具有邻近标记蛋白质组学的神经元溶酶体相互作用组表征

摘要

这里描述了神经元溶酶体邻近标记蛋白质组学协议，以表征人类诱导的多能干细胞衍生神经元中的动态溶酶体微环境。溶酶体膜蛋白和与溶酶体相互作用（稳定或瞬时）的蛋白质可以在该方法中准确定量，在活体人类神经元中具有出色的细胞内空间分辨率。

摘要

溶酶体经常与各种生物分子交流，以实现降解和其他不同的细胞功能。溶酶体对人类大脑功能至关重要，因为神经元是有丝分裂后，严重依赖自噬-溶酶体途径来维持细胞稳态。尽管在理解各种溶酶体功能方面取得了进展，但捕获溶酶体和其他细胞成分之间的高度动态通讯在技术上具有挑战性，特别是在高通量方式中。在这里，为最近发表的人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生神经元中的内源性（敲入）溶酶体邻近标记蛋白质组学方法提供了详细的协议。

溶酶体膜蛋白和10-20nm半径内溶酶体周围的蛋白质都可以在活的人类神经元中可靠地鉴定和准确定量。详细描述了协议的每个步骤，即hiPSC神经元培养，邻近标记，神经元收获，荧光显微镜，生物素化蛋白质富集，蛋白质消化，LC-MS分析和数据分析。总之，这种独特的内源性溶酶体邻近标记蛋白质组学方法为研究活体神经元中的高动态溶酶体活性提供了一种高通量和强大的分析工具。

引言

溶酶体是分解代谢细胞器，通过溶酶体自噬途径¹降解大分子。除了降解，溶酶体还参与多种细胞功能，如信号转导、营养传感和分泌²，^3，4。溶酶体功能的扰动与溶酶体贮积症、癌症、衰老和神经变性有关³，⁵，^6，7。对于有丝分裂后和高度极化的神经元，溶酶体在神经元细胞稳态、神经递质释放和沿轴突的长距离运输中起着关键作用8，⁹，^10，11。然而，研究人类神经元中的溶酶体一直是一项具有挑战性的任务。诱导多能干细胞（iPSC）衍生神经元技术的最新进展使得能够培养以前无法获得的活体人类神经元，弥合了动物模型和人类患者研究人脑之间的差距^12，

研究方案

所有程序均由乔治华盛顿大学生物安全和伦理委员会批准。 表1提供了该方案中使用的培养基和缓冲液的组成。此处使用的商业产品信息在 材料表中提供。

1. 人iPSC衍生神经元培养

1. 人 iPSC 培养和 LAMP1-APEX 探针整合（7 天）
   1. 将基质胶储备溶液在4°C的冰桶中解冻过夜，将500μL溶液等分到冷无菌管中，并将等分试样储存在-80°C。 将 500 μL 基质胶原液加入 49.5 mL 冷 DMEM/F12 培养基中，制备 50 mL 包衣溶液。
      注意：保持基质胶冷却，并使用预冷的锥形管和移液器吸头以防止聚合。涂层溶液可在4°C下储存2周。
   2. 在37°C培养箱中用4mL包衣溶液涂覆10cm细胞培养皿1小时。
      注意：玻连蛋白可以作为 5 μg/mL 浓度和 2 小时包衣的替代包衣溶液，用于 iPSC 培养。玻连蛋白（单一蛋白质成分）比基质胶更昂贵，但比基质胶具有更少的批次变化和更清晰的背景信号，基质胶是从具有许多细胞外基质蛋白的小鼠肿瘤中提取的。玻连蛋白包被需要未经处理的组织培养板。基质胶包衣适用于处理和未处理的组织培养板。
   3. 在每个包被的 10 cm 培养皿上解冻并接种 1-300 万个 hiPSC，该培养皿预装了 8 mL 补充有 ROCK 抑制剂的必需 E8 完全培养基（终浓度为 ....

结果

这项溶酶体邻近标记蛋白质组学研究是在人iPSC衍生的神经元中进行的，以在活神经元中 原位 捕获动态溶酶体微环境。hiPSCs和hiPSC衍生神经元在不同时间点的细胞形态如图 2A所示。人 iPSC 在 E8 培养基中的菌落中生长。通过将 iPSC 接种到含多西环素的神经元诱导培养基中来启动分化。在 3 天分化期间，神经突延伸每天变得更加明显。在神经元培养基中切换到PLO涂层板后?.......

讨论

使用该LAMP1-APEX探针，溶酶体膜上和附近的蛋白质被生物素化和富集。鉴于典型的溶酶体直径为100-1，200nm，该方法可提供出色的细胞内分辨率，标记半径为10-20nm。LAMP1是一种丰富的溶酶体膜蛋白，也是溶酶体的经典标志物，可作为内源表达水平溶酶体APEX标记的优良诱饵蛋白。然而，当使用LAMP1靶向溶酶体时也存在局限性，因为LAMP1也存在于晚期内体和非降解溶酶体中³⁵。大多数溶?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% (w/v) Saponin solution	Acros Organics	419231000	Flourescent Microscopy
Accutase	Life Technologies	A1110501	cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement	Fisher Scientific	17504044	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF	PeproTech	450-02	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A8806	To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium	STEMCELL Technologies	5790	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561	Thermo Fisher Scientific	505-0452-82	Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor	Tocris	716310	Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor	Roche	4693123001	cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000112	To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium	Thermo Fisher Scientific	11320082	Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES	Thermo Fisher Scientific	11330057	Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663	Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC)	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit	Waters	WAT097944	For Peptide desalting
Formic Acid (FA)	Fisher Scientific	A11750	For LC-MS analysis
GDNF	PeproTech	450-10	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye	Thermo Fisher Scientific	62239	Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol	Fisher Scientific	A452	For Peptide desalting
HPLC grade water	Fisher Scientific	W5	For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells	Corriell Institute	GM25256	Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab.	Thermo Fisher Scientific	AA33323AD	Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA)	Millipore Sigma	I6125	For Protein Digestion
Laminin	Fisher Scientific	23017015	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile	Fisher Scientific	A955	For LC-MS analysis
LC-MS grade water	Fisher Scientific	W64	For LC-MS analysis
L-glutamine	Fisher Scientific	25-030-081	Cell Culture, Induction Medium
Matrigel	Thermo Fisher Scientific	08-774-552	basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	h4a3	Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x)	Fisher Scientific	17-502-048	Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm	Bio-Rad	1620145	To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA)	Fisher Scientific	11-140-050	Cell Culture, Induction Medium
NT-3	PeproTech	450-03	Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate	Waters	186000309	For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS)	LI-COR Biosciences	927-50000	To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock)	Adipogen	41994-02-9	Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium	Gibco	10010049	Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay	Thermo Fisher	23275	Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO)	Millipore Sigma	P3655	Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride	Thermo Fisher Scientific	S271500	Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Thermo Fisher Scientific	BP1311220	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413	Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate	Sigma-Aldrich	221732	Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator			vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads	Cytiva (formal GE)	28-9857-99	Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	S32358	To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer			temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA)	Millipore Sigma	302031	For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Millipore Sigma	C4706	For Protein Digestion
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	BP152500	Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X	Thermo Fisher Scientific	BP151500	Beads wash buffer
TROLOX	Sigma-Aldrich	648471	Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade	Promega	V5073	For Protein Digestion
TWEEN 20	Millipore Sigma	P1379	Dot blot assay buffer
Urea	Thermo Fisher Scientific	BP169500	Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin	STEMCELL Technologies	7180	Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor	Selleck	S1049	Cell Culture