Caratterizzazione dell'interattoma del lisosoma neuronale con proteomica di marcatura di prossimità

Riepilogo

Un protocollo di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma neuronale è descritto qui per caratterizzare il microambiente lisosomiale dinamico nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Le proteine lisosomiali di membrana e le proteine che interagiscono con i lisosomi (stabilmente o transitoriamente) possono essere quantificate con precisione in questo metodo con un'eccellente risoluzione spaziale intracellulare nei neuroni umani vivi.

Abstract

I lisosomi comunicano frequentemente con una varietà di biomolecole per ottenere la degradazione e altre diverse funzioni cellulari. I lisosomi sono fondamentali per la funzione cerebrale umana, poiché i neuroni sono postmitotici e dipendono fortemente dalla via autofagia-lisosoma per mantenere l'omeostasi cellulare. Nonostante i progressi nella comprensione delle varie funzioni lisosomiali, catturare le comunicazioni altamente dinamiche tra i lisosomi e altri componenti cellulari è tecnicamente impegnativo, in particolare in modo ad alto rendimento. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per il metodo proteomico di marcatura di prossimità del lisosoma endogeno (knock-in) recentemente pubblicato nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC).

Sia le proteine della membrana lisosomiale che le proteine che circondano i lisosomi entro un raggio di 10-20 nm possono essere identificate con sicurezza e quantificate con precisione nei neuroni umani vivi. Ogni fase del protocollo è descritta in dettaglio, cioè coltura di neuroni hiPSC, etichettatura di prossimità, raccolta di neuroni, microscopia a fluorescenza, arricchimento proteico biotinilato, digestione proteica, analisi LC-MS e analisi dei dati. In sintesi, questo esclusivo metodo di proteomica di marcatura di prossimità lisosomiale endogena fornisce uno strumento analitico robusto e ad alto rendimento per studiare le attività lisosomiali altamente dinamiche nei neuroni umani vivi.

Introduzione

I lisosomi sono organelli catabolici che degradano le macromolecole attraverso la via lisosomiale-autofagica¹. Oltre alla degradazione, i lisosomi sono coinvolti in diverse funzioni cellulari come la trasduzione della segnalazione, il rilevamento dei nutrienti e la secrezione ^2,3,4. Perturbazioni nella funzione lisosomiale sono state implicate nei disturbi da accumulo lisosomiale, nel cancro, nell'invecchiamento e nella neurodegenerazione 3,5,6,7.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico e di biosicurezza della George Washington University. Le composizioni dei mezzi e dei buffer utilizzati in questo protocollo sono fornite nella Tabella 1. Le informazioni commerciali sul prodotto qui utilizzate sono fornite nella tabella dei materiali.

1. Coltura di neuroni umani derivati da iPSC

1. Coltura iPSC umana e integrazione sonda LAMP1-APEX (7 giorni)
   1. Scongelare Matrigel in un secchiello per il ghiaccio a 4 °C durante la notte, aliquote 500 μL della soluzione in tubi sterili freddi e conservare le aliquote a -....

Risultati

Questo studio di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma è stato condotto in neuroni umani derivati da iPSC per catturare il microambiente lisosomiale dinamico in situ nei neuroni vivi. Le morfologie cellulari delle hiPSC e dei neuroni derivati dall'hiPSC in diversi punti temporali sono illustrate nella Figura 2A. Le iPSC umane crescono in colonie in mezzo E8. La differenziazione viene avviata mediante placcatura delle iPSC in un mezzo di induzione neuronale contenente .......

Discussione

Utilizzando questa sonda LAMP1-APEX, le proteine sopra e vicino alla membrana lisosomiale sono biotinilate e arricchite. Dato il tipico diametro del lisosoma di 100-1.200 nm, questo metodo fornisce un'eccellente risoluzione intracellulare con un raggio di marcatura di 10-20 nm. LAMP1 è un'abbondante proteina di membrana lisosomiale e un marker classico per i lisosomi, che funge da eccellente proteina esca per la marcatura lisosomiale APEX a livello di espressione endogena. Tuttavia, esistono limitazioni anche quando si .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% (w/v) Saponin solution	Acros Organics	419231000	Flourescent Microscopy
Accutase	Life Technologies	A1110501	cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement	Fisher Scientific	17504044	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF	PeproTech	450-02	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A8806	To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium	STEMCELL Technologies	5790	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561	Thermo Fisher Scientific	505-0452-82	Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor	Tocris	716310	Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor	Roche	4693123001	cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000112	To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium	Thermo Fisher Scientific	11320082	Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330057	Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663	Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit	Waters	WAT097944	For Peptide desalting
Formic Acid (FA)	Fisher Scientific	A11750	For LC-MS analysis
GDNF	PeproTech	450-10	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye	Thermo Fisher Scientific	62239	Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol	Fisher Scientific	A452	For Peptide desalting
HPLC grade water	Fisher Scientific	W5	For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells	Corriell Institute	GM25256	Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.	Thermo Fisher Scientific	AA33323AD	Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA)	Millipore Sigma	I6125	For Protein Digestion
Laminin	Fisher Scientific	23017015	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile	Fisher Scientific	A955	For LC-MS analysis
LC-MS grade water	Fisher Scientific	W64	For LC-MS analysis
L-glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	Cell Culture, Induction Medium
Matrigel	Thermo Fisher Scientific	08-774-552	basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	h4a3	Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x)	Fisher Scientific	17-502-048	Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm	Bio-Rad	1620145	To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA)	Fisher Scientific	11-140-050	Cell Culture, Induction Medium
NT-3	PeproTech	450-03	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate	Waters	186000309	For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS)	LI-COR Biosciences	927-50000	To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock)	Adipogen	41994-02-9	Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium	Gibco	10010049	Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Fisher	23275	Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO)	Millipore Sigma	P3655	Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride	Thermo Fisher Scientific	S271500	Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Thermo Fisher Scientific	BP1311220	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413	Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732	Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator			vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads	Cytiva (formal GE)	28-9857-99	Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	S32358	To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer			temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA)	Millipore Sigma	302031	For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Millipore Sigma	C4706	For Protein Digestion
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	BP152500	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X	Thermo Fisher Scientific	BP151500	Beads wash buffer
TROLOX	Sigma-Aldrich	648471	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade	Promega	V5073	For Protein Digestion
TWEEN 20	Millipore Sigma	P1379	Dot blot assay buffer
Urea	Thermo Fisher Scientific	BP169500	Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin	STEMCELL Technologies	7180	Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor	Selleck	S1049	Cell Culture