Caratterizzazione dell'interattoma del lisosoma neuronale con proteomica di marcatura di prossimità

Riepilogo

Un protocollo di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma neuronale è descritto qui per caratterizzare il microambiente lisosomiale dinamico nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Le proteine lisosomiali di membrana e le proteine che interagiscono con i lisosomi (stabilmente o transitoriamente) possono essere quantificate con precisione in questo metodo con un'eccellente risoluzione spaziale intracellulare nei neuroni umani vivi.

Abstract

I lisosomi comunicano frequentemente con una varietà di biomolecole per ottenere la degradazione e altre diverse funzioni cellulari. I lisosomi sono fondamentali per la funzione cerebrale umana, poiché i neuroni sono postmitotici e dipendono fortemente dalla via autofagia-lisosoma per mantenere l'omeostasi cellulare. Nonostante i progressi nella comprensione delle varie funzioni lisosomiali, catturare le comunicazioni altamente dinamiche tra i lisosomi e altri componenti cellulari è tecnicamente impegnativo, in particolare in modo ad alto rendimento. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per il metodo proteomico di marcatura di prossimità del lisosoma endogeno (knock-in) recentemente pubblicato nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC).

Sia le proteine della membrana lisosomiale che le proteine che circondano i lisosomi entro un raggio di 10-20 nm possono essere identificate con sicurezza e quantificate con precisione nei neuroni umani vivi. Ogni fase del protocollo è descritta in dettaglio, cioè coltura di neuroni hiPSC, etichettatura di prossimità, raccolta di neuroni, microscopia a fluorescenza, arricchimento proteico biotinilato, digestione proteica, analisi LC-MS e analisi dei dati. In sintesi, questo esclusivo metodo di proteomica di marcatura di prossimità lisosomiale endogena fornisce uno strumento analitico robusto e ad alto rendimento per studiare le attività lisosomiali altamente dinamiche nei neuroni umani vivi.

Introduzione

I lisosomi sono organelli catabolici che degradano le macromolecole attraverso la via lisosomiale-autofagica¹. Oltre alla degradazione, i lisosomi sono coinvolti in diverse funzioni cellulari come la trasduzione della segnalazione, il rilevamento dei nutrienti e la secrezione ^2,3,4. Perturbazioni nella funzione lisosomiale sono state implicate nei disturbi da accumulo lisosomiale, nel cancro, nell'invecchiamento e nella neurodegenerazione 3,5,6,7. Per i neuroni postmitotici e altamente polarizzati, i lisosomi svolgono un ruolo critico nell'omeostasi cellulare neuronale, nel rilascio di neurotrasmettitori e nel trasporto a lunga distanza lungo gli assoni 8,9,10,11. Tuttavia, studiare i lisosomi nei neuroni umani è stato un compito impegnativo. I recenti progressi nelle tecnologie dei neuroni derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno permesso alla coltura di neuroni umani vivi che in precedenza erano inaccessibili, colmando il divario tra modelli animali e pazienti umani per studiare il cervello umano^12,13. In particolare, l'avanzata tecnologia i³Neuron integra stabilmente il fattore di trascrizione della neurogenina-2 nel genoma iPSC sotto un promotore inducibile dalla doxiciclina, spingendo le iPSC a differenziarsi in neuroni corticali puri in 2 settimane^14,15.

A causa dell'attività lisosomiale altamente dinamica, catturare le interazioni lisosomiali con altri componenti cellulari è tecnicamente impegnativo, in particolare in modo ad alto rendimento. La tecnologia di etichettatura di prossimità è adatta allo studio di queste interazioni dinamiche grazie alla sua capacità di catturare interazioni proteiche sia stabili che transitorie/deboli con un'eccezionale specificità spaziale^16,17. La perossidasi ingegnerizzata o la biotina ligasi possono essere geneticamente fuse alla proteina esca. Al momento dell'attivazione, vengono prodotti radicali biotinici altamente reattivi per marcare covalentemente le proteine vicine, che possono quindi essere arricchite da perle rivestite di streptavidina per la proteomica bottom-up a valle tramite piattaforme di cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) 17,18,19,20,21.

Un metodo endogeno di proteomica di marcatura di prossimità lisosomiale è stato recentemente sviluppato per catturare il microambiente lisosomiale dinamico in i³Neuroni²². L'ascorbato perossidasi ingegnerizzata (APEX2) è stata inserita sul C-terminale della proteina di membrana associata lisosomiale 1 (LAMP1) nelle iPSC, che possono quindi essere differenziate in neuroni corticali. LAMP1 è un'abbondante proteina di membrana lisosomiale e un marcatore lisosomiale classico²³. LAMP1 è espresso anche negli endosomi tardivi, che maturano in lisosomi; Questi endosomi-lisosomi tardivi e lisosomi non degradativi sono tutti indicati come lisosomi in questo protocollo. Questa sonda endogena LAMP1-APEX, espressa a livello fisiologico, può ridurre la localizzazione errata di LAMP1 e gli artefatti di sovraespressione. Centinaia di proteine di membrana lisosomiale e interattori lisosomiali possono essere identificati e quantificati con un'eccellente risoluzione spaziale in neuroni umani vivi.

Qui, un protocollo dettagliato per la proteomica della marcatura di prossimità del lisosoma nei neuroni umani derivati da iPSC è descritto con ulteriori miglioramenti rispetto al metodo²² recentemente pubblicato. Il flusso di lavoro complessivo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo include la coltura di neuroni derivati dall'hiPSC, l'attivazione dell'etichettatura di prossimità nei neuroni, la convalida dell'attività APEX mediante microscopia a fluorescenza, la determinazione di un rapporto ottimale tra perline di streptavidina e proteina di input, l'arricchimento di proteine biotinilate, la digestione delle proteine on-beads, la desalinizzazione e la quantificazione dei peptidi, l'analisi LC-MS e l'analisi dei dati proteomici. Vengono inoltre discusse le linee guida per la risoluzione dei problemi e le ottimizzazioni sperimentali per migliorare il controllo della qualità e le prestazioni dell'etichettatura di prossimità.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico e di biosicurezza della George Washington University. Le composizioni dei mezzi e dei buffer utilizzati in questo protocollo sono fornite nella Tabella 1. Le informazioni commerciali sul prodotto qui utilizzate sono fornite nella tabella dei materiali.

1. Coltura di neuroni umani derivati da iPSC

1. Coltura iPSC umana e integrazione sonda LAMP1-APEX (7 giorni)
   1. Scongelare Matrigel in un secchiello per il ghiaccio a 4 °C durante la notte, aliquote 500 μL della soluzione in tubi sterili freddi e conservare le aliquote a -80°C. Preparare 50 mL di soluzione di rivestimento aggiungendo 500 μL del materiale madre Matrigel in 49,5 mL di terreno freddo DMEM/F12.
      NOTA: Mantenere il Matrigel freddo e utilizzare tubi conici prerefrigerati e punte per pipette per evitare la polimerizzazione. La soluzione di rivestimento può essere conservata a 4 °C per 2 settimane.
   2. Rivestire una capsula di coltura cellulare da 10 cm con 4 ml di soluzione di rivestimento per 1 ora in un'incubatrice a 37 °C.
      NOTA: La vitronectina può essere una soluzione di rivestimento alternativa a 5 μg/mL di concentrazione e 2 ore di rivestimento per la coltura iPSC. La vitronectina (componente proteica singola) è più costosa di Matrigel ma ha meno variazioni di batch e segnali di fondo più puliti rispetto a Matrigel, che viene estratto dal tumore del topo con numerose proteine della matrice extracellulare. La piastra di coltura tissutale non trattata è necessaria per il rivestimento di vitronectina. Il rivestimento Matrigel funziona sia per piastre di coltura tissutale trattate che non trattate.
   3. Scongelare e placcare 1-3 milioni di hiPSC su ciascun piatto rivestito da 10 cm precaricato con 8 ml di terreno completo Essential E8 integrato con inibitore ROCK (concentrazione finale 10 μM Y-27632 o 50 nM Chroman1).
      NOTA: L'aggiunta di inibitore ROCK (Y-27632 o Chroman1) al terreno di coltura delle cellule staminali riduce al minimo l'apoptosi indotta dalla dissociazione dopo la scissione e la conservazione criogenica. Chroman1 ha recentemente dimostrato di essere più potente di Y-27632 nell'inibire sia ROCK1 che ROCK2²⁴.
   4. Passare a 10 mL di terreno completo E8 senza inibitore ROCK dopo che le iPSC formano colonie, tipicamente dopo 1-2 giorni. Mantenere la coltura iPSC nel mezzo completo E8 e sostituire il surnatante con terreno fresco a giorni alterni.
   5. Integrare l'enzima di marcatura di prossimità, la perossidasi ascorbato ingegnerizzata (APEX2), nel C-terminale del gene endogeno LAMP1 mediante l'ingegneria del genoma CRISPR. Per i passaggi dettagliati per generare una linea cellulare stabile ingegnerizzata, fare riferimento al metodo precedentemente pubblicato (Frankenfield et al). ²².
2. Differenziazione iPSC-neurone umana (3 giorni)
   1. Rivestire un piatto di coltura cellulare da 10 cm per una notte con 4 ml di soluzione di rivestimento Matrigel in un incubatore a 37 °C prima della differenziazione.
   2. Mantenere le hiPSC fino a ~ 70% di confluenza. Lavare delicatamente le hiPSC con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) 2x per rimuovere le cellule morte. Aspirare il PBS e aggiungere 3 mL di Accutase al piatto di cellule da 10 cm. Agitare la piastra per una distribuzione uniforme e incubare per 8 minuti in un'incubatrice a 37 °C.
   3. Aggiungere 2 ml di PBS per lavare e sollevare le celle dalla piastra e raccogliere tutta la soluzione cellulare in un tubo conico da 15 ml. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 300 × g per 5 min. La piastra 2-4 × 10⁶ hiPSCs su una piastra rivestita Matrigel precaricata con 8 ml di mezzo di induzione dei neuroni caldi (Tabella 1). Distribuire uniformemente le celle e collocarle in un'incubatrice a 37 °C.
      NOTA: La differenziazione neuronale è guidata da un fattore di trascrizione inducibile dalla doxiciclina, la neurogenina-2 (NGN2), che è stata sovraespressa in questa linea cellulare stabile hiPSC¹⁵.
   4. Lavare delicatamente le hiPSC con PBS il giorno 1 di differenziazione per rimuovere i detriti di cellule morte. Sostituire con 10 mL di mezzo di induzione caldo senza inibitore ROCK.
   5. Cambiare con mezzo di induzione caldo senza inibitore ROCK ogni giorno fino al giorno 3 di differenziazione.
      NOTA: I neuroni sono pronti per essere riplaccati in mezzo neuronale.
3. Placcare i neuroni e mantenere la coltura dei neuroni (10 giorni)
   1. Preparare una soluzione di rivestimento di poli-L-ornitina (PLO) da 0,1 mg/ml in tampone borato (Tabella 1).
   2. Rivestire un piatto di coltura cellulare con la soluzione di rivestimento PLO in un incubatore a 37 °C per almeno 1 ora o durante la notte prima della placcatura dei neuroni del giorno 3. Lavare il piatto con 4 ml di acqua sterile tre volte e lasciarlo asciugare completamente all'aria all'interno dell'armadio di biosicurezza.
   3. Dissociare i neuroni del giorno 3 da ogni piatto da 10 cm con 3 ml di Accutase e placcare 8-10 milioni di cellule su ogni piatto rivestito di OLP da 10 cm precaricato con mezzo neuronale corticale caldo (Tabella 1).
   4. Eseguire un cambiamento semi-medio ogni 2-3 giorni con il mezzo neuronale caldo fino a quando i³neuroni raggiungono la maturazione in 2 settimane dopo la differenziazione.

2. Marcatura di prossimità in situ e lisi neuronale (2 ore)

1. Preparare 500 mM di soluzione madre di biotina-fenolo (BP) in dimetilsolfossido (DMSO) e conservare a -20 °C. Il giorno della marcatura di prossimità, diluire la soluzione madre di BP con un mezzo neuronale caldo e trattare i neuroni a una concentrazione finale di 500 μM per 30 minuti in un incubatore a 37 °C.
   NOTA: La doxiciclina viene aggiunta nel mezzo neuronale, che attiverà l'espressione dell'enzima APEX. La doxciclina deve essere aggiunta almeno 24 ore prima dell'esperimento di etichettatura di prossimità.
2. Avviare la reazione di marcatura aggiungendo H 2 O₂ad una concentrazione finale di 1 mM nella coltura neuronale e incubare per esattamente 1 minuto. Aspirare immediatamente il mezzo e risciacquare 3 volte con tampone tempra (Tabella 1).
   NOTA: La soluzionedi H 2 O₂ deve essere preparata fresca prima della reazione di etichettatura. L'attivazione di H 2 O 2 deve essere esattamente 1 min per ridurre la variazione sperimentale e minimizzare lo stress ossidativo causato dal trattamento prolungato con H 2 O₂.
3. Inclinare la piastra per aspirare tutto il tampone residuo. Aggiungere tampone di lisi cellulare ghiacciato (Tabella 1) direttamente sulla piastra neuronale. Utilizzare 100 μL di tampone di lisi cellulare per 1 milione di neuroni. Ruotare la piastra per una sufficiente lisi cellulare e posizionarla sul ghiaccio.
4. Raschiare i lisati cellulari in tubi freddi da 1,5 ml. Sonicare in un bagno di acqua ghiacciata utilizzando un sonicatore da bagno (>100 W) per 15 minuti alternando 40 s on, 20 s off cicli.
   NOTA: Una soluzione proteica sufficientemente lisata deve essere limpida senza pellet o bolle eccessive. Una sufficiente sonicazione del lisato cellulare è fondamentale per tagliare gli acidi nucleici e ridurre la viscosità del lisato cellulare per ridurre il legame non specifico nelle procedure a valle. Un sonicatore a sonda può anche essere utilizzato per fornire una lisi cellulare più forte e più veloce, ma è necessario lavare la sonda tra i campioni per ridurre al minimo la contaminazione incrociata e la perdita del campione.
5. Aggiungere acetone freddo (-20 °C) al campione con un volume 4 volte superiore di tampone di lisi. Vortice brevemente e incubare a -20 °C per 3 ore.
6. Centrifugare a 16.500 × g per 10 minuti a 2 °C. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet proteico. Lavare il pellet con 1 mL di acetone 2x a -20 °C e rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione.
7. Asciugare il pellet proteico con un concentratore sottovuoto per 1 minuto. Aggiungere tampone di lisi cellulare per sciogliere completamente il pellet. Sonicare brevemente se necessario. Conservare i campioni a -80 °C.
   NOTA: La precipitazione dell'acetone può rimuovere il residuo di biotina-fenolo nel campione, che può interferire con l'arricchimento a valle delle proteine biotinilate.

3. Microscopia a fluorescenza per convalidare la localizzazione e l'attività di APEX (1,5 giorni)

1. Incubare i³neuroni che esprimono LAMP1-APEX endogeno con 500 μM BP per 30 minuti a 37 °C. Attivare l'etichettatura con 1 mM H 2 O₂trattamento per solo 1 s per limitare la diffusione della nube di biotina.
2. Fissare immediatamente le cellule con paraformaldeide al 4% nel tampone di tempra e lavare delicatamente 3 volte con PBS.
   NOTA: Per un piatto da 10 cm, sono necessari 4-6 ml per un lavaggio sufficiente.
3. Bloccare e permeabilizzare le cellule usando il 3% di siero d'asina e lo 0,1% di saponina in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
4. Incubare le cellule con l'anticorpo primario anti-LAMP1 (monoclonale di topo H3A4, 1:1.000) per una notte a 4 °C.
5. Lavare i neuroni 3 volte delicatamente con PBS. Incubare i neuroni con anticorpo secondario AF561 anti-topo (1:1.000) e streptavidina-680 (1:1.000) per 1 ora a RT.
6. Lavare 2x con PBS e incubare con Hoechst o marcatore nucleare 4',4-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 10 minuti a RT. Risciacquare le cellule 2x con PBS.
7. Visualizza i neuroni fissi al microscopio a fluorescenza. Osservare le proteine biotinilate colorate con streptavidina e colocalizzate con colorazione LAMP1 al di fuori del nucleo per convalidare la corretta posizione dell'attività APEX.

4. Determinazione del rapporto tra sfere di streptavidina e proteine in ingresso (1,5 giorni)

1. Eseguire un saggio proteico compatibile con detergente (DCA) per determinare le concentrazioni proteiche totali nei lisati cellulari
   1. Sciogliere la proteina sierica albumina bovina (BSA) standard nel tampone di lisi cellulare ad una concentrazione di 4 mg/ml. Preparare una serie di soluzioni standard per proteine BSA (0,2-2 mg/ml, 5 diluizioni) utilizzando il tampone di lisi cellulare.
   2. Trasferire 5 μL da ciascun campione proteico, soluzione standard di proteina BSA e tampone di lisi a cellule bianche in triplice copia in ciascun pozzetto in una piastra a 96 pozzetti.
   3. Aggiungere 2 μL di reagente S per 1 mL di reagente A per ottenere il reagente A'. Aggiungere 25 μL di reagente A' a ciascun pozzetto. Aggiungere 200 μL di reagente B a ciascun pozzetto. Mescolare e far scoppiare le bollicine se presenti.
   4. Incubare quella piastra a 96 pozzetti a RT per 15 minuti, leggere l'assorbanza a 750 nm in un lettore di micropiastre e quantificare le concentrazioni di campioni proteici in base alla curva standard BSA.
2. Saggio di titolazione delle perle dot blot (1,5 giorni)
   1. Trasferire una serie di fanghi magnetici di sfere di streptavidina (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) in provette per strisce PCR. Posizionare i tubi della striscia PCR su un rack magnetico, lavare le perline 3 volte con 100 μL di tampone SDS al 2% e rimuovere completamente il tampone di lavaggio mentre si è sul rack magnetico.
   2. Aggiungere 50 μg di campione proteico a ciascuna provetta. Aggiungere altro tampone di lisi ad un volume totale di 80 μL. Chiudere ermeticamente ogni tubo e ruotare a 4 °C durante la notte.
   3. Centrifugare brevemente i tubi della striscia PCR su una microcentrifuga da banco. Posizionare i tubi della striscia PCR su un rack magnetico per 1 minuto. Individuare 2 μL di surnatante da ciascun tubo su una membrana di nitrocellulosa secca e lasciare asciugare completamente la membrana.
      NOTA: Se l'intensità del segnale è bassa, è possibile individuare più di 2 μL sulla membrana. Il volume può essere aumentato individuando più volte sullo stesso punto dopo che la membrana è stata asciugata all'aria ogni volta. È possibile utilizzare anche un apparato Bio-Dot.
   4. Incubare la membrana in tampone bloccante (TBS) per 1 ora. Incubare la membrana in Streptavidina Alexa Fluor 680 coniugato (1:1.000 in tampone bloccante) per 1 ora. Quindi, lavare la membrana con TBS-T (Tabella 1) 5x.
      NOTA: Un'alternativa al test dot blot è il western blotting utilizzando un anticorpo streptavidina.
   5. Misurare il segnale fluorescente di ciascun punto sulla membrana sotto la lunghezza d'onda di 680 nm e generare un grafico a dispersione con segnale fluorescente sul volume delle perline. Selezionare il volume ottimale di perle necessarie per 50 μg di campione proteico in ingresso in base a dove termina il decadimento esponenziale della curva.
      NOTA: L'intensità della fluorescenza rappresenta l'abbondanza di proteine biotinilate nel surnatante, che dovrebbe diminuire con l'aumentare delle quantità di perle.

5. Arricchimento delle proteine biotinilate e digestione on-beads (3 giorni)

1. Trasferire campioni di lisato proteico da -80 °C e sonicare i campioni in provette da 1,5 ml per 30 s in un sonicatore da bagno per scongelare rapidamente le soluzioni. Vortice e posizionare le provette di campione sul ghiaccio.
2. Trasferire 250 μL di liquame magnetico di sfere magnetiche di streptavidina (SA) in ciascun tubo da 1,5 ml. Mettere i tubi su una griglia magnetica, lavare le perline 3x con 1 mL di tampone di lavaggio A (2% SDS) e rimuovere il tampone residuo.
3. Sulla base dei risultati del test dot blot e del test della proteina DC, calcolare la quantità di campione proteico (μg) necessaria per 250 μL di liquame magnetico di sfere di streptavidina.
   NOTA: In questa sonda LAMP1-APEX espressa in modo endogeno, sono necessari 5 μL di perline per 50 μg di proteine in ingresso. Pertanto, 2,5 mg di proteine totali vengono aggiunti a 250 μL di perline. Meno di 250 μL di sfere SA possono essere utilizzate per un numero limitato di materiali campione in ingresso.
4. Aggiungere tampone di lisi cellulare al tubo contenente la miscela magnetica perla-lisato fino ad un volume totale di 1 mL e ruotare a 4 °C durante la notte.
   NOTA: I campioni di diversi gruppi o repliche devono essere normalizzati alla stessa concentrazione proteica, volume e quantità di perline per ridurre le variazioni sperimentali.
5. Ruotare brevemente tutti i tubi su una microcentrifuga da banco e posizionare i tubi su un rack magnetico per 1 minuto. Rimuovere il surnatante mentre si è sul rack magnetico.
   NOTA: è fondamentale attendere 1 minuto dopo aver posizionato ogni volta le provette sul rack magnetico. Ciò può ridurre al minimo la perdita di perline a causa della piccola quantità invisibile di perline che si muovono ancora verso il magnete nella soluzione.
6. Lavare le perline 2x con 1 mL di Wash Buffer A a RT (rotazione di 5 minuti ogni volta). Ripetere il processo con ogni tampone di lavaggio 2 volte in sequenza a 4 °C. (Buffer B, Buffer C e Buffer D; Tabella 1).
   NOTA: Un'alta concentrazione di soluzione SDS può precipitare a basse temperature. Il primo lavaggio deve essere eseguito presso RT.
7. Metti i tubi sul rack magnetico. Lavare le perline 2x con Buffer D per rimuovere completamente il detersivo residuo. Risospendere le sfere in 100 μL di tampone Tris da 50 mM e aggiungere 5 mM TCEP (concentrazione finale) per incubare per 30 minuti a 37 °C in un miscelatore a temperatura controllata, agitando a 1.200 giri/min.
8. Aggiungere 15 mM di iodoacetamide (IAA, concentrazione finale) a ciascuna provetta e incubare per 30 minuti a 37 °C in un miscelatore a temperatura controllata, agitando a 1.200 giri/min al buio (tappo miscelatore).
   NOTA: IAA è sensibile alla luce e deve essere fatto fresco 5 minuti prima di questo passaggio.
9. Aggiungere 5 mM TCEP (concentrazione finale) per estinguere l'eccesso di IAA. Incubare per 10 minuti a 37 °C in un miscelatore a temperatura controllata con agitazione a 1.200 giri/min (tappo miscelatore spento).
10. Centrifugare brevemente le provette e posizionarle su una griglia magnetica per 1 minuto per rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 μL di 5 mM TCEP in 50 mM di tampone Tris per risospendere le perle. Aggiungere 1 μg di miscela Tripsina/Lys-C al campione e incubare per 14 ore a 37 °C in un miscelatore a temperatura controllata, agitando a 1.200 giri/min.
11. Aggiungere altri 0,2 μg di miscela Tripsina/Lys-C e digerire per 3 ore.
12. Ruotare brevemente le provette e metterle su un rack magnetico per 1 minuto. Trasferire il surnatante peptidico per pulire i tubi mentre su un rack magnetico. Lavare le perle con 50 μL di tampone Tris da 50 mM (agitando per 5 minuti) e unire i supernatanti peptidici.
13. Aggiungere 30 μL di acido trifluoroacetico al 10% (TFA) al tubo contenente il surnatante peptidico per ottenere pH <3.

6. Dissalazione e frazionamento dei peptidi (2 ore)

1. Bagnare la piastra di estrazione in fase solida a fase inversa (solo i pozzetti per l'uso) con 200 μL di metanolo di grado HPLC (MeOH) 3x sul collettore del vuoto. Aggiungere 200 μL di TFA all'1% in acqua di grado HPLC 3x per equilibrare la piastra.
2. Caricare i campioni di peptide nella piastra, accendendo lentamente il vuoto per una velocità di flusso inferiore a 3 goccioline / s per ridurre al minimo la perdita del campione.
3. Lavare la piastra di estrazione 3x con 200 μL di TFA all'1%. Lavare nuovamente la piastra di estrazione con 200 μL di TFA all'1% contenente il 2% di MeOH (v/v). Mantenere la velocità del flusso inferiore a 3 goccioline/s.
4. Sostituire la piastra di raccolta con una piastra di raccolta a 96 pozzetti. Se non è necessario frazionare, eluire i campioni di peptidi 3x con 100 μL di TFA all'1% contenente l'80% di MeOH e combinare in una nuova provetta. Asciugare i campioni di peptidi in un concentratore sottovuoto senza calore.
   NOTA: Se si desidera il frazionamento, i campioni di peptide possono essere eluiti in 4 frazioni utilizzando successivamente 200 μL di TFA all'1% contenenti rispettivamente il 15%, 35%, 50% e 90% di MeOH in una piastra di raccolta diversa.

7. Saggio colorimetrico di quantificazione peptidica (facoltativo) (1 ora)

1. Risospendere i campioni di peptide in 50 μL di acqua di grado LC-MS e prelevare 20 μL di aliquote per eseguire il test peptidico.
   NOTA: Questo passaggio consuma una grande quantità di campione di peptide, ma può fornire una quantificazione accurata della concentrazione di peptidi prima dell'analisi LC-MS. Questo viene in genere condotto solo una volta per tipo di campione per il test prima della preparazione del campione su larga scala.
2. Preparare diluizioni seriali delle soluzioni peptidiche standard (fornite nel kit di analisi colorimetrica) nell'acqua di grado LC-MS. Preparare il reagente di lavoro mescolando il 50% di reagente A, il 48% di reagente B e il 2% di reagente C.
3. Trasferire 20 μL di ciascuna soluzione standard di peptide (tre repliche) e il campione peptidico sconosciuto in una micropiastra da 96 pozzetti. Aggiungere 180 μL del reagente di lavoro a ciascun pozzetto, mescolare bene e incubare la piastra per 30 minuti a RT.
4. Leggere l'assorbanza a 480 nm in un lettore di micropiastre e quantificare le concentrazioni di campioni peptidici in base alla curva standard del peptide.

8. Analisi LC-MS

1. Risospendere i campioni di peptidi in LC Buffer A (2% acetonitrile e 0,1% acido formico, grado LC-MS). Centrifugare a 16.500 × g per 10 minuti a 4 °C per eliminare eventuali particelle.
2. Trasferire il surnatante nei flaconcini di LC-MS. Analizzare i campioni utilizzando uno strumento nanoLC-MS.
   NOTA: I parametri dettagliati LC-MS/MS dipendono dallo strumento e sono stati descritti in precedenza^22,25,26.
3. Generare un elenco di esclusione LC-MS personalizzato con una gamma di tempi di ritenzione per picchi peptidici contaminanti altamente abbondanti come streptavidina e tripsina con precisione di massa di 5 ppm 22 (ad esempio, i picchi comuni del peptide streptavidina sono m / z 402.5435 [carica 3], m / z 603.3117 [carica 2], m / z 654.9733 [carica 3], m / z 678.6812 [carica 3], m / z 1017.5182 [carica 2], and so on.; I picchi comuni del peptide tripsina sono M/Z 421.7584 [carica 2], m/z 523.2855 [carica 2] e m/z 737.7062 [carica 3]).

9. Analisi dei dati di proteomica

1. Analizza i dati grezzi LC-MS con software di analisi dei dati di proteomica come Proteome Discoverer, MaxQuant²⁷ o MS-Fragger²⁸. Includere due biblioteche FASTA per l'analisi dei dati: 1) una banca dati di riferimento Homo Sapiens di Swissprot; 2) una libreria FASTA di contaminanti universali di nuova generazione (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), che ha dimostrato di migliorare l'identificazione proteomica e ridurre le false scoperte²⁹.
2. Impostare i parametri di analisi dei dati di proteomica con un cutoff dell'1% del tasso di falsa scoperta (FDR) per le identificazioni di corrispondenza spettrale di proteine e peptidi (PSM). Selezionare la digestione della tripsina con un massimo di tre scissioni mancate, una modifica fissa della carbamidometilazione della cisteina e una modifica variabile dell'ossidazione della metionina e dell'acetilazione N-terminale della proteina. Utilizzare le intensità di picco del peptide MS1 per una quantificazione senza marcatura. Normalizzare le intensità del peptide alla carbossilasi biotinilata endogenamente, propionil-CoA carbossilasi (PCCA), per ridurre le variazioni di marcatura di prossimità, come descritto in precedenza²².
   NOTA: la normalizzazione PCCA può essere selezionata nel software Proteome Discoverer includendo un file FASTA della sequenza proteica PCCA. In alternativa, la normalizzazione PCCA può essere condotta nell'analisi dei dati a valle.
3. Esportare i risultati a livello proteico dal software di proteomica. Rimuovere le proteine contaminanti prima dell'analisi statistica²⁹. Rimuovere le proteine con solo 1 PSM o nessun risultato di quantificazione. Condurre analisi a termine dell'ontologia genica proteica (GO) con Enrichr³⁰ e analisi della rete proteica con STRING³¹.

Risultati

Questo studio di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma è stato condotto in neuroni umani derivati da iPSC per catturare il microambiente lisosomiale dinamico in situ nei neuroni vivi. Le morfologie cellulari delle hiPSC e dei neuroni derivati dall'hiPSC in diversi punti temporali sono illustrate nella Figura 2A. Le iPSC umane crescono in colonie in mezzo E8. La differenziazione viene avviata mediante placcatura delle iPSC in un mezzo di induzione neuronale contenente ...

Discussione

Utilizzando questa sonda LAMP1-APEX, le proteine sopra e vicino alla membrana lisosomiale sono biotinilate e arricchite. Dato il tipico diametro del lisosoma di 100-1.200 nm, questo metodo fornisce un'eccellente risoluzione intracellulare con un raggio di marcatura di 10-20 nm. LAMP1 è un'abbondante proteina di membrana lisosomiale e un marker classico per i lisosomi, che funge da eccellente proteina esca per la marcatura lisosomiale APEX a livello di espressione endogena. Tuttavia, esistono limitazioni anche quando si ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% (w/v) Saponin solution	Acros Organics	419231000	Flourescent Microscopy
Accutase	Life Technologies	A1110501	cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement	Fisher Scientific	17504044	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF	PeproTech	450-02	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A8806	To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium	STEMCELL Technologies	5790	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561	Thermo Fisher Scientific	505-0452-82	Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor	Tocris	716310	Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor	Roche	4693123001	cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000112	To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium	Thermo Fisher Scientific	11320082	Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330057	Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663	Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit	Waters	WAT097944	For Peptide desalting
Formic Acid (FA)	Fisher Scientific	A11750	For LC-MS analysis
GDNF	PeproTech	450-10	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye	Thermo Fisher Scientific	62239	Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol	Fisher Scientific	A452	For Peptide desalting
HPLC grade water	Fisher Scientific	W5	For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells	Corriell Institute	GM25256	Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.	Thermo Fisher Scientific	AA33323AD	Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA)	Millipore Sigma	I6125	For Protein Digestion
Laminin	Fisher Scientific	23017015	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile	Fisher Scientific	A955	For LC-MS analysis
LC-MS grade water	Fisher Scientific	W64	For LC-MS analysis
L-glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	Cell Culture, Induction Medium
Matrigel	Thermo Fisher Scientific	08-774-552	basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	h4a3	Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x)	Fisher Scientific	17-502-048	Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm	Bio-Rad	1620145	To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA)	Fisher Scientific	11-140-050	Cell Culture, Induction Medium
NT-3	PeproTech	450-03	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate	Waters	186000309	For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS)	LI-COR Biosciences	927-50000	To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock)	Adipogen	41994-02-9	Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium	Gibco	10010049	Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Fisher	23275	Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO)	Millipore Sigma	P3655	Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride	Thermo Fisher Scientific	S271500	Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Thermo Fisher Scientific	BP1311220	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413	Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732	Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator			vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads	Cytiva (formal GE)	28-9857-99	Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	S32358	To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer			temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA)	Millipore Sigma	302031	For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Millipore Sigma	C4706	For Protein Digestion
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	BP152500	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X	Thermo Fisher Scientific	BP151500	Beads wash buffer
TROLOX	Sigma-Aldrich	648471	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade	Promega	V5073	For Protein Digestion
TWEEN 20	Millipore Sigma	P1379	Dot blot assay buffer
Urea	Thermo Fisher Scientific	BP169500	Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin	STEMCELL Technologies	7180	Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor	Selleck	S1049	Cell Culture