurones humains vivants. Chaque étape du protocole est décrite en détail, c’est-à-dire la culture de neurones hiPSC, le marquage de proximité, la récolte de neurones, la microscopie à fluorescence, l’enrichissement en protéines biotinylées, la digestion des protéines, l’analyse LC-MS et l’analyse des données. En résumé, cette méthode protéomique de marquage de proximité lysosomale endogène unique fournit un outil analytique robuste et à haut débit pour étudier les activités lysosomales hautement dynamiques dans les neurones humains vivants.

Introduction

Les lysosomes sont des organites cataboliques qui dégradent les macromolécules par la voie lysosomale-autophagie¹. Outre la dégradation, les lysosomes sont impliqués dans diverses fonctions cellulaires telles que la transduction de signalisation, la détection des nutriments et la sécrétion ^2,3,4. Les perturbations de la fonction lysosomale ont été impliquées dans les troubles du stockage lysosomal, le cancer, le vieillissement et la neurodégénérescence 3,5,6,7. Pour les neurones postmitotiques et hautement polarisés, les lysosomes jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie cellulaire neuronale, la libération de neurotransmetteurs et le transport à longue distance le long des axones 8,9,10,11. Cependant, l’étude des lysosomes dans les neurones humains a été une tâche difficile. Les progrès récents dans les technologies neuronales dérivées de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ont permis la culture de neurones humains vivants qui étaient auparavant inaccessibles, comblant le fossé entre les modèles animaux et les patients humains pour étudier le cerveau humain^12,13. En particulier, la technologie avancéeⁱ³Neuron intègre de manière stable le facteur de transcription neurogénine-2 dans le génome iPSC sous un promoteur inductible par la doxycycline, conduisant les iPSCs à se différencier en neurones corticaux purs en 2 semaines^14,15.

En raison de l’activité lysosomale hautement dynamique, la capture des interactions lysosomales avec d’autres composants cellulaires est techniquement difficile, en particulier à haut débit. La technologie de marquage de proximité est bien adaptée à l’étude de ces interactions dynamiques en raison de sa capacité à capturer à la fois les interactions protéiques stables et transitoires/faibles avec une spécificité spatiale exceptionnelle^16,17. La peroxydase ou la biotine ligase modifiée peut être génétiquement fusionnée à la protéine appât. Lors de l’activation, des radicaux biotine hautement réactifs sont produits pour marquer de manière covalente les protéines voisines, qui peuvent ensuite être enrichies par des billes enrobées de streptavidine pour la protéomique ascendante en aval via des plateformes de chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) 17,18,19,20,21.

Une méthode protéomique de marquage de proximité lysosomale endogène a récemment été développée pour capturer le microenvironnement lysosomal dynamique dans i³neurones²². L’ascorbate peroxydase modifiée (APEX2) a été frappée sur l’extrémité C de la protéine membranaire lysosomale associée 1 (LAMP1) dans les CSPi, qui peut ensuite être différenciée en neurones corticaux. LAMP1 est une protéine membranaire lysosomale abondante et un marqueur lysosomal^{classique 23}. LAMP1 est également exprimé dans les endosomes tardifs, qui mûrissent en lysosomes; Ces endosomes-lysosomes tardifs et lysosomes non dégradants sont tous appelés lysosomes dans le présent protocole. Cette sonde endogène LAMP1-APEX, exprimée au niveau physiologique, peut réduire la mauvaise localisation et les artefacts de surexpression de LAMP1. Des centaines de protéines membranaires lysosomales et d’interacteurs lysosomaux peuvent être identifiés et quantifiés avec une excellente résolution spatiale dans des neurones humains vivants.

Ici, un protocole détaillé pour la protéomique de marquage de proximité des lysosomes dans les neurones humains dérivés de l’iPSC est décrit avec d’autres améliorations par rapport à la méthode²² récemment publiée. Le flux de travail global est illustré à la figure 1. Le protocole comprend la culture de neurones dérivée de hiPSC, l’activation du marquage de proximité dans les neurones, la validation de l’activité APEX par microscopie à fluorescence, la détermination d’un rapport optimal entre les billes de streptavidine et les protéines d’entrée, l’enrichissement des protéines biotinylées, la digestion des protéines sur les billes, le dessalage et la quantification des peptides, l’analyse LC-MS et l’analyse des données protéomiques. Les directives de dépannage et les optimisations expérimentales sont également abordées pour améliorer le contrôle qualité et les performances de l’étiquetage de proximité.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le comité de biosécurité et d’éthique de l’Université George Washington. Les compositions des milieux et des tampons utilisés dans ce protocole sont fournies dans le tableau 1. Les informations sur les produits commerciaux utilisées ici sont fournies dans le tableau des matériaux.

1. Culture de neurones humains dérivés de l’iPSC

1. Culture iPSC humaine et intégration de la sonde LAMP1-APEX (7 jours)
   1. Décongeler la solution mère de Matrigel dans un seau à glace à 4 °C pendant une nuit, aliquoter 500 μL de la solution dans des tubes stériles froids et stocker les aliquotes à −80 °C. Préparer 50 mL de solution de revêtement en ajoutant 500 μL du stock Matrigel dans 49,5 mL de milieu DMEM/F12 froid.
      REMARQUE: Gardez le Matrigel froid et utilisez des tubes coniques prérefroidis et des embouts de pipette pour empêcher la polymérisation. La solution de revêtement peut être conservée à 4 °C pendant 2 semaines.
   2. Enduire une capsule de culture cellulaire de 10 cm de 4 mL de solution d’enrobage pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C.
      REMARQUE : La vitronectine peut être une solution de revêtement alternative à une concentration de 5 μg/mL et un revêtement de 2 h pour la culture de CSPi. La vitronectine (composant protéique unique) est plus chère que Matrigel, mais a moins de variations de lots et de signaux de fond plus propres que Matrigel, qui est extrait de la tumeur de souris avec de nombreuses protéines de matrice extracellulaire. Une plaque de culture tissulaire non traitée est nécessaire pour l’enrobage de vitronectine. Le revêtement matriciel fonctionne pour les plaques de culture tissulaire traitées et non traitées.
   3. Décongeler et plaquer 1 à 3 millions de CSPhi sur chaque plat enrobé de 10 cm préchargé de 8 mL de milieu complet Essential E8 complété par un inhibiteur de ROCK (concentration finale 10 μM Y-27632 ou 50 nM Chroman1).
      REMARQUE: L’ajout d’un inhibiteur de ROCK (Y-27632 ou Chroman1) au milieu de culture de cellules souches minimise l’apoptose induite par la dissociation après la division et la conservation cryogénique. Chroman1 s’est récemment avéré plus puissant que Y-27632 pour inhiber à la fois ROCK1 et ROCK2²⁴.
   4. Passer à 10 mL de milieu complet E8 sans inhibiteur de ROCK après que les CSPi ont formé des colonies, généralement après 1-2 jours. Maintenir la culture iPSC dans un milieu complet E8 et remplacer le surnageant par un milieu frais tous les deux jours.
   5. Intégrer l’enzyme de marquage de proximité, l’ascorbate peroxydase (APEX2), dans l’extrémité C du gène endogène LAMP1 par ingénierie du génome CRISPR. Pour les étapes détaillées pour générer une lignée cellulaire stable modifiée, reportez-vous à la méthode précédemment publiée (Frankenfield et al). ²².
2. Différenciation iPSC-neurones humains (3 jours)
   1. Enduire une capsule de culture cellulaire de 10 cm pendant une nuit de 4 mL de solution d’enrobage Matrigel dans un incubateur à 37 °C avant la différenciation.
   2. Maintenir les CSPh jusqu’à ~70% de confluence. Lavez doucement les CSPh avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 2x pour éliminer les cellules mortes. Aspirer le PBS et ajouter 3 ml d’Accutase à la boîte de cellules de 10 cm. Agiter l’assiette pour une répartition uniforme et incuber pendant 8 min dans un incubateur à 37 °C.
   3. Ajouter 2 mL de PBS pour laver et soulever les cellules de la plaque et recueillir toute la solution cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Enduire les cellules par centrifugation à 300 × g pendant 5 min. Plaquette 2-4 × 10⁶ hiPSCs sur une plaque recouverte de matrigel préchargée de 8 mL de milieu d’induction neuronale chaud (tableau 1). Répartir uniformément les cellules et les placer dans un incubateur à 37 °C.
      REMARQUE: La différenciation des neurones est entraînée par un facteur de transcription inductible par la doxycycline, la neurogénine-2 (NGN2), qui a été surexprimé dans cette lignée cellulaire stable^{hiPSC 15}.
   4. Lavez doucement les CSPh avec du PBS le jour 1 de la différenciation pour éliminer les débris de cellules mortes. Remplacer par 10 ml de milieu d’induction chaud sans inhibiteur de ROCK.
   5. Changez avec un milieu d’induction chaud sans inhibiteur de ROCK tous les jours jusqu’au jour 3 de la différenciation.
      REMARQUE: Les neurones sont prêts à être replaqués dans le milieu neuronal.
3. Placage des neurones et maintien de la culture des neurones (10 jours)
   1. Préparer 0,1 mg/mL de solution d’enrobage de poly-L-Ornithine (PLO) dans un tampon de borate (tableau 1).
   2. Enduire une boîte de culture cellulaire de la solution d’enrobage PLO dans un incubateur à 37 °C pendant au moins 1 h ou toute la nuit avant le placage des neurones du jour 3. Lavez le plat avec 4 ml d’eau stérile trois fois et laissez-le sécher complètement à l’air libre à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité.
   3. Dissocier les neurones du jour 3 de chaque boîte de 10 cm avec 3 ml d’Accutase et plaquer 8 à 10 millions de cellules sur chaque boîte de 10 cm recouverte d’OLP préchargée de milieu neuronal cortical chaud (tableau 1).
   4. Effectuer un changement demi-moyen tous les 2-3 jours avec un milieu neuronal chaud jusqu’à ce que les³neurones i atteignent leur maturation dans les 2 semaines suivant la différenciation.

2. Marquage de proximité in situ et lyse neuronale (2 h)

1. Préparer 500 mM de solution mère de biotine-phénol (BP) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) et conserver à −20 °C. Le jour du marquage de proximité, diluer la solution mère de BP avec un milieu neuronal chaud et traiter les neurones à une concentration finale de 500 μM pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C.
   REMARQUE: La doxycycline est ajoutée dans le milieu neuronal, ce qui activera l’expression enzymatique APEX. La doxcycline doit être ajoutée au moins 24 heures avant l’expérience de marquage de proximité.
2. Initier la réaction de marquage en ajoutant_H2O2à une concentration finale de 1 mM dans la culture de neurones et incuber pendant exactement 1 min. Aspirer immédiatement le milieu et rincer 3 fois avec un tampon de trempe (tableau 1).
   NOTE: Lasolution H 2 O₂ doit être fraîche avant la réaction d’étiquetage. L’activation de H 2 O 2 doit être exactement 1 min pour réduire la variation expérimentale et minimiser le stress oxydatif causé par un traitement prolongéH_2O2.
3. Inclinez la plaque pour aspirer tout le tampon résiduel. Ajoutez un tampon de lyse cellulaire glacé (Tableau 1) directement sur la plaque neuronale. Utilisez 100 μL de tampon de lyse cellulaire pour 1 million de neurones. Remuez la plaque pour une lyse cellulaire suffisante et placez-la sur de la glace.
4. Grattez les lysats cellulaires dans des tubes froids de 1,5 mL. Sonicer dans un bain-marie glacé à l’aide d’un sonicateur de bain (>100 W) pendant 15 min en alternant 40 s et 20 s hors cycles.
   REMARQUE: Une solution protéique suffisamment lysée doit être limpide sans granulés ni bulles excessives. Une sonication suffisante du lysat cellulaire est cruciale pour cisailler les acides nucléiques et réduire la viscosité du lysat cellulaire afin de réduire la liaison non spécifique dans les procédures en aval. Un sonicateur de sonde peut également être utilisé pour fournir une lyse cellulaire plus forte et plus rapide, mais le lavage de la sonde entre les échantillons est nécessaire pour minimiser la contamination croisée et la perte d’échantillons.
5. Ajouter de l’acétone froide (−20 °C) à l’échantillon à un volume de tampon de lyse multiplié par 4. Vortex brièvement et incuber à −20 °C pendant 3 h.
6. Centrifuger à 16 500 × g pendant 10 min à 2 °C. Retirer le surnageant sans déranger la pastille de protéine. Laver la pastille avec 1 mL d’acétone −20 °C 2x et retirer le surnageant après centrifugation.
7. Sécher la pastille de protéine avec un concentrateur sous vide pendant 1 min. Ajouter un tampon de lyse cellulaire pour dissoudre complètement la pastille. Soniquer brièvement si nécessaire. Conserver les échantillons à −80 °C.
   REMARQUE : La précipitation de l’acétone peut éliminer les résidus de biotine-phénol dans l’échantillon, ce qui peut interférer avec l’enrichissement en aval des protéines biotinylées.

3. Microscopie à fluorescence pour valider la localisation et l’activité de l’APEX (1,5 jour)

1. Incuber lesⁱ³neurones exprimant LAMP1-APEX endogène avec 500 μM BP pendant 30 min à 37 °C. Activer le marquage avec un traitement 1 mM_H2O22pendant seulement 1 s pour limiter la diffusion du nuage de biotine.
2. Fixez immédiatement les cellules avec 4% de paraformaldéhyde dans le tampon de trempe et lavez doucement 3x avec du PBS.
   NOTE: Pour un plat de 10 cm, 4-6 mL est nécessaire pour un lavage suffisant.
3. Bloquer et perméabiliser les cellules en utilisant 3% de sérum d’ânesse et 0,1% de saponine dans du PBS pendant 30 min à température ambiante (RT).
4. Incuber les cellules avec l’anticorps anti-LAMP1 primaire (souris monoclonale H3A4, 1:1 000) pendant une nuit à 4 °C.
5. Lavez les neurones 3 x doucement avec PBS. Incuber les neurones avec l’anticorps secondaire anti-souris AF561 (1:1 000) et la streptavidine-680 (1:1 000) pendant 1 h à TA.
6. Laver 2x avec PBS et incuber avec Hoechst ou le marqueur nucléaire 4',4-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 10 min à TA. Rincer les cellules 2x avec du PBS.
7. Visualisez les neurones fixes sous un microscope à fluorescence. Observer les protéines biotinylées colorées à la streptavidine et colocalisées avec la coloration LAMP1 à l’extérieur du noyau pour valider l’emplacement correct de l’activité APEX.

4. Détermination du rapport perles/protéines d’entrée des billes de streptavidine (1,5 jour)

1. Effectuer un dosage des protéines compatibles avec les détergents (DCA) pour déterminer les concentrations totales de protéines dans les lysats cellulaires
   1. Dissoudre l’étalon protéique de l’albumine sérique bovine (BSA) dans le tampon de lyse cellulaire à une concentration de 4 mg/mL. Préparer une série de solutions étalons de protéines BSA (0,2-2 mg/mL, 5 dilutions) en utilisant le tampon de lyse cellulaire.
   2. Transférer 5 μL de chaque échantillon de protéines, solution étalon de protéine BSA et tampon de lyse à cellules blanches en triple dans chaque puits dans une plaque de 96 puits.
   3. Ajouter 2 μL de réactif S par 1 mL de réactif A pour obtenir le réactif A'. Ajouter 25 μL de réactif A' à chaque puits. Ajouter 200 μL de réactif B à chaque puits. Mélangez et faites éclater les bulles si présentes.
   4. Incuber cette plaque de 96 puits à TA pendant 15 min, lire l’absorbance à 750 nm dans un lecteur de microplaques et quantifier les concentrations d’échantillons de protéines en fonction de la courbe standard BSA.
2. Titrage des billes test de transfert de points (1,5 jours)
   1. Transférer une série de boues magnétiques de billes de streptavidine (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) dans des tubes en bandelettes PCR. Placez les tubes de bande PCR sur une grille magnétique, lavez les billes 3x avec 100 μL de tampon SDS à 2% et retirez complètement le tampon de lavage sur le rack magnétique.
   2. Ajouter 50 μg d’échantillon de protéines dans chaque tube. Ajouter plus de tampon de lyse pour un volume total de 80 μL. Fermer fermement chaque tube et tourner à 4 °C pendant la nuit.
   3. Centrifuger brièvement les tubes de bandelettes PCR sur une microcentrifugeuse de paillasse. Placez les tubes de bande PCR sur un rack magnétique pendant 1 min. Repérez 2 μL de surnageant de chaque tube sur une membrane sèche de nitrocellulose et laissez la membrane sécher complètement.
      REMARQUE: Si l’intensité du signal est faible, plus de 2 μL peuvent être repérés sur la membrane. Le volume peut être augmenté en repérant plusieurs fois au même endroit après que la membrane a été séchée à l’air entre chaque fois. Un appareil Bio-Dot peut également être utilisé.
   4. Incuber la membrane dans un tampon de blocage (TBS) pendant 1 h. Incuber la membrane dans le conjugué Streptavidin Alexa Fluor 680 (1:1 000 dans le tampon de blocage) pendant 1 h. Ensuite, lavez la membrane avec TBS-T (tableau 1) 5x.
      REMARQUE : Une solution de rechange au test par transfert à points est le transfert Western à l’aide d’un anticorps anti-streptavidine.
   5. Mesurez le signal fluorescent de chaque point de la membrane sous la longueur d’onde de 680 nm et générez un nuage de points avec un signal fluorescent sur le volume des billes. Sélectionnez le volume optimal de billes nécessaire pour 50 μg d’échantillon de protéines d’entrée en fonction de l’endroit où la décroissance exponentielle de la courbe se termine.
      NOTE: L’intensité de fluorescence représente l’abondance de protéines biotinylées dans le surnageant, qui devrait diminuer avec l’augmentation des quantités de billes.

5. Enrichissement des protéines biotinylées et digestion sur billes (3 jours)

1. Transférer les échantillons de lysat de protéines à −80 °C et sonifier les échantillons dans des tubes de 1,5 mL pendant 30 s dans un sonicateur de bain pour décongeler rapidement les solutions. Vortex et placer les tubes d’échantillon sur de la glace.
2. Transfèrent 250 μL de boue magnétique de billes de streptavidine (SA) dans chaque tube de 1,5 mL. Placez les tubes sur une grille magnétique, lavez les billes 3x avec 1 ml de tampon de lavage A (SDS à 2 %) et retirez le tampon résiduel.
3. Sur la base des résultats du test par transfert de points et du test de protéine DC, calculer la quantité d’échantillon de protéines (μg) nécessaire pour 250 μL de suspension de billes magnétiques de streptavidine.
   REMARQUE : Dans cette sonde LAMP1-APEX exprimée de manière endogène, 5 μL de billes sont nécessaires pour 50 μg de protéines d’entrée. Par conséquent, 2,5 mg de protéines totales sont ajoutés à 250 μL de billes. Moins de 250 μL de billes d’AS peuvent être utilisées pour un échantillon d’entrée limité.
4. Ajouter un tampon de lyse cellulaire au tube contenant le mélange perle-lysat magnétique jusqu’à un volume total de 1 mL et faire tourner à 4 °C pendant une nuit.
   REMARQUE : Les échantillons provenant de différents groupes ou répétitions doivent être normalisés à la même concentration de protéines, au même volume et à la même quantité de billes afin de réduire les variations expérimentales.
5. Faites tourner brièvement tous les tubes sur une microcentrifugeuse de paillasse et placez les tubes sur un support magnétique pendant 1 min. Retirez le surnageant lorsque vous êtes sur le rack magnétique.
   REMARQUE: Il est essentiel d’attendre 1 minute après avoir placé les tubes d’échantillon sur le rack magnétique à chaque fois. Cela peut minimiser la perte de billes due à la petite quantité invisible de billes qui se déplace toujours vers l’aimant dans la solution.
6. Lavez les billes 2x avec 1 mL de tampon de lavage A à TA (rotation de 5 min à chaque fois). Répétez le processus avec chaque tampon de lavage 2x séquentiellement à 4 °C. (Tampon B, Tampon C et Tampon D ; Tableau 1).
   NOTE: Une concentration élevée de solution SDS peut précipiter à des températures froides. Le premier lavage doit être effectué à RT.
7. Placez les tubes sur le rack magnétique. Lavez les perles 2x avec le tampon D pour éliminer complètement les résidus de détergent. Resuspendre les billes dans 100 μL de tampon Tris 50 mM et ajouter 5 mM de TCEP (concentration finale) pour incuber pendant 30 min à 37 °C dans un mélangeur à température contrôlée, en agitant à 1 200 tr/min.
8. Ajouter 15 mM d’iodoacétamide (AIA, concentration finale) dans chaque tube et incuber pendant 30 min à 37 °C dans un mélangeur à température contrôlée, en agitant à 1 200 tr/min dans l’obscurité (bouchon du mélangeur activé).
   REMARQUE: L’IAA est sensible à la lumière et doit être renouvelé 5 minutes avant cette étape.
9. Ajouter 5 mM de PTCE (concentration finale) pour éteindre l’excès d’AIA. Incuber pendant 10 min à 37 °C dans un mélangeur à température contrôlée en agitant à 1 200 tr/min (bouchon du mélangeur désactivé).
10. Centrifuger brièvement les tubes d’échantillon et placer sur une grille magnétique pendant 1 min pour retirer le surnageant. Ajouter 200 μL de PTCE 5 mM dans un tampon Tris 50 mM pour remettre les billes en suspension. Ajouter 1 μg de mélange trypsine/Lys-C à l’échantillon et incuber pendant 14 h à 37 °C dans un mélangeur à température contrôlée, en agitant à 1 200 tr/min.
11. Ajouter 0,2 μg supplémentaire de mélange trypsine/Lys-C et digérer pendant 3 h.
12. Faites tourner brièvement les tubes d’échantillon et placez-les sur une grille magnétique pendant 1 min. Transférez le surnageant peptidique pour nettoyer les tubes sur un support magnétique. Laver les billes avec 50 μL de tampon Tris 50 mM (en agitant pendant 5 min) et combiner les surnageants peptidiques.
13. Ajouter 30 μL d’acide trifluoroacétique (TFA) à 10% dans le tube contenant le surnageant peptidique pour obtenir un pH <3.

6. Dessalage et fractionnement des peptides (2 h)

1. Mouiller la plaque d’extraction en phase solide en phase inverse (uniquement les puits à utiliser) avec 200 μL de méthanol de qualité CLHP (MeOH) 3x sur le collecteur à vide. Ajouter 200 μL de TFA à 1% dans de l’eau de qualité CLHP 3x pour équilibrer la plaque.
2. Chargez les échantillons de peptides dans la plaque, en tournant lentement le vide pour une vitesse d’écoulement inférieure à 3 gouttelettes / s afin de minimiser la perte d’échantillon.
3. Laver la plaque d’extraction 3x avec 200 μL de TFA à 1%. Laver à nouveau la plaque d’extraction avec 200 μL de TFA à 1% contenant 2% de MeOH (v/v). Maintenez la vitesse d’écoulement inférieure à 3 gouttelettes/s.
4. Remplacez la plaque de collecte par une plaque de collecte de 96 puits. Si aucun fractionnement n’est nécessaire, éluer les échantillons de peptides 3x avec 100 μL de TFA à 1% contenant 80% de MeOH et combiner dans un nouveau tube à échantillon. Sécher les échantillons de peptides dans un concentrateur sous vide sans chaleur.
   REMARQUE: Si le fractionnement est souhaité, les échantillons de peptides peuvent être élués en 4 fractions en utilisant ensuite 200 μL de TFA à 1% contenant 15%, 35%, 50% et 90% de MeOH, respectivement, dans une plaque de collecte différente.

7. Dosage de quantification colorimétrique des peptides (facultatif) (1 h)

1. Resuspendre les échantillons de peptides dans 50 μL d’eau de qualité LC-MS et prendre 20 μL aliquotes pour effectuer le dosage peptidique.
   REMARQUE: Cette étape consomme une grande quantité d’échantillon de peptide, mais peut fournir une quantification précise de la concentration peptidique avant l’analyse LC-MS. Cette opération n’est généralement effectuée qu’une seule fois par type d’échantillon pour les analyser avant la préparation de l’échantillon à grande échelle.
2. Préparer les dilutions en série des solutions étalons peptidiques (fournies dans le kit de dosage colorimétrique) dans l’eau de qualité LC-MS. Préparez le réactif de travail en mélangeant 50% du réactif A, 48% du réactif B et 2% du réactif C.
3. Transférer 20 μL de chaque solution étalon peptidique (trois réplications) et l’échantillon de peptide inconnu dans une microplaque de 96 puits. Ajouter 180 μL du réactif de travail à chaque puits, bien mélanger et incuber la plaque pendant 30 minutes à TA.
4. Lire l’absorbance à 480 nm dans un lecteur de microplaques et quantifier les concentrations d’échantillons peptidiques en fonction de la courbe standard peptidique.

8. Analyse LC-MS

1. Resuspendre les échantillons peptidiques dans le tampon A LC (2 % d’acétonitrile et 0,1 % d’acide formique, grade LC-MS). Centrifuger à 16 500 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les particules éventuelles.
2. Transférer le surnageant dans des flacons de LC-MS. Analysez les échantillons à l’aide d’un instrument nanoLC-MS.
   NOTE: Les paramètres LC-MS/MS détaillés dépendent de l’instrument et ont été décrits précédemment^22,25,26.
3. Générer une liste d’exclusion LC-MS personnalisée avec une plage de temps de rétention pour les pics de peptides contaminants très abondants tels que la streptavidine et la trypsine avec une précision massique de 5 ppm 22 (par exemple, les pics courants de peptides de streptavidine sont m/z 402,5435 [charge 3], m/z 603,3117 [charge 2], m/z 654,9733 [charge 3], m/z 678,6812 [charge 3], m/z 1017,5182 [charge 2], etc.; Les pics de peptide de trypsine courants sont M/Z 421.7584 [charge 2], m/z 523.2855 [charge 2] et m/z 737.7062 [charge 3]).

9. Analyse des données protéomiques

1. Analysez les données brutes LC-MS avec un logiciel d’analyse de données protéomique tel que Proteome Discoverer, MaxQuant²⁷ ou MS-Fragger²⁸. Inclure deux bibliothèques FASTA pour l’analyse des données: 1) une base de données de référence Swissprot Homo Sapiens ; 2) une bibliothèque universelle de contaminants FASTA (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib) nouvellement générée, dont il a été prouvé qu’elle améliorait l’identification protéomique et réduisait les fausses découvertes²⁹.
2. Configurez les paramètres d’analyse des données protéomiques avec un seuil de 1 % du taux de fausses découvertes (FDR) pour les identifications de correspondance spectrale des protéines et des peptides (PSM). Sélectionnez la digestion de la trypsine avec un maximum de trois clivages manqués, une modification fixe de la carbamidométhylation de la cystéine et une modification variable de l’oxydation de la méthionine et de l’acétylation N-terminale des protéines. Utilisez les intensités maximales du peptide MS1 pour une quantification sans marquage. Normaliser les intensités peptidiques à la carboxylase biotinylée endogène, la propionyl-CoA carboxylase (PCCA), afin de réduire les variations de marquage de proximité, comme décrit précédemment²².
   REMARQUE: La normalisation PCCA peut être sélectionnée dans le logiciel Proteome Discoverer en incluant un fichier FASTA de séquence de protéines PCCA. Alternativement, la normalisation PCCA peut être effectuée dans l’analyse des données en aval.
3. Exportez les résultats au niveau des protéines à partir du logiciel de protéomique. Éliminer les protéines contaminantes avant l’analyse statistique²⁹. Éliminer les protéines avec seulement 1 PSM ou aucun résultat de quantification. Effectuez une analyse à terme d’ontologie de gènes protéiques (GO) avec Enrichr³⁰ et une analyse de réseau de protéines avec STRING³¹.

Résultats

Cette étude protéomique de marquage de proximité des lysosomes a été menée dans des neurones humains dérivés de l’iPSC pour capturer le microenvironnement lysosomal dynamique in situ dans les neurones vivants. Les morphologies cellulaires des neurones dérivés des CSPhi et des CSPh à différents moments sont illustrées à la figure 2A. Les CSPi humaines poussent en colonies en milieu E8. La différenciation est initiée en placant les CSPi dans un milieu d’induction n...

Discussion

À l’aide de cette sonde LAMP1-APEX, les protéines sur et près de la membrane lysosomale sont biotinylées et enrichies. Compte tenu du diamètre typique du lysosome de 100 à 1 200 nm, cette méthode offre une excellente résolution intracellulaire avec un rayon de marquage de 10 à 20 nm. LAMP1 est une protéine membranaire lysosomale abondante et un marqueur classique pour les lysosomes, servant d’excellente protéine appât pour le marquage APEX lysosomal au niveau de l’expression endogène. Cependant, il exi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% (w/v) Saponin solution	Acros Organics	419231000	Flourescent Microscopy
Accutase	Life Technologies	A1110501	cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement	Fisher Scientific	17504044	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF	PeproTech	450-02	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A8806	To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium	STEMCELL Technologies	5790	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561	Thermo Fisher Scientific	505-0452-82	Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor	Tocris	716310	Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor	Roche	4693123001	cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000112	To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium	Thermo Fisher Scientific	11320082	Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330057	Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663	Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit	Waters	WAT097944	For Peptide desalting
Formic Acid (FA)	Fisher Scientific	A11750	For LC-MS analysis
GDNF	PeproTech	450-10	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye	Thermo Fisher Scientific	62239	Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol	Fisher Scientific	A452	For Peptide desalting
HPLC grade water	Fisher Scientific	W5	For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells	Corriell Institute	GM25256	Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.	Thermo Fisher Scientific	AA33323AD	Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA)	Millipore Sigma	I6125	For Protein Digestion
Laminin	Fisher Scientific	23017015	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile	Fisher Scientific	A955	For LC-MS analysis
LC-MS grade water	Fisher Scientific	W64	For LC-MS analysis
L-glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	Cell Culture, Induction Medium
Matrigel	Thermo Fisher Scientific	08-774-552	basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	h4a3	Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x)	Fisher Scientific	17-502-048	Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm	Bio-Rad	1620145	To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA)	Fisher Scientific	11-140-050	Cell Culture, Induction Medium
NT-3	PeproTech	450-03	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate	Waters	186000309	For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS)	LI-COR Biosciences	927-50000	To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock)	Adipogen	41994-02-9	Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium	Gibco	10010049	Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Fisher	23275	Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO)	Millipore Sigma	P3655	Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride	Thermo Fisher Scientific	S271500	Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Thermo Fisher Scientific	BP1311220	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413	Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732	Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator			vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads	Cytiva (formal GE)	28-9857-99	Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	S32358	To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer			temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA)	Millipore Sigma	302031	For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Millipore Sigma	C4706	For Protein Digestion
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	BP152500	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X	Thermo Fisher Scientific	BP151500	Beads wash buffer
TROLOX	Sigma-Aldrich	648471	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade	Promega	V5073	For Protein Digestion
TWEEN 20	Millipore Sigma	P1379	Dot blot assay buffer
Urea	Thermo Fisher Scientific	BP169500	Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin	STEMCELL Technologies	7180	Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor	Selleck	S1049	Cell Culture