JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе подчеркивается применение метода западного блоттинга для изучения функций и активности нейронального K-Cl сотранспортера KCC2. Протокол описывает исследование фосфорилирования KCC2 на регуляторных участках киназы Thr906/1007 посредством западного блоттинга. Кроме того, в этом тексте кратко освещаются дополнительные методы подтверждения активности KCC2.

Аннотация

Котранспортеры хлорида калия 2 (KCC2) являются членом семейства растворенных носителей 12 (SLC12) катион-хлорид-котранспортеров (CCC), обнаруженных исключительно в нейроне и необходимых для правильного функционирования Cl-гомеостаза и, следовательно, функционального ГАМКергического ингибирования. Неспособность в надлежащей регуляции KCC2 вредна и связана с распространенностью нескольких неврологических заболеваний, включая эпилепсию. Был достигнут значительный прогресс в понимании механизмов, участвующих в регулировании KCC2, аккредитованных для разработки методов, которые позволяют исследователям изучать его функции и деятельность; либо путем прямых (оценка фосфорилирования киназных регуляторных участков), либо косвенных (наблюдение и мониторинг активности ГАМК) исследований. Здесь протокол подчеркивает, как исследовать фосфорилирование KCC2 в регуляторных участках киназы - Thr906 и Thr1007 - с использованием метода западного блоттинга. Существуют и другие классические методы, используемые для непосредственного измерения активности KCC2, такие как анализ поглощения ионов рубидия и таллия. Для измерения активности ГАМК используются другие методы, такие как электрофизиология пластыря-зажима; следовательно, косвенно отражая активированный и/или инактивированный KCC2, полученный в результате оценки внутриклеточного хлорид-ионного гомеостаза. Некоторые из этих дополнительных методов будут кратко рассмотрены в этой рукописи.

Введение

Котранспортеры хлорида калия 2 (KCC2) являются членом семейства растворенных носителей 12 (SLC12) катион-хлорид-котранспортеров (CCC), обнаруженных исключительно в нейроне и необходимых для правильного функционирования Cl-гомеостаза и, следовательно, функционального ГАМКергического ингибирования 1,2,3,4. Поддержание низкой внутринейрональной концентрации Cl- ([Cl-]i) при 4-6 мМ KCC2 способствует гиперполяризации γ-аминомасляной кислоты (ГАМК)/глицина и синаптическому ингибированию в головном и спинном мозге5. Сбой в правильной регуляции KCC2 был связан с распространенностью нескольких неврологических заболеваний, включая эпилепсию4. Кроме того, снижение KCC2-опосредованной Cl−экструзии и нарушение гиперполяризующих токов ГАМКА и/или глициновых рецепторов были вовлечены в эпилепсию, невропатическую боль и спастичность 6,7. Нейрональный KCC2 отрицательно модулируется путем фосфорилирования ключевых регуляторных остатков в его С-концевом внутриклеточном домене с помощью сигнального комплекса1, связанного с пролином/богатым аланином (SPAK)/окислительным стрессом (OSR), который облегчает поддержание деполяризованной активности ГАМК в незрелых нейронах 2,8,9 . WNK-SPAK/OSR1 фосфорилирует остатки треонина 906 и 1007 (Thr906/Thr1007) и впоследствии понижает экспрессию гена мРНК KCC2, что приводит к последующему ухудшению его физиологической функции 8,10. Что еще более важно, однако, уже фактом является то, что киназный комплекс WNK-SPAK/OSR1, как известно, фосфорилирует и ингибирует экспрессию KCC2 1,2,4,11,12, и что ингибирование сигнальных путей комплекса киназы к фосфорилату Thr906/Thr1007 было связано с повышенной экспрессией гена мРНК KCC2 13,14,15 . Важно отметить, что регуляция экспрессии нейронных KCC2 и Na+-K+-2Cl-котранспортеров 1 (NKCC1) посредством фосфорилирования белка работает одновременно и в обратных паттернах 1,4,16.

Был достигнут последовательный и значительный прогресс в отношении понимания механизмов, участвующих в регулировании KCC2, аккредитованных для разработки методов, которые позволяют исследователям изучать его функции и деятельность; либо путем прямых (оценка фосфорилирования киназных регуляторных участков), либо косвенных (наблюдение и мониторинг активности ГАМК) исследований. Протокол, представленный здесь, подчеркивает применение методов западного блоттинга для изучения функций и активности нейронального K+-Cl-ко-транспортера KCC2 путем исследования фосфорилирования котранспортера в регуляторных участках киназы Thr906/1007.

Вестерн-блот — это метод, используемый для обнаружения специфических белков, представляющих интерес, из образца ткани или клетки. Этот метод сначала разделяет белки по размеру с помощью электрофореза. Затем белки электрофоретически переносятся на твердую опору (обычно мембрану), прежде чем целевой белок будет помечен с использованием специфического антитела. Антитела конъюгируются с различными метками или флуорофорно-конъюгированными антителами, которые обнаруживаются с использованием колориметрического, хемилюминесцентного или флуоресцентного методов. Это позволяет обнаружить конкретный белок-мишень из смеси белков. Этот метод был использован для характеристики фосфосфоспецифических участков KCCs1 и был использован для идентификации ингибиторов киназы, которые ингибируют фосфорилирование KCC3 Thr991/Thr104817. Следуя этому протоколу, можно специфически обнаружить тотальный и фосфорилированный KCC2 из лизатов клеток / тканей. В принципе, обнаружение белково-конъюгированных антител с помощью этого метода является очень полезным, поскольку оно помогает улучшить понимание совместной деятельности на фосфо-сайтах KCC2, что проливает свет на молекулярные механизмы, участвующие в их физиологических нормах. Количественный анализ экспрессии общего белка репрезентативен для функции и активности KCC2. Существуют и другие классические методы, используемые для непосредственного измерения активности KCC2, такие как анализ поглощения ионов рубидия и таллия. Для измерения активности ГАМК используются другие методы, такие как электрофизиология пластыря-зажима; следовательно, косвенно отражая активированный и/или инактивированный KCC2, полученный в результате оценки внутриклеточного хлорид-ионного гомеостаза.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описывает метод вестерн-блоттинга для обнаружения специфических белков, представляющих интерес.

1. Клеточная культура и трансфекция

  1. Разогрейте все реагенты в бисерной ванне (37 °C) перед процедурой культивирования клеток. Приготовьте культуральную среду, модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM), дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, 1% каждой из 2 мМ L-глутамина, 100x заменимой аминокислоты, 100 мМ пирувата натрия и 100 единиц / мл пенициллина-стрептомицина.
  2. Оттаивание стабильно трансфицированной крысы KCC2b эмбриональной почки человека 293 клетки (HEK293rnKCC2b)18 полностью в бисерной ванне (37 °C). Переведите клетки из криовиальной трубки в центрифужную трубку, содержащую 5 мл свежей среды. Вращайте ячейку при 1200 ×г в течение 3-5 мин.
  3. Используйте аспираторную пипетку (прикрепленную к вакуумному насосу) для аспирации супернатанта и добавьте 10 мл свежей среды для повторной приостановки клеток. Переложите суспензию ячейки на тарелку размером 10 см.
  4. Поместите блюдо в инкубатор и дайте ему расти в течение 48 ч при 37 °С в увлажненной 5% co2 атмосфере. Следите за инкубационным периодом, чтобы обеспечить здоровый рост клеток. Дальнейшее расщепление клеток, когда они достигают более 90% слияния после инкубационного периода.
  5. Аспирируйте старую среду из чашки клеток и осторожно промывайте клетки 2 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS). Добавьте 2 мл трипсина и инкубируйте около 1-2 мин при комнатной температуре.
  6. Используйте 2 мл полной среды, чтобы аккуратно вымыть трипсинизированные клетки в посуде. Добавьте 9 мл свежей среды в новые блюда и добавьте по 1 мл раствора из старого блюда в каждое из новых. Перенесите расщепленные клеточные чашки обратно в инкубатор на 48 ч, чтобы достичь ≥ 90% слива.
  7. Обрабатывайте клетки либо диметилсульфоксидом (DMSO) в качестве контроля, 8 мкМ ставроспорина или 0,5 мМ N-этилмалеймида (NEM) в течение 15 мин перед сбором клеток в буфере лизиса.

2. Подготовка клеточных лизатов и загрузка образцов

  1. Аспирировать носители на блюде культуры (от процедур трансфекции). Поместите культуру клеток на лед и промыть клетки ледяным PBS.
  2. Аспирировать PBS, затем добавить 1,0 мл ледяного буфера лизиса, содержащего 50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 1 мМ этиленгликоль-бис (β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N',N'-тетрауксусную кислоту (ЭГТА), 1 мМ этилендиаминеттрауксусной кислоты (ЭДТА), 50 мМ фторида натрия, 5 мМ пирофосфата натрия, 10 мМ натрия-β-глицерофосфата, 1 мМ ортованадата натрия, 1% (мас./об.) тритона X-100, 0,27 М сахарозы, 1 мМ бензамина, 0,1% (v/v) 2-меркаптоэтанола и 2 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) на блюдо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем лизисного буфера во время сбора клеток варьируется в зависимости от размеров чашки, например, 1 мл лизисного буфера подходит на 1 х 107 ячеек / 100 мм чашки / 150 см2 колбы, в то время как 0,5 мл подходит на 5 х 106 ячеек / 60 мм тарелки / 75 см2 колбы.
  3. Используйте холодный пластиковый скребок, чтобы соскоблить ячейки со дна чашки, затем осторожно используйте пипетку, чтобы перенести клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку, уже находящуюся на льду. Постоянно перемешивайте пробирку в течение 30 мин при 4 °C.
  4. Раскрутите лизаты клетки в холодной центрифуге (4 °C) при 16 000 х г в течение 20 минут, аккуратно извлеките трубку из центрифуги и поместите ее на лед. Соберите супернатант в предварительно охлажденную свежую трубку и выбросьте гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться варьировать силу центрифугирования и время в зависимости от типа ячейки. Тем не менее, общие рекомендации поощряют центрифугирование при 16 000 х г в течение 20 минут. Однако это должно быть определено для каждого эксперимента. Например, нежные клетки, такие как лейкоциты, нуждаются в очень легкой скорости центрифугирования.

3. Получение иммунопреципитантов из клеточных лизатов

  1. Пипетка 300 мкл белка-G-сефарозы в микроцентрифужную трубку. Раскрутите раствор при 500 х г в течение 2 мин и выбросьте надосадочный материал.
  2. Добавьте 500 мкл PBS и хорошо вращайте раствор. Раскрутите раствор при 500 х г в течение 2 мин и выбросьте надосадочный материал. Повторите этот шаг.
  3. Смешайте 1 мг анти-KCC2 Thr906 и анти-KCC2 Thr1007 антител с 200 мкл белка G-сефарозных шариков и составляйте объем до 500 мкл с PBS. Встряхивайте на вибрирующей платформе или вращающемся колесе в течение 2 ч при 4 °C. Мойка 2x с PBS.
  4. Проводят количественную оценку белка на всех клеточных лизатах и добавляют 1 мг клеточного лизата в промытые шарики. Осторожно инкубируют в сквозном ротаторе в течение 2 ч при 4 °C. Открутите шарики и промыть их в 3 раза PBS, содержащим 150 мМ хлорида натрия (NaCl).
  5. Промыть иммунопреципитанты (шарики) 3x с 200 мкл PBS. Повторное суспендирование конечной гранулы в 100 мкл 1x буфера образца додецилсульфата лития (LDS).
  6. Встряхните трубки в роторном шейкере при комнатной температуре в течение 5 мин и высиживайте их в нагревательном блоке при 75 °C в течение 10 мин. Центрифугируйте нагрузочный образец при 11 000 х г в течение 2 мин и используйте супернатант для загрузки геля.

4. Выполнение вестерн-блот

  1. Соберите литейный аппарат и залейте свежеприготовленным 8% разделительным гелем (см. Таблицу 1 для рецепта/приготовления), чтобы отлить гель, давая около 2 см пространства от верхней части литейного стекла. Добавьте 200 мкл абсолютного изопропанола в установку и дайте ему постоять при комнатной температуре в течение 60 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепт полиакриламидного геля для электрофореза додецилсульфат-полиакриламидного геля (SDS-PAGE) зависит от размера интересующего белка (таблица 2). Следовательно, запишите размер белка, прежде чем определять желаемый процент геля.
  2. Используйте пипетку для удаления изопропанола и тщательно промойте гель примерно 200 мкл дистиллированной воды. Добавьте свежеприготовленный 6% гель для укладки (рецепт/приготовление см. в таблице 1 ), чтобы заполнить примерно 2 см пространства на литье. Аккуратно вставьте в колодец гребень и дайте постоять при комнатной температуре 30 мин.
  3. Закрепите отлитый гель в резервуаре для электрофореза.
  4. Растворите 30,3 г основы Tris, 144,1 г г глицина и 10 г SDS в 1000 мл дистиллированной воды для приготовления 10-кратного буфера переноса. Подготовьте 1x работающий буфер, добавив 10 мл 10% SDS и 100 мл 10x буфера переноса в 890 мл дистиллированной воды.
  5. Налейте 1x бегущий буфер в резервуар. Загрузите 5 мкл маркера молекулярной массы в первую лунку и равное количество белка в каждую лунку геля SDS-PAGE (между 18-30 мкл, в зависимости от используемого размера гребня). Заполните пустые колодцы 1x LDS и запустите гель около 90-120 мин при 120 В.
  6. Растворите 58,2 г основы Tris и 29,3 г г глицина в 1000 мл дистиллированной воды, чтобы подготовить 10-кратный буфер переноса. Активация нитроцеллюлозной мембраны с помощью 1x переносного буфера, содержащего 20% метанола. Промойте гель и мембрану с помощью переносного буфера и аккуратно распределите их по подготовительному стеку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости регулировать pH работающих и передающих буферов, так как они должны быть на оптимальном требуемом pH. Также желательно подготовить эти буферы и хранить их при комнатной температуре перед экспериментом, чтобы сэкономить время.
  7. Расположите сэндвич для переноса в следующем порядке: отрицательный электрод (черная рамка/конец) - сэндвич-пена - фильтровальная бумага - промытый гель SDS-PAGE - промытая нитроцеллюлозная мембрана - фильтровальная бумага - сэндвич-пена - положительный электрод (красная рамка). Сложите собранный сэндвич в передаточный бак и работайте при 90 В в течение 90 минут или 30 В в течение 360 минут.

5. Окрашивание антител и развитие изображения

  1. Снимите мембрану и дайте ей высохнуть. Блокируют мембрану в течение 1 ч при комнатной температуре с помощью блокирующего буфера, изготовленного из 5% обезжиренного молока в трис-буферном физиологическом растворе, содержащем 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. Инкубируют мембраны с соответствующими разведениями первичных антител 8,15,19 и бета-актина (контроль нагрузки) в блокирующий буфер в течение 1 ч при комнатной температуре или на ночь при 4°С. Промывайте мембрану в три промывки по 1x TBS-T в течение 5 мин каждая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация отдельной мембраны с элементами контроля нагрузки, такими как бета-актин, альфа-тубулин или антитела к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе, должна нормализовать другие результаты западного блоттинга во время последующей количественной оценки. Рекомендуемое разведение для каждого первичного антитела доступно в руководстве производителя.
  3. Инкубируют промытую мембрану вторичным антителом, разбавленным в 5000 раз в блокирующем буфере в течение 60 мин при комнатной температуре. Снова промыть мембрану 3x в 1x TBS-T в течение 5 минут каждая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется, чтобы вторичное антитело было поднято против вида, у которого выращивается первичное антитело. Например, если первичным антителом общего KCC2 является мышиный анти-KCC2, то необходимо использовать вторичное антитело для антимышечного.
  4. Поместите промытую мембрану на плату для визуализации. Смешайте равные объемы каждого реагента усиленной хемилюминесценции (ECL) и осторожно распределите смешанный раствор по мембране для выработки сигналов.

6. Получение изображений с помощью системы визуализации и количественной оценки данных

  1. Перенесите плату визуализации в соответствующий отсек системы визуализации для визуализации. Откройте программное обеспечение для обработки изображений на компьютере для обработки изображений.
  2. На панели инструментов щелкните Новый протокол и выберите Одноканальный. Нажмите кнопку «Выбрать » в диалоговом окне «Гелевая визуализация/применение», прокрутите до пункта «Blot» и выберите «Chemi Hi Sensitivity» или «Chemi Hi Resolution». Затем нажмите «Настройка накопления сигнала», чтобы установить продолжительность и количество изображений для получения.
  3. Нажмите Позиционировать гель под настройкой протокола и при необходимости отрегулируйте гель в системе визуализации. Щелкните Запустить протокол , чтобы получить образы.
  4. Щелкните правой кнопкой мыши одно из полученных изображений в каталоге изображений, чтобы сохранить изображения на компьютере. Перейдите к нужному изображению и нажмите Выбрать изображение и продолжить в диалоговом окне запуска.
  5. Щелкните значок Image Transform (Преобразование изображения ), чтобы настроить контрастность и насыщенность изображения в пикселях. Нажмите на значок Скриншот на общей панели инструментов, чтобы сохранить изображение на компьютере в зависимости от желаемого формата изображения.
  6. Измерьте плотность полос с помощью программного обеспечения ImageJ и проанализируйте с помощью соответствующих статистических инструментов.

Результаты

Здесь репрезентативный результат, представленный на рисунке 1, исследовал влияние ставроспорина и NEM на опосредованное WNK-SPAK/OSR1 фосфорилирование KCC2 и NKCC1 в клеточных линиях HEK293, стабильно экспрессирующих KCC2b (HEKrnKCC2b)18 с использованием метода западн...

Обсуждение

Многие методы были использованы для измерения активности SLC12 CCC, которые экспрессируются в нейронах, включая KCC2. Многие из этих методов доказали, что расширяют научные знания по анализу функциональной значимости этих транспортеров и их структурно-функциональных паттернов в различных ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Королевским обществом Великобритании (грант No IEC\NSFC\201094) и стипендией Содружества Ph.D. Scholarship.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
40% acrylamideSigma-AldrichA2917Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per SulfateSigma-Aldrich248614Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAKDundee UniversityS670BUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2Dundee UniversityS700CUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007Dundee UniversityS961CUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906Dundee UniversityS959CUsed as primary antibody for western blotting
anti-mouseCell Signalling technology66002Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1Dundee UniversityS841BUsed as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212Dundee UniversityS763BUsed as primary antibody for western blotting
anti-rabbitCell Signalling technologyC29F4Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheepabcamab6900Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAKDundee UniversityS669DUsed as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin IIISigma-AldrichT8578Used as primary antibody for western blotting
BenzamineMerck UK135828Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209Used for lysate protein quantification
Casting apparatusAtto WSE-1165WUsed to run SDS-page electrophoresis
CentrifugeEppendorf5804Used in lysate preparation
CentrifugeVWRMicroStar 17RUsed for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLUsed for cell culture experiment
Dried Skimmed MilkMarvelN/AUsed to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucoseSigma-AldrichD6429Used for cell culture
ECL reagentPerkin ElmerORTT755/2655Used to develop image for western blotting
EDTAFisher ScientificD/0700/53Used as component of lysis buffer
EGTASigma-Aldriche4378Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power SupplyBioRadPowerPAC HCTo supply power to run SDS-page electrophoresis
EthanolThermoFisherE/0650DF/17Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivatedMerck Life Sciences UKF9665Used for cell culture
FumehoodWalkerA7277Used for cell culture
Gel Blotting - WhatmanGE Healthcare 10426981Used in western blotting to make transfer sandwich
GlycineSigma-Aldrich15527Used to make buffers
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USAVersion 6.0Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HClAcros Organics10647282Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating blockGrantQBT1Used to heat WB loading samples
HEK293 cellsMerck UK12022001-1VLCell line for culture experiment
ImageJ SoftwareWayne Rasband and Contributors; NIH, USA ImageJ 1.53eUsed to measure band intensities from western blotting images
Imaging systemBioRadChemiDoc MPUsed to take western blotting images
IncubatorLEECLEEC precision 190DUsed for cell culture
IsopropanolHoneywell24137Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solutionSigma-AldrichG7513Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)NovexNP0008Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid Merck Life Sciences UKM7145Used for cell culture
MicrocentrifugeEppendorf5418Used for preparing lysates for WB
Microplate readerBioRadiMarkUsed for lysate protein concentration readout
Microsoft PowerpointMicrosoft, USAPowerPoint2016Used to edit western blotting images
Molecular Weight MarkerBioRad1610373Used for western blotting
N-ethylmaleimideThermo Fisher Scientific23030Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membraneFisher Scientific45004091Used for western blotting
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Used for cell culture
pH MeterMettler ToledoSeven compact s210Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer SalineSigma-AldrichD8537Used for cell culture
PKCδ pThr505Cell Signalling technology9374Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein GGeneronPG50-00-0002Used for immunoprecipitation
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653Used as component of wash buffer
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL5750Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadateSigma-AldrichS6508Used as component of lysis buffer
Sodium PyruvateSigma-AldrichS8636Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphateMerck UKG9422Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)Scientific Laboratory Supplies, UKS4400-1MGUsed for cell culture experiment
SucroseScientifc Laboratory SuppliesS0389Used as component of lysis buffer
TEMEDSigma-AldrichT7024Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer ChamberBioRad1658005EDUUsed in western blotting to transfer protein on membrane
TrisSigma-AldrichT6066Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA SolutionMerck Life Sciences UKT4049Used for cell culture
Tween-20Sigma-AldrichP3179Used as make TBS-T buffer
Vacuum pumpCharles AustenDymax 5Used for cell culture
VortexScientific IndustriesK-550-GEUsed in sample preparation
Vortex mixerScientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GEUsed of mixing resolved sample
Water bathGrant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5Used to incubate solutions

Ссылки

  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776 (2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142 (2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65 (2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -. Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78 (2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967 (2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3 (2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986 (2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. . Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -. C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820 (2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. . Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429 (2012).
  28. Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992 (2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255 (2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032 (2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10 (2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены