JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يسلط البروتوكول الحالي الضوء على تطبيق تقنية النشاف الغربي لدراسة وظائف وأنشطة الناقل المشترك K-Cl العصبي KCC2. يصف البروتوكول التحقيق في فسفرة KCC2 في المواقع التنظيمية للكيناز Thr906/1007 عبر النشاف الغربي. أيضا ، يتم تمييز طرق إضافية لتأكيد نشاط KCC2 لفترة وجيزة في هذا النص.

Abstract

الناقلات المشتركة لكلوريد البوتاسيوم 2 (KCC2) هي عضو في عائلة حاملات المذاب 12 (SLC12) من الناقلات المشتركة لكلوريد الكاتيون (CCCs) ، الموجودة حصريا في الخلايا العصبية وهي ضرورية للتشغيل السليم لتوازن Cl وبالتالي تثبيط GABAergic الوظيفي. الفشل في التنظيم السليم ل KCC2 ضار وقد ارتبط بانتشار العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك الصرع. وقد أحرز تقدم كبير فيما يتعلق بفهم الآليات التي ينطوي عليها تنظيم نظام KCC2، المعتمد لتطوير التقنيات التي تمكن الباحثين من دراسة وظائفه وأنشطته؛ إما عن طريق التحقيقات المباشرة (تقييم فسفرة المواقع التنظيمية للكيناز) أو التحقيقات غير المباشرة (مراقبة ومراقبة نشاط GABA). هنا ، يسلط البروتوكول الضوء على كيفية التحقيق في فسفرة KCC2 في المواقع التنظيمية للكيناز - Thr906 و Thr1007 - باستخدام تقنية النشاف الغربية. هناك طرق كلاسيكية أخرى تستخدم لقياس نشاط KCC2 مباشرة ، مثل أيون الروبيديوم ومقايسة امتصاص أيون الثاليوم. يتم استخدام تقنيات أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية المشبك لقياس نشاط GABA. ومن ثم ، تعكس بشكل غير مباشر KCC2 المنشط و / أو المعطل كما هو موضح في تقييم توازن أيون الكلوريد داخل الخلايا. ستتم مناقشة بعض هذه التقنيات الإضافية بإيجاز في هذه المخطوطة.

Introduction

الناقلات المشتركة لكلوريد البوتاسيوم 2 (KCC2) هي عضو في عائلة حاملات المذاب 12 (SLC12) من الناقلات المشتركة لكلوريد الكاتيون (CCCs) ، الموجودة حصريا في الخلايا العصبية وهي ضرورية للتشغيل السليم لتوازن Cl- وبالتالي تثبيط GABAergic الوظيفي1،2،3،4. إن الحفاظ على تركيز Cl- منخفض داخل الخلايا العصبية ([Cl-]i) عند 4-6 مللي متر بواسطة KCC2 يسهل γ-aminobutyric acid (GABA) / فرط استقطاب الجلايسين وتثبيط متشابك في الدماغ والحبل الشوكي5. ارتبط الفشل في التنظيم السليم ل KCC2 بانتشار العديد من الأمراض العصبية ، بما في ذلك الصرع4. علاوة على ذلك ، فإن انخفاض قذف Cl− بوساطة KCC2 وضعف فرط استقطاب GABAA و / أو التيارات بوساطة مستقبلات الجلايسين متورطة في الصرع وآلام الأعصاب والتشنج 6,7. يتم تعديل الخلايا العصبية KCC2 بشكل سلبي عن طريق فسفرة المخلفات التنظيمية الرئيسية داخل المجال داخل الخلايا الطرفية C بواسطة مركب إشارات كيناز كيناز1 المرتبط بالبرولين / الألانين الغني بالألانين (SPAK) / المستجيب للإجهاد التأكسدي (OSR) 1 ، والذي يسهل الحفاظ على نشاط GABA غير المستقطب في الخلايا العصبية غير الناضجة2،8،9 . يقوم WNK-SPAK / OSR1 بفسفرة بقايا ثريونين 906 و 1007 (Thr906 / Thr1007) وبالتالي يقلل من تنظيم التعبير الجيني mRNA ل KCC2 ، مما يؤدي إلى تدهور لاحق في وظيفته الفسيولوجية 8,10. والأهم من ذلك ، أنه من المعروف بالفعل أن مركب كيناز WNK-SPAK / OSR1 معروف بالفسفرة وتثبيطتعبير KCC2 1،2،4،11،12 ، وأن تثبيط مسارات إشارات مجمع الكيناز لفسفرة Thr906 / Thr1007 قد تم ربطه بزيادة التعبير عن جين KCC2 mRNA 13،14،15 . من المهم ملاحظة أن تنظيم التعبير العصبي KCC2 و Na + -K + -2Cl- cotransporters 1 (NKCC1) عبر فسفرة البروتين يعمل بشكل متزامن وفي أنماط عكسية1،4،16.

وقد أحرز تقدم ثابت وكبير فيما يتعلق بفهم الآليات التي ينطوي عليها تنظيم نظام KCC2، المعتمد لتطوير التقنيات التي تمكن الباحثين من دراسة وظائفه وأنشطته؛ إما عن طريق التحقيقات المباشرة (تقييم فسفرة المواقع التنظيمية للكيناز) أو التحقيقات غير المباشرة (مراقبة ومراقبة نشاط GABA). يسلط البروتوكول المقدم هنا الضوء على تطبيق تقنيات النشاف الغربية لدراسة وظائف وأنشطة الناقل العصبي K + -Cl- co-transporter KCC2 من خلال التحقيق في فسفرة الناقل المشترك في المواقع التنظيمية للكيناز Thr906/1007.

اللطخة الغربية هي طريقة تستخدم للكشف عن بروتينات معينة ذات أهمية من عينة من الأنسجة أو الخلية. تفصل هذه الطريقة أولا البروتينات حسب الحجم من خلال الرحلان الكهربائي. ثم يتم نقل البروتينات كهربائيا إلى دعامة صلبة (عادة غشاء) قبل تمييز البروتين المستهدف باستخدام جسم مضاد معين. يتم اقتران الأجسام المضادة بعلامات مختلفة أو أجسام مضادة مترافقة بالفلوروفور يتم اكتشافها باستخدام طرق القياس اللوني أو التلألؤ الكيميائي أو التألق. هذا يسمح باكتشاف بروتين مستهدف محدد من خليط من البروتينات. وقد استخدمت هذه التقنية لتوصيف المواقع الفوسفاتية النوعية ل KCCs1 واستخدمت لتحديد مثبطات الكيناز التي تثبط فسفرة KCC3 Thr991/Thr104817. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للمرء أن يكتشف على وجه التحديد KCC2 الكلي والمفسفر من تحلل الخلايا / الأنسجة. من حيث المبدأ ، يعد اكتشاف الأجسام المضادة المترافقة بالبروتين بواسطة هذه التقنية مفيدا للغاية لأنه يساعد على تحسين فهم الأنشطة التعاونية في مواقع الفوسفو في KCC2 ، والتي تلقي الضوء على الآليات الجزيئية المشاركة في لوائحها الفسيولوجية. يمثل التحليل الكمي للتعبير الكلي للبروتين وظيفة ونشاط KCC2. هناك طرق كلاسيكية أخرى تستخدم لقياس نشاط KCC2 مباشرة ، مثل أيون الروبيديوم ومقايسة امتصاص أيون الثاليوم. يتم استخدام تقنيات أخرى مثل الفيزيولوجيا الكهربية المشبك لقياس نشاط GABA. ومن ثم ، تعكس بشكل غير مباشر KCC2 المنشط و / أو المعطل كما هو موضح في تقييم توازن أيون الكلوريد داخل الخلايا.

Protocol

ملاحظة: يصف البروتوكول طريقة النشاف الغربي للكشف عن بروتينات معينة ذات أهمية.

1. ثقافة الخلية والنقل

  1. قم بتسخين جميع الكواشف في حمام الخرز (37 درجة مئوية) قبل إجراء زراعة الخلية. تحضير وسط الاستزراع ، وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، مكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ لكل من 2mM L-glutamine ، 100x حمض أميني غير أساسي ، 100 mM بيروفات الصوديوم ، و 100 وحدة / مل بنسلين ستربتومايسين.
  2. ذوبان الفئران المنقولة بثبات KCC2b الكلى الجنينية البشرية 293 خلية (HEK293rnKCC2b)18 تماما في حمام حبة (37 درجة مئوية). نقل الخلايا من أنبوب التبريد إلى أنبوب طرد مركزي يحتوي على 5 مل من الوسائط الطازجة. أدر الخلية على 1200 × جم لمدة 3-5 دقائق.
  3. استخدم ماصة شفاط (مثبتة بمضخة تفريغ) لشفط المادة الطافية وإضافة 10 مل من الوسائط الطازجة لإعادة تعليق الخلايا. انقل معلق الخلية إلى طبق 10 سم.
  4. ضع الطبق في الحاضنة واتركه ينمو لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ CO2 . مراقبة فترة الحضانة لضمان نمو الخلايا الصحية. مزيد من تقسيم الخلايا عندما تصل إلى أكثر من 90 ٪ التقاء بعد فترة الحضانة.
  5. قم بشفط الوسائط القديمة من طبق الخلايا وشطف الخلايا برفق باستخدام 2 مل من محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS). أضف 2 مل من التربسين واحتضانه لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. استخدم 2 مل من الوسائط الكاملة لغسل خلايا التربسين برفق في الطبق. أضف 9 مل من الوسائط الطازجة إلى الأطباق الجديدة وأضف محلول 1 مل من الطبق القديم إلى كل طبق جديد. انقل أطباق الخلية المنقسمة مرة أخرى إلى الحاضنة لمدة 48 ساعة للوصول إلى التقاء ≥ 90٪.
  7. عالج الخلايا إما باستخدام ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) كعنصر تحكم ، أو 8 ميكرومتر ستوروسبورين ، أو 0.5 مللي متر N-ethylmaleimide (NEM) لمدة 15 دقيقة قبل حصاد الخلايا في محلول التحلل.

2. تحضير محللات الخلايا وتحميل العينات

  1. استنشاق وسائل الإعلام على طبق الثقافة (من إجراءات النقل). ضع ثقافة الخلية على الثلج واغسل الخلايا باستخدام PBS المثلج.
  2. قم بشفط برنامج تلفزيوني ، ثم أضف 1.0 مل من محلول التحلل البارد بالثلج الذي يحتوي على 50 مللي مول من tris-HCl (درجة الحموضة 7.5) ، 1 مللي مول من جلايكول إيثيلين مكرر (β-أمينو إيثيل إيثر) -N ، N ، N ′ ، N′-حمض رباعي الخليك (EGTA) ، 1 مللي متر حمض إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) ، 50 مللي مول فلوريد الصوديوم ، 5 مللي مول بيروفوسفات الصوديوم ، 10 مللي مول صوديوم β جليسيروفوسفات ، 1 مللي متر أورثوفانادات الصوديوم ، 1٪ (وزن / حجم) تريتون X-100 ، 0.27 م سكروز ، 1 ملي متر بنزامين ، 0.1٪ (v / v) 2-ميركابتو إيثانول ، و 2 ملي مول فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) إلى الطبق.
    ملاحظة: يختلف حجم محلول التحلل أثناء حصاد الخلايا باختلاف أحجام الأطباق ، على سبيل المثال ، 1 مل من محلول التحلل مناسب لكل 1 × 107 خلايا / طبق 100 مم / 150 سم 2 دورق ، بينما 0.5 مل مناسب لكل 5 × 106 خلايا / طبق 60 مم / 75 سم2 قارورة.
  3. استخدم مكشطة الخلايا البلاستيكية الباردة لكشط الخلايا من قاع الطبق ، ثم استخدم ماصة برفق لنقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق موجود بالفعل على الجليد. حرك الأنبوب باستمرار لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بتدوير الخلية في جهاز طرد مركزي بارد (4 درجات مئوية) عند 16000 × جم لمدة 20 دقيقة ، وقم بإزالة الأنبوب برفق من جهاز الطرد المركزي ، وضعه على الثلج. اجمع المادة الطافية في أنبوب طازج مبرد مسبقا وتخلص من الحبيبات.
    ملاحظة: قد يكون من الضروري تغيير قوة الطرد المركزي والوقت حسب نوع الخلية. على الرغم من ذلك ، تشجع الإرشادات العامة على الطرد المركزي عند 16000 × جم لمدة 20 دقيقة. ومع ذلك ، يجب تحديد هذا لكل تجربة. على سبيل المثال ، تحتاج الخلايا الحساسة مثل الكريات البيض إلى سرعة طرد مركزي خفيفة للغاية.

3. تحضير المرسبات المناعية من محللات الخلايا

  1. ماصة 300 ميكرولتر من البروتين-G-sepharose في أنبوب الطرد المركزي الدقيق. أدر المحلول في 500 × جم لمدة 2 دقيقة وتخلص من المادة الطافية.
  2. أضف 500 ميكرولتر من PBS ودوامة الحل جيدا. أدر المحلول في 500 × جم لمدة 2 دقيقة وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة.
  3. امزج 1 ملغ من الأجسام المضادة المضادة ل KCC2 Thr906 والأجسام المضادة ل KCC2 Thr1007 مع 200 ميكرولتر من حبات البروتين G-sepharose وقم بتكوين الحجم إلى 500 ميكرولتر مع PBS. رج العبوة على منصة اهتزازية أو عجلة دوارة لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. اغسل 2x مع برنامج تلفزيوني.
  4. إجراء قياس كمية البروتين على محللات الخلية بأكملها وإضافة 1 ملغ من محللة الخلية إلى الخرز المغسول. احتضن بلطف في دوار من طرف إلى طرف لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية. قم بتدوير الخرز واغسله 3x باستخدام PBS الذي يحتوي على 150 مللي مول كلوريد الصوديوم (NaCl).
  5. غسل المرسبات المناعية (الخرز) 3x مع 200 ميكرولتر من PBS. أعد تعليق الحبيبات النهائية في 100 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت لعينة كبريتات دوديسيل الليثيوم (LDS).
  6. رج الأنابيب في شاكر دوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق واحتضانها في كتلة تسخين عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بالطرد المركزي لعينة التحميل عند 11000 × جم لمدة 2 دقيقة واستخدم المادة الطافية لتحميل الهلام.

4. أداء اللطخة الغربية

  1. قم بتجميع جهاز الصب واسكب جل فصل 8٪ طازج (انظر الجدول 1 للحصول على الوصفة / التحضير) لصب الجل مما يسمح بحوالي 2 سم من المساحة من أعلى زجاج الصب. أضف 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول المطلق إلى الإعداد واتركه يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
    ملاحظة: تعتمد وصفة هلام بولي أكريلاميد للرحلان الكهربائي لكبريتات دوديسيل الصوديوم - بولي أكريلاميد جل (SDS-PAGE) على حجم البروتين محل الاهتمام (الجدول 2). ومن ثم ، قم بتدوين حجم البروتين قبل تحديد نسبة الجل المطلوبة.
  2. استخدم ماصة لإزالة الأيزوبروبانول وشطف الجل بعناية بحوالي 200 ميكرولتر من الماء المقطر. أضف جل التراص الطازج بنسبة 6٪ (انظر الجدول 1 للوصفة / التحضير) لملء مساحة 2 سم تقريبا في إعداد الصب. ضع مشط البئر برفق واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  3. ثبت الجل المصبوب في خزان الرحلان الكهربائي.
  4. قم بإذابة 30.3 جم من قاعدة Tris ، و 144.1 جم من الجلايسين ، و 10 جم من SDS في 1000 مل من الماء المقطر لتحضير محلول نقل 10x. قم بإعداد مخزن مؤقت تشغيل واحد عن طريق إضافة 10 مل من 10٪ SDS و 100 مل من مخزن نقل 10x إلى 890 مل من الماء المقطر.
  5. صب 1x تشغيل العازلة في الخزان. قم بتحميل 5 ميكرولتر من علامة الوزن الجزيئي في البئر الأول وكمية متساوية من البروتين في كل بئر من هلام SDS-PAGE (بين 18-30 ميكرولتر ، اعتمادا على حجم المشط المستخدم). املأ الآبار الفارغة ب 1x LDS وقم بتشغيل الجل لمدة 90-120 دقيقة عند 120 فولت.
  6. قم بإذابة 58.2 جم من قاعدة Tris و 29.3 جم من الجلايسين في 1000 مل من الماء المقطر لتحضير محلول نقل 10x. تنشيط غشاء النيتروسليلوز مع 1x نقل عازلة تحتوي على 20 ٪ الميثانول. شطف الجل والغشاء مع المخزن المؤقت للنقل ونشرها برفق على كومة التحضير.
    ملاحظة: ليست هناك حاجة لضبط الأس الهيدروجيني للمخازن المؤقتة للتشغيل والنقل حيث يجب أن تكون عند الرقم الهيدروجيني الأمثل المطلوب. أيضا ، ينصح بإعداد هذه المخازن المؤقتة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة قبل التجربة لتوفير الوقت.
  7. رتب الساندويتش المراد نقله بهذا الترتيب: قطب سالب (إطار / نهاية أسود) - رغوة ساندويتش - ورق ترشيح - جل SDS-PAGE مغسول - غشاء نيتروسليلوز مغسول - ورق ترشيح - رغوة شطيرة - قطب موجب (إطار أحمر). قم بتكديس الساندويتش المجمع في خزان النقل وقم بتشغيله بسرعة 90 فولت لمدة 90 دقيقة أو 30 فولت لمدة 360 دقيقة.

5. تلطيخ الأجسام المضادة وتطوير الصورة

  1. قم بإزالة الغشاء واتركه يجف. سد الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة باستخدام عازل مانع مصنوع من حليب منزوع الدسم بنسبة 5٪ في محلول ملحي مخزن يحتوي على 0.1٪ 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. احتضان الأغشية مع التخفيفات المناسبة من الجسم المضاد الأولي8،15،19 وبيتا أكتين (التحكم في التحميل) في حجب المخزن المؤقت لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اغسل الغشاء في ثلاث غسلات من 1x TBS-T لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: إن حضانة الغشاء المنفصل مع أدوات التحكم في التحميل مثل بيتا أكتين أو ألفا توبولين أو الأجسام المضادة لنازعة هيدروجين الجلسرين 3-فوسفات هو تطبيع نتائج النشاف الغربية الأخرى أثناء القياس الكمي اللاحق. يتوفر التخفيف الموصى به لكل جسم مضاد أساسي في دليل الشركة المصنعة.
  3. احتضان الغشاء المغسول بجسم مضاد ثانوي مخفف 5000 ضعف في المخزن المؤقت المانع لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى ، اغسل الغشاء 3x في 1x TBS-T لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    ملاحظة: يوصى بشدة برفع الجسم المضاد الثانوي ضد الأنواع التي ينشأ فيها الجسم المضاد الأساسي. على سبيل المثال ، إذا كان الجسم المضاد الأساسي لإجمالي KCC2 هو مضاد الماوس KCC2 ، فيجب استخدام الجسم المضاد الثانوي لمكافحة الماوس.
  4. ضع الغشاء المغسول على لوحة التصوير. امزج كميات متساوية من كل كاشف تلألؤ كيميائي محسن (ECL) وانشر المحلول المختلط برفق على الغشاء لتطوير الإشارات.

6. الحصول على الصور باستخدام نظام التصوير وقياس البيانات

  1. انقل لوحة التصوير إلى المقصورة المناسبة في نظام التصوير للتصوير. افتح برنامج التصوير على الكمبيوتر لمعالجة الصور.
  2. على شريط الأدوات، انقر فوق بروتوكول جديد واختر قناة واحدة. انقر فوق تحديد ضمن مربع حوار التصوير / التطبيق الهلامي ، وقم بالتمرير إلى Blot وحدد إما حساسية Chemi Hi أو Chemi Hi Resolution. ثم انقر فوق إعداد تراكم الإشارة لتعيين مدة وعدد الصور المراد الحصول عليها.
  3. انقر فوق Position Gel ضمن إعداد البروتوكول واضبط الجل في نظام التصوير إذا لزم الأمر. انقر فوق تشغيل البروتوكول للحصول على الصور.
  4. انقر بزر الماوس الأيمن فوق إحدى الصور التي تم الحصول عليها ضمن مربع كتالوج الصور لحفظ الصور على الكمبيوتر. انتقل إلى الصورة المطلوبة وانقر على تحديد صورة ومتابعة ضمن مربع الحوار تشغيل.
  5. انقر على أيقونة تحويل الصورة لضبط التباين وتشبع البكسل للصورة. انقر على أيقونة لقطة الشاشة على شريط الأدوات العام لحفظ الصورة على الكمبيوتر اعتمادا على تنسيق الصورة المطلوب.
  6. قم بقياس كثافة النطاق باستخدام برنامج ImageJ والتحليل باستخدام الأدوات الإحصائية المناسبة.

النتائج

هنا ، بحثت النتيجة التمثيلية المقدمة في الشكل 1 في تأثير staurosporine و NEM على الفسفرة بوساطة WNK-SPAK / OSR1 ل KCC2 و NKCC1 في خطوط خلايا HEK293 التي تعبر بثبات عن KCC2b (HEKrnKCC2b) 18 باستخدام تقنية النشاف الغربي. وترد مناقشة تفاصيل شاملة عن النتائج التمثيلية في Zhang et a...

Discussion

تم استخدام العديد من الطرق لقياس أنشطة SLC12 من CCCs التي يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية ، بما في ذلك KCC2. وقد ثبت أن العديد من هذه التقنيات تعزز المعرفة العلمية بشأن تحليل الأهمية الوظيفية لهذه الناقلات وأنماط هيكلها الوظيفي في مختلف الطفرات المرتبطة بالمرض. بشكل حاسم ، هناك مزايا ومحاذير...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية الملكية في المملكة المتحدة (رقم المنحة. IEC \ NSFC \ 201094) ، ومنحة دكتوراه الكومنولث.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
40% acrylamideSigma-AldrichA2917Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per SulfateSigma-Aldrich248614Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAKDundee UniversityS670BUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2Dundee UniversityS700CUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007Dundee UniversityS961CUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906Dundee UniversityS959CUsed as primary antibody for western blotting
anti-mouseCell Signalling technology66002Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1Dundee UniversityS841BUsed as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212Dundee UniversityS763BUsed as primary antibody for western blotting
anti-rabbitCell Signalling technologyC29F4Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheepabcamab6900Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAKDundee UniversityS669DUsed as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin IIISigma-AldrichT8578Used as primary antibody for western blotting
BenzamineMerck UK135828Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209Used for lysate protein quantification
Casting apparatusAtto WSE-1165WUsed to run SDS-page electrophoresis
CentrifugeEppendorf5804Used in lysate preparation
CentrifugeVWRMicroStar 17RUsed for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLUsed for cell culture experiment
Dried Skimmed MilkMarvelN/AUsed to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucoseSigma-AldrichD6429Used for cell culture
ECL reagentPerkin ElmerORTT755/2655Used to develop image for western blotting
EDTAFisher ScientificD/0700/53Used as component of lysis buffer
EGTASigma-Aldriche4378Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power SupplyBioRadPowerPAC HCTo supply power to run SDS-page electrophoresis
EthanolThermoFisherE/0650DF/17Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivatedMerck Life Sciences UKF9665Used for cell culture
FumehoodWalkerA7277Used for cell culture
Gel Blotting - WhatmanGE Healthcare 10426981Used in western blotting to make transfer sandwich
GlycineSigma-Aldrich15527Used to make buffers
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USAVersion 6.0Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HClAcros Organics10647282Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating blockGrantQBT1Used to heat WB loading samples
HEK293 cellsMerck UK12022001-1VLCell line for culture experiment
ImageJ SoftwareWayne Rasband and Contributors; NIH, USA ImageJ 1.53eUsed to measure band intensities from western blotting images
Imaging systemBioRadChemiDoc MPUsed to take western blotting images
IncubatorLEECLEEC precision 190DUsed for cell culture
IsopropanolHoneywell24137Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solutionSigma-AldrichG7513Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)NovexNP0008Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid Merck Life Sciences UKM7145Used for cell culture
MicrocentrifugeEppendorf5418Used for preparing lysates for WB
Microplate readerBioRadiMarkUsed for lysate protein concentration readout
Microsoft PowerpointMicrosoft, USAPowerPoint2016Used to edit western blotting images
Molecular Weight MarkerBioRad1610373Used for western blotting
N-ethylmaleimideThermo Fisher Scientific23030Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membraneFisher Scientific45004091Used for western blotting
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Used for cell culture
pH MeterMettler ToledoSeven compact s210Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer SalineSigma-AldrichD8537Used for cell culture
PKCδ pThr505Cell Signalling technology9374Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein GGeneronPG50-00-0002Used for immunoprecipitation
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653Used as component of wash buffer
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL5750Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadateSigma-AldrichS6508Used as component of lysis buffer
Sodium PyruvateSigma-AldrichS8636Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphateMerck UKG9422Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)Scientific Laboratory Supplies, UKS4400-1MGUsed for cell culture experiment
SucroseScientifc Laboratory SuppliesS0389Used as component of lysis buffer
TEMEDSigma-AldrichT7024Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer ChamberBioRad1658005EDUUsed in western blotting to transfer protein on membrane
TrisSigma-AldrichT6066Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA SolutionMerck Life Sciences UKT4049Used for cell culture
Tween-20Sigma-AldrichP3179Used as make TBS-T buffer
Vacuum pumpCharles AustenDymax 5Used for cell culture
VortexScientific IndustriesK-550-GEUsed in sample preparation
Vortex mixerScientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GEUsed of mixing resolved sample
Water bathGrant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5Used to incubate solutions

References

  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -. Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. . Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -. C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. . Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
  28. Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved