使用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能和活性

摘要

本协议重点介绍了蛋白质印迹技术在研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能和活性方面的应用。该方案描述了通过蛋白质印迹 在 激酶调节位点Thr906/1007处KCC2磷酸化的研究。此外，本文还简要强调了确认KCC2活性的其他方法。

摘要

氯化钾共转运蛋白2（KCC2）是阳离子氯化共转运蛋白（CCCs）溶质载体家族12（SLC12）的成员，仅在神经元中发现，对于Cl^- 稳态的正常功能以及因此具有功能性GABA能抑制至关重要。KCC2的适当调节失败是有害的，并且与包括癫痫在内的几种神经系统疾病的流行有关。在了解KCC2调节所涉及的机制方面取得了相当大的进展，KCC2被认可为开发使研究人员能够研究其功能和活动的技术;通过直接（评估激酶调控位点磷酸化）或间接（观察和监测GABA活性） 调查 。在这里，该协议重点介绍了如何使用蛋白质印迹技术研究激酶调节位点 - Thr906 和 Thr1007 - 的 KCC2 磷酸化。还有其他经典方法可用于直接测量KCC2活性，例如铷离子和铊离子摄取测定。进一步的技术如膜片钳电生理学用于测量GABA活性;因此，间接反映活化和/或失活的KCC2，如细胞内氯离子稳态的评估所告知的。本文将简要讨论其中一些附加技术。

引言

氯化钾共转运蛋白2（KCC2）是阳离子氯化共转运蛋白（CCCs）溶质载体家族12（SLC12）的成员，仅在神经元中发现，对于Cl^-稳态的正常功能以及因此功能性GABA能抑制¹，²，^3，4至关重要。KCC2将低神经元内Cl-浓度（[Cl-]_i）维持在^4-6mM，有助于大脑和脊髓中的γ-氨基丁酸（GABA）/甘氨酸超极化和突触抑制⁵。KCC2的适当调节失败与几种神经系统疾病的流行有关，包括癫痫⁴。此外，KCC2介导的Cl⁻挤出减少和超极化GABA_A和/或甘氨酸受体介导的电流受损与癫痫，神经性疼痛和痉挛有关6^，7。神经元 KCC2 通过无赖氨酸 （WNK）-STE20/SPS1 相关脯氨酸/富丙氨酸 （SPAK）/氧化应激响应 （OSR） 激酶信号传导复合物¹ 在其 C 末端细胞内结构域内的关键调节残基磷酸化而负调节，这有助于维持未成熟神经元中去极化的 GABA 活性²，^8，9.WNK-SPAK/OSR1磷酸化苏氨酸残基906和1007（Thr906/Thr1007），随后下调KCC2的mRNA基因表达，导致其生理功能随之恶化^8，10。然而，更重要的是，已知WNK-SPAK/OSR1激酶复合物磷酸化并抑制KCC2^表达1，²，⁴，¹¹，¹²已经是一个事实^，并且抑制磷酸化Thr906 / Thr1007的激酶复合物信号通路与KCC2 mRNA基因¹³，^14，15的表达增加有关。.重要的是要注意，通过蛋白质磷酸化调节神经元KCC2^{和Na +} -K⁺-2Cl^-共转运蛋白1（NKCC1）表达同时并以^{相反的模式}1，^4，16起作用。

在了解KCC2调节机制方面取得了持续和相当大的进展，认可开发使研究人员能够研究其功能和活动的技术;通过直接（评估激酶调控位点磷酸化）或间接（观察和监测GABA活性） 调查 。这里介绍的方案重点介绍了蛋白质印迹技术的应用，通过研究共转运蛋白在激酶调控位点Thr906/1007的磷酸化来研究神经元K⁺-Cl^- 共转运蛋白KCC2的功能和活性。

蛋白质印迹是一种用于从组织或细胞样本中检测特定目标蛋白的方法。该方法首先通过电泳按大小分离蛋白质。然后将蛋白质电泳转移到固体载体（通常是膜）上，然后使用特异性抗体标记目标蛋白质。将抗体与使用比色法、化学发光法或荧光法检测的不同标签或荧光团偶联抗体偶联。这允许从蛋白质混合物中检测特定的目标蛋白质。该技术已用于表征^KCCs1 的磷酸化特异性位点，并已用于鉴定抑制KCC3 Thr991 / Thr1048磷酸化的激酶抑制剂¹⁷。通过遵循该协议，可以特异性地检测细胞/组织裂解物中的总和磷酸化KCC2。原则上，通过该技术检测蛋白质偶联抗体具有很强的帮助性，因为它有助于提高对KCC2磷酸化位点合作活性的理解，从而阐明了参与其生理调节的分子机制。总蛋白表达的定量分析代表了KCC2的功能和活性。还有其他经典方法用于直接测量KCC2活性，例如铷离子和铊离子摄取测定。进一步的技术如膜片钳电生理学用于测量GABA活性;因此，间接反映活化和/或失活的KCC2，如细胞内氯离子稳态的评估所告知的。

研究方案

注意:该方案描述了用于检测特定目标蛋白质的蛋白质印迹方法。

1. 细胞培养和转染

1. 在细胞培养过程之前加热珠浴（37°C）中的所有试剂。准备培养基，Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM），补充有10%胎牛血清，1%的2mM L-谷氨酰胺，100x非必需氨基酸，100mM丙酮酸钠和100单位/ mL青霉素链霉素。
2. 解冻稳定转染的大鼠KCC2b人胚胎肾293细胞（HEK293^rnKCC2b）¹⁸ 在珠浴（37°C）中。将细胞从冷冻管转移到含有 5 mL 新鲜培养基的离心管中。以1200×g旋转细胞3-5分钟。
3. 使用吸液器移液器（固定在真空泵上）吸出上清液并加入 10 mL 新鲜培养基以重新悬浮细胞。将细胞悬液转移到10厘米的培养皿板上。
4. 将培养皿放入培养箱中，使其在37°С下在加湿的5%CO₂ 气氛中生长48小时。监测孵育期以确保细胞健康生长。当细胞在孵育期后达到90%以上的汇合度时，进一步分裂细胞。
5. 从细胞培养皿中吸出旧培养基，并用 2 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 轻轻冲洗细胞。加入2mL胰蛋白酶，在室温下孵育约1-2分钟。
6. 使用 2 mL 的完整培养基轻轻清洗培养皿中的胰蛋白酶化细胞。将 9 mL 新鲜培养基添加到新培养皿中，并将旧培养皿中的 1 mL 溶液添加到每个新培养皿中。将分裂细胞培养皿转移回培养箱48小时以达到90%汇合度≥。
7. 在提取裂解缓冲液中的细胞之前，用二甲基亚砜（DMSO）作为对照，8μM星形孢菌素或0.5mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理细胞15分钟。

2. 细胞裂解物的制备和上样

1. 吸出培养皿上的培养基（来自转染程序）。将细胞培养物放在冰上，用冰冷的PBS清洗细胞。
2. 吸出PBS，然后加入1.0 mL冰冷裂解缓冲液，其中含有50 mM tris-HCl（pH 7.5），1 mM乙二醇-双（β-氨基乙醚）-N，N，N′，N′-四乙酸（EGTA），1 mM乙二胺四乙酸（EDTA），50 mM氟化钠，5 mM焦磷酸钠，10 mM钠-β-甘油磷酸盐，1 mM原钒酸钠，1%（w / v）Triton X-100，0.27 M蔗糖， 1 mM 苯甲胺、0.1% （v/v） 2-巯基乙醇和 2 mM 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 到培养皿中。
   注意:细胞收获期间裂解缓冲液的体积因培养皿尺寸而异，例如，每 1 x 10 7 细胞/100 mm 培养皿/150 cm 2 烧瓶适合 1 mL 裂解缓冲液，而每 5 x 10^{6 细胞/}60 mm 培养皿/75 cm ² 烧瓶适合 0.5 mL。
3. 使用冷塑料细胞刮刀从培养皿底部刮下细胞，然后轻轻使用移液器将细胞悬液转移到已经在冰上的微量离心管中。在4°C下不断搅拌管30分钟。
4. 在16，000× g 的冷离心机（4°C）中旋转细胞裂解物20分钟，从离心机中轻轻取出试管，并将其放在冰上。将上清液收集到预冷的新鲜管中并丢弃沉淀。
   注意:可能需要根据细胞类型改变离心力和时间。不过，一般准则鼓励以 16，000 x g 离心 20 分钟。但是，必须为每个实验确定这一点。例如，像白细胞这样的脆弱细胞需要非常轻的离心速度。

3. 从细胞裂解物中制备免疫沉淀剂

1. 将 300 μL 蛋白质-G-琼脂糖移液到微量离心管中。将溶液以500× g 旋转2分钟，弃去上清液。
2. 加入 500 μL PBS 并充分涡旋溶液。将溶液以500× g 旋转2分钟，弃去上清液。重复此步骤。
3. 将 1 mg 抗 KCC2 Thr906 和抗 KCC2 Thr1007 抗体与 200 μL 蛋白 G-琼脂糖珠混合，并用 PBS 将体积补足至 500 μL。在4°C下在振动平台或旋转轮上摇动2小时。 用PBS清洗2次。
4. 对整个细胞裂解物进行蛋白质定量，并向洗涤的珠子中加入1mg细胞裂解物。在4°C下在端到端旋转器中轻轻孵育2小时。 旋转珠子并用含有 150 mM 氯化钠 （NaCl） 的 PBS 洗涤 3 次。
5. 用 200 μL PBS 洗涤免疫沉淀剂（珠子）3 倍。将最终沉淀重悬于 100 μL 1x 十二烷基硫酸锂 （LDS） 样品缓冲液中。
6. 在室温下在转子振荡器中摇动管5分钟，并在75°C的加热块中孵育10分钟。将上样样品以11，000 x g 离心2分钟，并使用上清液上样凝胶。

4. 进行蛋白质印迹

1. 组装浇注设备并倒入新鲜制备的8%分离凝胶（配方/制备见 表1 ）以浇铸凝胶，从浇注玻璃顶部留出约2厘米的空间。向设置中加入 200 μL 绝对异丙醇，使其在室温下静置 60 分钟。
   注意:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的聚丙烯酰胺凝胶配方取决于目标蛋白质的大小（表2）。因此，在确定所需的凝胶百分比之前，请记下蛋白质大小。
2. 使用移液管去除异丙醇，并用约200μL蒸馏水仔细冲洗凝胶。加入新鲜制备的6%堆积凝胶（配方/制备见 表1 ），以填充浇注装置上约2厘米的空间。轻轻地放入孔梳中，并在室温下静置30分钟。
3. 将灌制凝胶固定到电泳槽中。
4. 将 30.3 g Tris 碱、144.1 g 甘氨酸和 10 g SDS 溶解在 1000 mL 蒸馏水中，制备 10x 转印缓冲液。将 10 mL 10% SDS 和 100 mL 10x 转印缓冲液加入 890 mL 蒸馏水中，制备 1 倍电泳缓冲液。
5. 将 1x 电泳缓冲液倒入水箱中。将 5 μL 分子量标记物加载到第一个孔中，将等量的蛋白质加载到 SDS-PAGE 凝胶的每个孔中（在 18-30 μL 之间，具体取决于使用的梳子大小）。用1x LDS填充空孔，并在120 V下运行凝胶约90-120分钟。
6. 将 58.2 g Tris 碱和 29.3 g 甘氨酸溶解在 1000 mL 蒸馏水中，制备 10x 转印缓冲液。用含有20%甲醇的1x转印缓冲液激活硝酸纤维素膜。用转印缓冲液冲洗凝胶和膜，并将它们轻轻地铺在制备堆栈上。
   注意:无需调整电泳缓冲液和转印缓冲液的pH值，因为它们应处于所需的最佳pH值。此外，建议在实验前准备这些缓冲液并将其储存在室温下以节省时间。
7. 按以下顺序排列要转移的三明治:负极（黑框/末端）-三明治泡沫-滤纸-冲洗的SDS-PAGE凝胶-冲洗的硝酸纤维素膜-滤纸-三明治泡沫-正极（红框）。将组装好的三明治堆叠在转移罐中，并以 90 V 运行 90 分钟或 30 V 运行 360 分钟。

5. 抗体染色和图像显影

1. 取下膜并使其干燥。在室温下，使用由含有0.1%1x 吐温20（1x TBS-T）的Tris缓冲盐水中的5%脱脂牛奶制成的封闭缓冲液封闭膜1小时。
2. 将膜与一抗^8，15，19和β-肌动蛋白（上样对照）的适当稀释液在封闭缓冲液中孵育1小时或在4°C下过夜。 在1x TBS-T的三次洗涤中洗涤膜，每次5分钟。
   注意:将单独的膜与上样对照（如β-肌动蛋白、α-微管蛋白或甘油醛3-磷酸脱氢酶抗体）孵育是为了在随后的定量过程中使其他蛋白质印迹结果标准化。每种一抗的推荐稀释度可在制造商手册中找到。
3. 将洗涤后的膜与二抗在封闭缓冲液中稀释5000倍孵育60分钟。再次，在1x TBS-T中洗涤膜3次，每次5分钟。
   注意:强烈建议必须针对产生一抗的物种提高二抗。例如，如果总KCC2的一抗是小鼠抗KCC2，则必须使用抗小鼠的二抗。
4. 将洗涤过的膜放在成像板上。混合等体积的每种增强化学发光（ECL）试剂，并将混合溶液轻轻地铺在膜上以产生信号。

6. 使用成像系统进行图像采集和数据量化

1. 将成像板转移到成像系统上的相应隔间进行成像。打开计算机上的成像软件进行图像处理。
2. 在工具栏上，单击" 新建协议 "，然后选择 "单通道"。单击凝胶成像/应用对话框下的 选择 ，滚动至 印迹 并选择化学 高灵敏度 或 化学高分辨率。然后单击 信号累积 设置以设置要采集的图像的持续时间和数量。
3. 单击实验方案设置下的定位凝胶，并在必要时调整成像系统中的 凝胶 。单击 运行协议 以获取图像。
4. 右键单击映像目录框下的其中一个采集的图像，将图像保存在计算机上。导航到所需的图像，然后单击运行对话框下的 "选择图像并继续 "。
5. 单击图像变换图标以调整 图像 的对比度和像素饱和度。点击 屏幕截图 常规工具栏上的图标，根据所需的图像格式将图像保存到计算机。
6. 使用 ImageJ 软件测量条带密度，并使用适当的统计工具进行分析。

结果

在这里， 图1 中给出的代表性结果研究了星形孢菌素和NEM对使用蛋白质印迹技术稳定表达KCC2b（HEK^rnKCC2b）¹⁸ 的HEK293细胞系中WNK-SPAK/OSR1介导的KCC2和NKCC1磷酸化的影响。有关代表性结果的全面细节在Zhang等人¹⁵中进行了讨论。与NEM类似，星形孢菌素是一种广泛的激酶抑制剂，可以增强KCC2转运活性并抑制NKCC1活性¹⁵

讨论

许多方法已被用于测量在神经元中表达的CCC的SLC12的活性，包括KCC2。其中许多技术已被证明可以增强分析这些转运蛋白的功能相关性及其在不同疾病相关突变中的结构 - 功能模式的科学知识。至关重要的是，各种方法都有优点和注意事项²¹.然而，上面解释的方案概述了如何使用蛋白质印迹评估激酶调控位点Thr906和Thr1007的KCC2磷酸化，这有助于研究KCC2的功能和活性。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions