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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un protocollo di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma neuronale è descritto qui per caratterizzare il microambiente lisosomiale dinamico nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Le proteine lisosomiali di membrana e le proteine che interagiscono con i lisosomi (stabilmente o transitoriamente) possono essere quantificate con precisione in questo metodo con un'eccellente risoluzione spaziale intracellulare nei neuroni umani vivi.

Abstract

I lisosomi comunicano frequentemente con una varietà di biomolecole per ottenere la degradazione e altre diverse funzioni cellulari. I lisosomi sono fondamentali per la funzione cerebrale umana, poiché i neuroni sono postmitotici e dipendono fortemente dalla via autofagia-lisosoma per mantenere l'omeostasi cellulare. Nonostante i progressi nella comprensione delle varie funzioni lisosomiali, catturare le comunicazioni altamente dinamiche tra i lisosomi e altri componenti cellulari è tecnicamente impegnativo, in particolare in modo ad alto rendimento. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per il metodo proteomico di marcatura di prossimità del lisosoma endogeno (knock-in) recentemente pubblicato nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC).

Sia le proteine della membrana lisosomiale che le proteine che circondano i lisosomi entro un raggio di 10-20 nm possono essere identificate con sicurezza e quantificate con precisione nei neuroni umani vivi. Ogni fase del protocollo è descritta in dettaglio, cioè coltura di neuroni hiPSC, etichettatura di prossimità, raccolta di neuroni, microscopia a fluorescenza, arricchimento proteico biotinilato, digestione proteica, analisi LC-MS e analisi dei dati. In sintesi, questo esclusivo metodo di proteomica di marcatura di prossimità lisosomiale endogena fornisce uno strumento analitico robusto e ad alto rendimento per studiare le attività lisosomiali altamente dinamiche nei neuroni umani vivi.

Introduzione

I lisosomi sono organelli catabolici che degradano le macromolecole attraverso la via lisosomiale-autofagica1. Oltre alla degradazione, i lisosomi sono coinvolti in diverse funzioni cellulari come la trasduzione della segnalazione, il rilevamento dei nutrienti e la secrezione 2,3,4. Perturbazioni nella funzione lisosomiale sono state implicate nei disturbi da accumulo lisosomiale, nel cancro, nell'invecchiamento e nella neurodegenerazione 3,5,6,7.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico e di biosicurezza della George Washington University. Le composizioni dei mezzi e dei buffer utilizzati in questo protocollo sono fornite nella Tabella 1. Le informazioni commerciali sul prodotto qui utilizzate sono fornite nella tabella dei materiali.

1. Coltura di neuroni umani derivati da iPSC

  1. Coltura iPSC umana e integrazione sonda LAMP1-APEX (7 giorni)
    1. Scongelare Matrigel in un secchiello per il ghiaccio a 4 °C durante la notte, aliquote 500 μL della soluzione in tubi sterili freddi e conservare le aliquote a -....

Risultati

Questo studio di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma è stato condotto in neuroni umani derivati da iPSC per catturare il microambiente lisosomiale dinamico in situ nei neuroni vivi. Le morfologie cellulari delle hiPSC e dei neuroni derivati dall'hiPSC in diversi punti temporali sono illustrate nella Figura 2A. Le iPSC umane crescono in colonie in mezzo E8. La differenziazione viene avviata mediante placcatura delle iPSC in un mezzo di induzione neuronale contenente .......

Discussione

Utilizzando questa sonda LAMP1-APEX, le proteine sopra e vicino alla membrana lisosomiale sono biotinilate e arricchite. Dato il tipico diametro del lisosoma di 100-1.200 nm, questo metodo fornisce un'eccellente risoluzione intracellulare con un raggio di marcatura di 10-20 nm. LAMP1 è un'abbondante proteina di membrana lisosomiale e un marker classico per i lisosomi, che funge da eccellente proteina esca per la marcatura lisosomiale APEX a livello di espressione endogena. Tuttavia, esistono limitazioni anche quando si .......

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo studio è supportato dalla sovvenzione NIH (R01NS121608). A.M.F. riconosce la borsa di studio ARCS-Metro Washington Chapter e la Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Ringraziamo il laboratorio Michael Ward presso il National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) per il supporto alla biologia molecolare e lo sviluppo della tecnologia i3Neuron.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
10% (w/v) Saponin solutionAcros Organics419231000Flourescent Microscopy
AccutaseLife TechnologiesA1110501cell detachment solution, Cell Culture
B27 SupplementFisher Scientific17504044Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNFPeproTech450-02Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acidSigma-AldrichB6768Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA8806To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal mediumSTEMCELL Technologies5790Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561Thermo Fisher Scientific505-0452-82Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitorTocris716310Cell Culture
cOmplete mini Protease InhibitorRoche4693123001cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit IIBio-Rad5000112To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11320082Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPESThermo Fisher Scientific11330057Cell Culture, Induction Medium
Donkey serumSigma-AldrichD9663Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC)Sigma-AldrichD9891-1GCell Culture, Induction Medium
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x)Thermo Fisher ScientificA1517101Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kitWatersWAT097944For Peptide desalting
Formic Acid (FA)Fisher ScientificA11750For LC-MS analysis
GDNFPeproTech450-10Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dyeThermo Fisher Scientific62239Flourescent Microscopy
HPLC grade methanolFisher ScientificA452For Peptide desalting
HPLC grade waterFisher ScientificW5For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cellsCorriell InstituteGM25256Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.Thermo Fisher ScientificAA33323ADProximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA)Millipore SigmaI6125For Protein Digestion
LamininFisher Scientific23017015Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade AcetonitrileFisher ScientificA955For LC-MS analysis
LC-MS grade waterFisher ScientificW64For LC-MS analysis
L-glutamineFisher Scientific25-030-081Cell Culture, Induction Medium
MatrigelThermo Fisher Scientific08-774-552basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bankh4a3Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x)Fisher Scientific17-502-048Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cmBio-Rad1620145To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA)Fisher Scientific11-140-050Cell Culture, Induction Medium
NT-3PeproTech450-03Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plateWaters186000309For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS)LI-COR Biosciences927-50000To conduct dot blot assay for bead titration
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock)Adipogen41994-02-9Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesiumGibco10010049Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide AssayThermo Fisher23275Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO)Millipore SigmaP3655Cell Culture, Dish Coating
Sodium AscorbateSigma-AldrichA4034Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azideSigma-AldrichS8032Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificS271500Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Thermo Fisher ScientificBP1311220Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxideSigma-Aldrich415413Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborateSigma-Aldrich221732Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentratorvacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose BeadsCytiva (formal GE)28-9857-99Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 ConjugateThermo Fisher ScientificS32358To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixertemperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA)Millipore Sigma302031For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Millipore SigmaC4706For Protein Digestion
Tris-HClThermo Fisher ScientificBP152500Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-XThermo Fisher ScientificBP151500Beads wash buffer
TROLOXSigma-Aldrich648471Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromegaV5073For Protein Digestion
TWEEN 20Millipore SigmaP1379Dot blot assay buffer
UreaThermo Fisher ScientificBP169500Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
VitronectinSTEMCELL Technologies7180Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitorSelleckS1049Cell Culture

Riferimenti

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular ....

Ristampe e Autorizzazioni

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