Western Blotting Kullanarak Nöronal K-Cl Co-Transporter KCC2'nin Fonksiyonlarının ve Aktivitelerinin İncelenmesi

Özet

Mevcut protokol, nöronal K-Cl ko-transporter KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı blotlama tekniğinin uygulanmasını vurgulamaktadır. Protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de batı lekelenmesi yoluyla KCC2 fosforilasyonunun araştırılmasını açıklamaktadır. Ayrıca, KCC2 etkinliğini doğrulamak için ek yöntemler bu metinde kısaca vurgulanmıştır.

Özet

Potasyum klorür kotransporterleri 2 (KCC2), sadece nöronda bulunan katyon-klorür-kotransporterlerin (CCC'ler) çözünen taşıyıcı ailesi 12'nin (SLC12) bir üyesidir ^ve Cl-homeostazın düzgün çalışması ve sonuç olarak fonksiyonel GABAerjik inhibisyon için gereklidir. KCC2'nin uygun şekilde düzenlenmesindeki başarısızlık zararlıdır ve epilepsi de dahil olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların prevalansı ile ilişkilendirilmiştir. Araştırmacıların işlevlerini ve faaliyetlerini incelemelerini sağlayan tekniklerin geliştirilmesine akredite edilmiş KCC2'nin düzenlenmesinde yer alan mekanizmaların anlaşılması konusunda önemli ilerlemeler kaydedilmiştir; doğrudan (kinaz düzenleyici bölgelerin fosforilasyonunu değerlendirmek) veya dolaylı (GABA aktivitesini gözlemlemek ve izlemek) araştırmalar yoluyla . Burada protokol, kinaz düzenleyici bölgelerde (Thr906 ve Thr1007) KCC2 fosforilasyonunun batı lekelenme tekniğini kullanarak nasıl araştırılacağını vurgulamaktadır. Rubidyum iyonu ve talyum iyonu alım testi gibi KCC2 aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanılan başka klasik yöntemler de vardır. GABA aktivitesini ölçmek için yama-kelepçe-elektrofizyoloji gibi diğer teknikler kullanılır; Bu nedenle, hücre içi klorür iyonu homeostazının değerlendirilmesi ile bilgilendirildiği gibi dolaylı olarak aktif ve / veya inaktive edilmiş KCC2'yi yansıtmaktadır. Bu ek tekniklerden birkaçı bu makalede kısaca tartışılacaktır.

Giriş

Potasyum klorür kotransporterleri 2 (KCC2), sadece nöronda bulunan katyon-klorür-kotransporterlerin (CCC'ler) çözünen taşıyıcı ailesi 12'nin (SLC12) bir üyesidir ^ve Cl-homeostazın düzgün çalışması ve sonuç olarak fonksiyonel GABAerjik inhibisyon ^1,2,3,4 için gereklidir. KCC2 ile 4-6 mM'de düşük intranöronal Cl-konsantrasyonunun ([Cl^-]_i) korunması, beyin ve omurilikte ^{γ-aminobütirik} asit (GABA) / glisin hiperpolarizasyonunu ve sinaptik inhibisyonunu kolaylaştırır⁵. KCC2'nin uygun şekilde düzenlenmesindeki başarısızlık, epilepsi⁴ de dahil olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıkların prevalansı ile ilişkilendirilmiştir. Ayrıca, azalmış KCC2 aracılı Cl⁻ ekstrüzyon ve bozulmuş hiperpolarize edici GABA_A ve / veya glisin reseptörü aracılı akımlar epilepsi, nöropatik ağrı ve spastisite ^6,7 ile ilişkilendirilmiştir. Nöronal KCC2, C-terminali hücre içi etki alanındaki anahtar düzenleyici kalıntıların, lizinsiz (WNK)-STE20 / SPS1 ile ilişkili prolin / alanin bakımından zengin (SPAK) / Oksidatif strese duyarlı (OSR) kinaz sinyal kompleksi¹ tarafından fosforilasyonu yoluyla negatif olarak modüle edilir ve bu da olgunlaşmamış nöronlarda depolarize GABA aktivitesinin korunmasını kolaylaştırır ^2,8,9 . WNK-SPAK / OSR1, treonin kalıntıları 906 ve 1007'yi (Thr906 / Thr1007) fosforile eder ve daha sonra KCC2'nin mRNA gen ekspresyonunu aşağı regüle eder ve bunun sonucunda fizyolojik fonksiyonunda^bozulmaya yol açar ^8,10. Bununla birlikte, daha da önemlisi, WNK-SPAK / OSR1 kinaz kompleksinin KCC2 ekspresyonu 1,2,4,11,12'yi fosforile ettiği ve inhibe ettiği ve Thr906 / Thr1007'yi fosforile etmek için kinaz kompleksi sinyal yollarının inhibisyonunun KCC2 mRNA geninin artan ekspresyonu ile bağlantılı olduğu zaten bir gerçektir^13,14,15 . Nöronal KCC2 ve Na⁺-K⁺-2Cl^- kotransporters 1 (NKCC1) ekspresyonunun protein fosforilasyonu yoluyla düzenlenmesinin eşzamanlı ve ters paternlerde^1,4,16 olarak çalıştığını belirtmek önemlidir.

Araştırmacıların işlevlerini ve faaliyetlerini incelemelerini sağlayan tekniklerin geliştirilmesine akredite edilmiş KCC2'nin düzenlenmesinde yer alan mekanizmaların anlaşılması konusunda tutarlı ve önemli ilerlemeler kaydedilmiştir; doğrudan (kinaz düzenleyici bölgelerin fosforilasyonunu değerlendirmek) veya dolaylı (GABA aktivitesini gözlemlemek ve izlemek) araştırmalar yoluyla . Burada sunulan protokol, kinaz düzenleyici bölgeler Thr906/1007'de kotransporterin fosforilasyonunu araştırarak nöronal K ⁺ -Cl - ^{ko-transporter} KCC2'nin fonksiyonlarını ve aktivitelerini incelemek için batı lekeleme tekniklerinin uygulanmasını vurgulamaktadır.

Western blot, bir doku veya hücre örneğinden ilgilenilen spesifik proteinleri tespit etmek için kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem önce proteinleri elektroforez yoluyla boyutlarına göre ayırır. Proteinler daha sonra, hedef protein spesifik bir antikor kullanılarak işaretlenmeden önce elektroforetik olarak katı bir desteğe (genellikle bir zar) aktarılır. Antikorlar, kolorimetrik, kemilüminesans veya floresan yöntemleri kullanılarak tespit edilen farklı etiketlere veya florofor konjuge antikorlara konjuge edilir. Bu, belirli bir hedef proteinin bir protein karışımından tespit edilmesini sağlar. Bu teknik, KCCs^1'in fosfospesifik bölgelerini karakterize etmek için kullanılmıştır ve KCC3 Thr991 / Thr1048 fosforilasyon^17'yi inhibe eden kinaz inhibitörlerini tanımlamak için kullanılmıştır. Bu protokolü izleyerek, hücre / doku lizatlarından toplam ve fosforile KCC2'yi spesifik olarak tespit edebilirsiniz. Prensip olarak, protein konjuge antikorların bu teknikle tespiti, fizyolojik düzenlemelerinde yer alan moleküler mekanizmalara ışık tutan KCC2'nin fosfo-bölgelerindeki işbirlikçi faaliyetlerin anlaşılmasını geliştirmeye yardımcı olduğu için oldukça etkilidir. Toplam protein ekspresyonunun kantitatif analizi, KCC2'nin işlevini ve aktivitesini temsil eder. Rubidyum iyonu ve talyum iyonu alım testi gibi KCC2 aktivitesini doğrudan ölçmek için kullanılan başka klasik yöntemler de vardır. GABA aktivitesini ölçmek için yama-kelepçe-elektrofizyoloji gibi diğer teknikler kullanılır; Bu nedenle, hücre içi klorür iyonu homeostazının değerlendirilmesi ile bilgilendirildiği gibi dolaylı olarak aktif ve / veya inaktive edilmiş KCC2'yi yansıtmaktadır.

Protokol

NOT: Protokol, ilgilenilen spesifik proteinleri tespit etmek için batı lekeleme yöntemini açıklar.

1. Hücre kültürü ve transfeksiyon

1. Hücre kültürü prosedüründen önce boncuk banyosundaki (37 ° C) tüm reaktifleri ısıtın. % 10 fetal sığır serumu,% 1 2mM L-glutamin, 100x esansiyel olmayan amino asit, 100 mM sodyum piruvat ve 100 birim / mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş kültür ortamı olan Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) hazırlayın.
2. Çözülebilir transfekte sıçan KCC2b insan embriyonik böbrek 293 hücre (HEK293^rnKCC2b)¹⁸ tamamen boncuk banyosunda (37 ° C). Hücreleri kriyoviyal tüpten 5 mL taze ortam içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreyi 3-5 dakika boyunca 1200 ×g'de döndürün.
3. Süpernatantı aspire etmek için bir aspiratör pipeti (vakum pompasına sabitlenmiş) kullanın ve hücreleri yeniden askıya almak için 10 mL taze ortam ekleyin. Hücre süspansiyonunu 10 cm'lik bir çanak tabağa aktarın.
4. Çanağı inkübatöre yerleştirin ve nemlendirilmiş% 5 CO₂ atmosferinde 37 ° C'de 48 saat büyümesine izin verin. Sağlıklı hücre büyümesini sağlamak için kuluçka süresini izleyin. Ayrıca, kuluçka döneminden sonra% 90'ın üzerinde birleşme elde ettiklerinde hücreleri bölün.
5. Eski ortamı hücre çanağından aspire edin ve hücreleri 2 mL fosfat tampon salin (PBS) ile nazikçe durulayın. 2 mL tripsin ekleyin ve oda sıcaklığında yaklaşık 1-2 dakika kuluçkaya yatırın.
6. Tripsinize hücreleri tabakta nazikçe yıkamak için 2 mL komple ortam kullanın. Yeni yemeklere 9 mL taze medya ekleyin ve eski yemekten yenilerinin her birine 1 mL çözelti ekleyin. Bölünmüş hücre kaplarını% 90'lık ≥ akıcılık elde etmek için 48 saat boyunca inkübatöre geri aktarın.
7. Hücreleri lizis tamponunda toplamadan önce hücreleri kontrol olarak dimetil sülfoksit (DMSO), 8 μM staurosporin veya 0.5 mM N-etilmaleimid (NEM) ile 15 dakika boyunca tedavi edin.

2. Hücre lizatlarının hazırlanması ve numunelerin yüklenmesi

1. Kültür çanağındaki medyayı aspire edin (transfeksiyon prosedürlerinden). Hücre kültürünü buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
2. PBS'yi aspire edin, ardından 50 mM tris-HCl (pH 7.5), 1 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter)-N,N,N′,N′-tetraasetik asit (EGTA), 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 50 mM sodyum florür, 5 mM sodyum pirofosfat, 10 mM sodyum-β-gliserofosfat, 1 mM sodyum ortovanadat,% 1 (w/v) Triton X-100, 0.27 M sakkaroz, içeren 1.0 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin, Yemeğe 1 mM benzamin,% 0.1 (v / v) 2-merkaptoetanol ve 2 mM fenilmetilsülfonilflorür (PMSF).
   NOT: Hücre hasadı sırasında lizis tamponunun hacmi, çanak boyutlarına göre değişir, örneğin, 1 x 10⁷ hücre/100 mm çanak/150 cm2 şişe başına 1 mL lizis tamponu uygunken, 5 x 10 6 hücre/⁶⁰ mm çanak/75^cm2 şişe başına 0,5 mL uygundur.
3. Hücreleri kabın altından kazımak için soğuk bir plastik hücre kazıyıcı kullanın, ardından hücre süspansiyonunu zaten buz üzerinde bulunan bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için yavaşça bir pipet kullanın. Tüpü 4 ° C'de 30 dakika boyunca sürekli çalkalayın.
4. Hücre lizatlarını 20 dakika boyunca 16.000 x g'da soğuk bir santrifüjde (4 ° C) döndürün, tüpü santrifüjden yavaşça çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Süpernatantı önceden soğutulmuş taze bir tüpe toplayın ve peleti atın.
   NOT: Hücre tipine bağlı olarak santrifüjleme kuvvetini ve süresini değiştirmek gerekebilir. Bununla birlikte, genel kurallar 20 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüjlemeyi teşvik eder. Ancak, bu her deney için belirlenmelidir. Örneğin, lökositler gibi hassas hücrelerin çok hafif bir santrifüj hızına ihtiyacı vardır.

3. İmmünopreçökitanların hücre lizatlarından hazırlanması

1. Pipet 300 μL protein-G-sefaroz bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilir. Çözeltiyi 2 dakika boyunca 500 x g'da döndürün ve süpernatanı atın.
2. 500 μL PBS ekleyin ve çözeltiyi iyice vorteksleyin. Çözeltiyi 2 dakika boyunca 500 x g'da döndürün ve süpernatanı atın. Bu adımı tekrarlayın.
3. 1 mg anti-KCC2 Thr906 ve anti-KCC2 Thr1007 antikorlarını 200 μL protein G-sefaroz boncukları ile karıştırın ve PBS ile 500 μL'ye kadar olan hacmi oluşturun. Titreşimli bir platformda veya dönen tekerlekte 4 °C'de 2 saat boyunca çalkalayın. PBS ile 2 kat yıkayın.
4. Tüm hücre lizatları üzerinde protein miktarı ölçümü yapın ve yıkanmış boncuklara 1 mg hücre lizatı ekleyin. Uçtan uca bir rotatörde 4 °C'de 2 saat boyunca nazikçe inkübe edin. Boncukları döndürün ve 150 mM sodyum klorür (NaCl) içeren PBS ile 3 kat yıkayın.
5. İmmünopreseptitanları (boncukları) 200 μL PBS ile 3 kat yıkayın. Son peleti 100 μL 1x lityum dodesil sülfat (LDS) numune tamponunda yeniden askıya alın.
6. Tüpleri oda sıcaklığında bir rotor çalkalayıcıda 5 dakika çalkalayın ve 10 dakika boyunca 75 ° C'de bir ısıtma bloğunda inkübe edin. Yükleme numunesini 2 dakika boyunca 11.000 x g'de santrifüj edin ve jel yükleme için süpernatantı kullanın.

4. Batı lekesini gerçekleştirmek

1. Döküm aparatını monte edin ve taze hazırlanmış% 8 ayırma jeli dökün (tarif/hazırlık için Tablo 1'e bakınız), jeli döküm camının üstünden yaklaşık 2 cm alana izin verecek şekilde dökün. Kuruluma 200 μL mutlak izopropanol ekleyin ve 60 dakika boyunca oda sıcaklığında durmasına izin verin.
   NOT: Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için poliakrilamid jel tarifi, ilgilenilen proteinin boyutuna bağlıdır (Tablo 2). Bu nedenle, istenen jel yüzdesini belirlemeden önce protein boyutunu not edin.
2. İzopropanolü çıkarmak için bir pipet kullanın ve jeli yaklaşık 200 μL damıtılmış su ile dikkatlice durulayın. Döküm kurulumundaki yaklaşık 2 cm'lik alanı doldurmak için taze hazırlanmış% 6 istifleme jeli ekleyin (tarif/hazırlık için Tablo 1'e bakınız). Kuyu tarağına yavaşça oturtun ve 30 dakika oda sıcaklığında bekletin.
3. Döküm jeli elektroforez tankına sabitleyin.
4. 10x transfer tamponu hazırlamak için 30.3 g Tris bazı, 144.1 g glisin ve 10 g SDS'yi 1000 mL damıtılmış suda çözün. 890 mL damıtılmış suya 10 mL %10 SDS ve 100 mL 10x transfer tamponu ekleyerek 1x çalışan tampon hazırlayın.
5. Tankın içine 1x çalışan tampon dökün. İlk kuyucuğa 5 μL moleküler ağırlık işaretleyicisi ve SDS-PAGE jelinin her bir kuyucuğuna eşit miktarda protein yükleyin (kullanılan tarak boyutuna bağlı olarak 18-30 μL arasında). Boş kuyucukları 1x LDS ile doldurun ve jeli 120 V'ta yaklaşık 90-120 dakika çalıştırın.
6. 10x transfer tamponu hazırlamak için 58.2 g Tris baz ve 29.3 g glisini 1000 mL damıtılmış suda çözün. Nitroselüloz membranı% 20 metanol içeren 1x transfer tamponu ile aktive edin. Jeli ve membranı transfer tamponu ile durulayın ve bunları hazırlama yığınına yavaşça yayın.
   NOT: Çalışan tamponların pH'ını ayarlamaya gerek yoktur, çünkü gereken optimum pH'ta olmaları gerekir. Ayrıca, zamandan tasarruf etmek için bu tamponların hazırlanması ve deneyden önce oda sıcaklığında saklanması önerilir.
7. Aktarılacak sandviçi şu sırayla düzenleyin: negatif elektrot (siyah çerçeve / uç) - sandviç köpüğü - filtre kağıdı - durulanmış SDS-PAGE jel - durulanmış nitroselüloz membran - filtre kağıdı - sandviç köpüğü - pozitif elektrot (kırmızı çerçeve). Birleştirilmiş sandviçi transfer tankına istifleyin ve 90 dakika boyunca 90 V'ta veya 360 dakika boyunca 30 V'ta çalıştırın.

5. Antikor boyama ve görüntü geliştirme

1. Membranı çıkarın ve kurumasını bekleyin. %0,1 1x Tween 20 (1x TBS-T) içeren Tris tamponlu salin içinde %5 yağsız sütten yapılmış bir blokaj tamponu kullanarak membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edin.
2. Membranları, oda sıcaklığında 1 saat boyunca veya 4 °C'de gece boyunca bloke edici tamponda uygun primer antikor ^8,15,19 ve beta-aktin (yükleme kontrolü) seyreltilmeleri ile inkübe edin. Membranı, her biri 5 dakika boyunca 1x TBS-T'lik üç yıkamada yıkayın.
   NOT: Ayrı membranın beta-aktin, alfa-tübülin veya gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz antikorları gibi yükleme kontrolleri ile inkübasyonu, sonraki niceleme sırasında diğer batı lekelenme sonuçlarını normalleştirmektir. Her birincil antikor için önerilen seyreltme, üreticinin el kitabında mevcuttur.
3. Yıkanmış membranı, oda sıcaklığında 60 dakika boyunca bloke edici tamponda 5000 kat seyreltilmiş sekonder antikor ile inkübe edin. Yine, membranı her biri 5 dakika boyunca 1x TBS-T'de 3x yıkayın.
   NOT: Sekonder antikorun, primer antikorun yükseldiği türlere karşı yükseltilmesi şiddetle tavsiye edilir. Örneğin, toplam KCC2'nin birincil antikoru fare anti-KCC2 ise, anti-fare için ikincil antikor kullanılmalıdır.
4. Yıkanmış zarı görüntüleme kartına yerleştirin. Her bir gelişmiş kemilüminesans (ECL) reaktifinin eşit hacimlerini karıştırın ve sinyaller geliştirmek için karışık çözeltiyi membran üzerine yavaşça yayın.

6. Bir görüntüleme sistemi kullanarak görüntü toplama ve veri ölçümü

1. Görüntüleme kartını, görüntüleme için görüntüleme sistemindeki uygun bölmeye aktarın. Görüntü işleme için bilgisayardaki görüntüleme yazılımını açın.
2. Araç çubuğunda, Yeni Protokol'ü tıklatın ve Tek Kanal'ı seçin. Jel görüntüleme/uygulama iletişim kutusu altında Seç'i tıklatın, Leke'ye gidin ve Chemi Hi Sensitivity veya Chemi Hi Resolution seçeneklerinden birini seçin. Ardından, elde edilecek görüntülerin süresini ve sayısını ayarlamak için Sinyal Biriktirme Kurulumu'na tıklayın.
3. Protokol kurulumu altında Konum Jeli'ne tıklayın ve gerekirse jeli görüntüleme sisteminde ayarlayın. Görüntüleri almak için Protokolü Çalıştır'ı tıklatın.
4. Görüntüleri bilgisayara kaydetmek için görüntüleme kataloğu kutusunun altındaki alınan görüntülerden birine sağ tıklayın. İstediğiniz görüntüye gidin ve Çalıştır iletişim kutusunun altındaki Görüntü Seç ve Devam Et'e tıklayın.
5. Görüntünün kontrastını ve piksel doygunluğunu ayarlamak için Görüntü Dönüştürme simgesine tıklayın. İstediğiniz görüntü formatına bağlı olarak görüntüyü bilgisayara kaydetmek için genel araç çubuğundaki Ekran Görüntüsü simgesine tıklayın.
6. ImageJ yazılımını kullanarak bant yoğunluklarını ölçün ve uygun istatistiksel araçları kullanarak analiz edin.

Sonuçlar

Burada, Şekil 1'de sunulan temsili sonuç, batı lekeleme tekniğini kullanarak KCC2b'yi (HEK rnKCC2b)¹⁸ kararlı bir şekilde eksprese eden HEK293 hücre hatlarında KCC2 ve^{NKCC1'in WNK-SPAK} / OSR1 aracılı fosforilasyonu üzerine staurosporin ve NEM'in etkisini araştırmıştır. Temsili sonuçlarla ilgili kapsamlı ayrıntılar Zhang ve ^ark.15'te tartışılmaktadır. NEM'e benzer şekilde, staurosporin, KCC2 taşıma ...

Tartışmalar

KCC2 de dahil olmak üzere nöronlarda eksprese edilen CCC'lerin SLC12 aktivitelerini ölçmek için birçok yöntem kullanılmıştır. Bu tekniklerin birçoğunun, bu taşıyıcıların fonksiyonel ilgisinin analizi ve hastalıkla ilgili farklı mutasyonlardaki yapı-fonksiyon paternleri hakkında bilimsel bilgiyi arttırdığı kanıtlanmıştır. Kritik olarak, çeşitli yöntemlerin avantajları ve uyarıları vardır²¹. Bununla birlikte, yukarıda açıklanan protokol, KCC2'nin işlevlerini ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions