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Résumé

Le présent protocole met en évidence l’application de la technique de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du cotransporteur neuronal K-Cl KCC2. Le protocole décrit l’étude de la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007 par transfert Western. En outre, des méthodes supplémentaires pour confirmer l’activité de KCC2 sont brièvement mises en évidence dans ce texte.

Résumé

Les cotransporteurs de chlorure de potassium 2 (KCC2) font partie de la famille des porteurs de soluté 12 (SLC12) des cotransporteurs de chlorure cationique (CCC), présents exclusivement dans le neurone et sont essentiels au bon fonctionnement de l’homéostasie Cl- et par conséquent à l’inhibition fonctionnelle du GABAergique. L’échec de la régulation correcte de KCC2 est délétère et a été associé à la prévalence de plusieurs maladies neurologiques, y compris l’épilepsie. Des progrès considérables ont été accomplis dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la réglementation du KCC2, accrédité pour le développement de techniques permettant aux chercheurs d’étudier ses fonctions et ses activités; soit par des enquêtes directes (évaluation de la phosphorylation des sites régulateurs kinases) ou indirectes (observation et surveillance de l’activité GABA). Ici, le protocole souligne comment étudier la phosphorylation de KCC2 sur les sites régulateurs de kinases - Thr906 et Thr1007 - en utilisant la technique de transfert western. Il existe d’autres méthodes classiques utilisées pour mesurer directement l’activité de KCC2, telles que le test d’absorption des ions rubidium et thallium. D’autres techniques telles que l’électrophysiologie patch-clamp-pince sont utilisées pour mesurer l’activité du GABA; par conséquent, reflétant indirectement KCC2 activé et / ou inactivé tel qu’informé par l’évaluation de l’homéostasie ionique chlorure intracellulaire. Quelques-unes de ces techniques supplémentaires seront brièvement discutées dans ce manuscrit.

Introduction

Le cotransporteur de chlorure de potassium 2 (KCC2) est un membre de la famille des porteurs de soluté 12 (SLC12) des cotransporteurs de chlorure de cations (CCC), présents exclusivement dans le neurone et est essentiel au bon fonctionnement de l’homéostasie Cl- et par conséquent à l’inhibition GABAergique fonctionnelle 1,2,3,4. Le maintien d’une faible concentration intraneuronale de Cl- ([Cl-]i) à 4-6 mM par KCC2 facilite l’hyperpolarisation de l’acide γ-aminobutyrique (GABA)/glycine et l’inhibition synaptique dans le cerveau et la moelle épinière5. L’échec de la régulation correcte de KCC2 a été associé à la prévalence de plusieurs maladies neurologiques, y compris l’épilepsie4. De plus, une diminution de l’extrusion Cl− médiée par KCC2 et une altération des courants hyperpolarisants médiés par le GABAA et/ou les récepteurs de glycine ont été impliqués dans l’épilepsie, la douleur neuropathique et la spasticité 6,7. Le KCC2 neuronal est modulé négativement par phosphorylation de résidus régulateurs clés dans son domaine intracellulaire C-terminal par le complexe de signalisation kinase proline/alanine-rich (SPAK)/sensible au stress oxydatif (OSR)lié à la proline/SPS1 sans lysine (WNK)-STE20/SPS1, qui facilite le maintien de l’activité dépolarisée du GABA dans les neurones immatures 2,8,9 . Le WNK-SPAK/OSR1 phosphoryle les résidus de thréonine 906 et 1007 (Thr906/Thr1007) et régule par la suite à la baisse l’expression du gène de l’ARNm de KCC2, entraînant une détérioration conséquente de sa fonction physiologique 8,10. Plus important encore, cependant, il est déjà un fait que le complexe kinase WNK-SPAK/OSR1 est connu pour phosphoryler et inhiber l’expression de KCC2 1,2,4,11,12, et que l’inhibition des voies de signalisation du complexe kinase pour phosphoryler Thr906/Thr1007 a été liée à l’expression accrue du gène de l’ARNm KCC2 13,14,15 . Il est important de noter que la régulation de l’expression neuronale KCC2 et Na+-K+-2Cl- cotransporteurs 1 (NKCC1) via la phosphorylation des protéines fonctionne de manière concomitante et inverse 1,4,16.

Des progrès constants et considérables ont été accomplis en ce qui concerne la compréhension des mécanismes impliqués dans la réglementation du KCC2, accrédités pour le développement de techniques permettant aux chercheurs d’étudier ses fonctions et ses activités; soit par des enquêtes directes (évaluation de la phosphorylation des sites régulateurs kinases) ou indirectes (observation et surveillance de l’activité GABA). Le protocole présenté ici met en évidence l’application des techniques de transfert Western pour étudier les fonctions et les activités du co-transporteur neuronal K+-Cl- KCC2 en étudiant la phosphorylation du cotransporteur sur les sites régulateurs de kinases Thr906/1007.

Le transfert Western est une méthode utilisée pour détecter des protéines spécifiques d’intérêt à partir d’un échantillon de tissu ou de cellule. Cette méthode sépare d’abord les protéines par taille par électrophorèse. Les protéines sont ensuite transférées électrophoristiquement sur un support solide (généralement une membrane) avant que la protéine cible ne soit marquée à l’aide d’un anticorps spécifique. Les anticorps sont conjugués à différents marqueurs ou anticorps conjugués au fluorophore qui sont détectés à l’aide de méthodes colorimétriques, de chimiluminescence ou de fluorescence. Cela permet de détecter une protéine cible spécifique à partir d’un mélange de protéines. Cette technique a été utilisée pour caractériser les sites phosphospécifiques des KCC1 et a été utilisée pour identifier les inhibiteurs de kinases qui inhibent la phosphorylation KCC3 Thr991/Thr104817. En suivant ce protocole, on peut détecter spécifiquement KCC2 total et phosphorylé à partir de lysats cellulaires / tissulaires. En principe, la détection d’anticorps conjugués aux protéines par cette technique est très instrumentale car elle permet d’améliorer la compréhension des activités coopératives sur les sites phosphographiques de KCC2, ce qui met en lumière les mécanismes moléculaires impliqués dans leurs régulations physiologiques. L’analyse quantitative de l’expression totale des protéines est représentative de la fonction et de l’activité de KCC2. Il existe d’autres méthodes classiques utilisées pour mesurer directement l’activité de KCC2, telles que le test d’absorption des ions rubidium et thallium. D’autres techniques telles que l’électrophysiologie patch-clamp-pince sont utilisées pour mesurer l’activité du GABA; par conséquent, reflétant indirectement KCC2 activé et / ou inactivé tel qu’informé par l’évaluation de l’homéostasie ionique chlorure intracellulaire.

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Protocole

REMARQUE : Le protocole décrit la méthode de transfert Western pour détecter des protéines d’intérêt spécifiques.

1. Culture cellulaire et transfection

  1. Réchauffer tous les réactifs dans le bain de billes (37 °C) avant la procédure de culture cellulaire. Préparer le milieu de culture, le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 1 % de L-glutamine de 2 mM, 100 fois plus d’acides aminés non essentiels, 100 mM de pyruvate de sodium et 100 unités/ml de pénicilline-streptomycine.
  2. Décongeler de manière stable les cellules embryonnaires rénales humaines KCC2b du rat KCC2b (HEK293rnKCC2b)18 complètement dans le bain de billes (37 °C). Transférer les cellules du tube cryovial dans un tube centrifuge contenant 5 mL de fluide frais. Faites tourner la cellule à 1200 ×g pendant 3-5 min.
  3. Utilisez une pipette d’aspiration (fixée à une pompe à vide) pour aspirer le surnageant et ajoutez 10 ml de fluide frais pour remettre les cellules en suspension. Transférer la suspension cellulaire dans une assiette à plat de 10 cm.
  4. Placer la capsule dans l’incubateur et laisser pousser pendant 48 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 . Surveiller la période d’incubation pour assurer une croissance cellulaire saine. Divisez davantage les cellules lorsqu’elles ont atteint plus de 90% de confluence après la période d’incubation.
  5. Aspirer les vieux milieux hors du plat de cellules et rincer doucement les cellules avec 2 mL de solution saline tampon phosphate (PBS). Ajouter 2 mL de trypsine et incuber pendant environ 1-2 minutes à température ambiante.
  6. Utilisez 2 mL de média complet pour laver délicatement les cellules trypsinisées dans le plat. Ajouter 9 ml de produits frais aux nouveaux plats et ajouter 1 ml de solution de l’ancien plat à chacun des nouveaux. Transférer les antennes à cellules divisées dans l’incubateur pendant 48 h pour atteindre ≥ confluence de 90%.
  7. Traiter les cellules avec soit du diméthylsulfoxyde (DMSO) comme témoin, 8 μM de staurosporine, ou 0,5 mM N-éthylmaléimide (NEM) pendant 15 minutes avant de récolter les cellules dans le tampon de lyse.

2. Préparation des lysats cellulaires et chargement des échantillons

  1. Aspirer les médias sur le plat de culture (à partir des procédures de transfection). Placez la culture cellulaire sur de la glace et lavez les cellules avec du PBS glacé.
  2. Aspirer le PBS, puis ajouter 1,0 mL de tampon de lyse glacée contenant 50 mM de tris-HCl (pH 7,5), 1 mM d’acide éthylèneglycol-bis(β-aminoéthyléther)-N,N,N′,N′-tétraacétique (EGTA), 1 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 50 mM de fluorure de sodium, 5 mM de pyrophosphate de sodium, 10 mM de sodium-β-glycérophosphate, 1 mM d’orthovanadate de sodium, 1% (p/v) Triton X-100, 0,27 M de saccharose, 1 mM de benzamine, 0,1 % (v/v) de 2-mercaptoéthanol et 2 mM de phénylméthylsulfonylfluorure (PMSF) dans la boîte.
    REMARQUE : Le volume de tampon de lyse pendant la récolte des cellules varie selon la taille des plats, par exemple, 1 mL de tampon de lyse convient par 1 x 107 cellules/boîte de 100 mm/150 cm 2 flacons, tandis que 0,5 mL convient par 5 x 106 cellules/boîte de 60 mm/75 cm2 flacons.
  3. Utilisez un grattoir de cellules en plastique froid pour gratter les cellules du fond de la boîte, puis utilisez doucement une pipette pour transférer la suspension de cellules dans un tube de microcentrifugation déjà sur la glace. Agiter constamment le tube pendant 30 min à 4 °C.
  4. Faites tourner les lysats cellulaires dans une centrifugeuse froide (4 °C) à 16 000 x g pendant 20 min, retirez doucement le tube de la centrifugeuse et placez-le sur de la glace. Recueillir le surnageant dans un tube frais prérefroidi et jeter le granulé.
    REMARQUE: Il peut être nécessaire de faire varier la force et le temps de centrifugation en fonction du type de cellule. Cependant, les directives générales encouragent la centrifugation à 16 000 x g pendant 20 min. Cependant, cela doit être déterminé pour chaque expérience. Par exemple, les cellules délicates comme les leucocytes ont besoin d’une vitesse de centrifugation très légère.

3. Préparation d’immunoprécipitants à partir de lysats cellulaires

  1. Pipeter 300 μL de protéine-G-sépharose dans un tube microcentrifugeux. Faire tourner la solution à 500 x g pendant 2 min et jeter le surnageant.
  2. Ajouter 500 μL de PBS et bien vorter la solution. Faire tourner la solution à 500 x g pendant 2 min et jeter le surnageant. Répétez cette étape.
  3. Mélanger 1 mg d’anticorps anti-KCC2 Thr906 et anti-KCC2 Thr1007 avec 200 μL de billes de protéine G-sépharose et compléter le volume à 500 μL avec PBS. Agiter sur une plate-forme vibrante ou une roue tournante pendant 2 h à 4 °C. Lavez 2x avec PBS.
  4. Effectuer la quantification des protéines sur les lysats de cellules entières et ajouter 1 mg du lysat cellulaire aux billes lavées. Incuber doucement dans un rotateur de bout en bout pendant 2 h à 4 °C. Faites tourner les billes et lavez-les 3x avec du PBS contenant 150 mM de chlorure de sodium (NaCl).
  5. Lavez les immunoprécipitants (billes) 3x avec 200 μL de PBS. Remettez en suspension la pastille finale dans 100 μL de 1x tampon d’échantillon de sulfate de dodécyle de lithium (LDS).
  6. Agiter les tubes dans un agitateur à rotor à température ambiante pendant 5 min et les incuber dans un bloc chauffant à 75 °C pendant 10 min. Centrifuger l’échantillon de chargement à 11 000 x g pendant 2 min et utiliser le surnageant pour le chargement du gel.

4. Exécution du transfert Western

  1. Assembler l’appareil de coulée et verser le gel de séparation à 8 % fraîchement préparé (voir le tableau 1 pour la recette/préparation) pour couler le gel en laissant environ 2 cm d’espace à partir du haut du verre de coulée. Ajouter 200 μL d’isopropanol absolu à l’installation et laisser reposer à température ambiante pendant 60 min.
    REMARQUE : La recette du gel de polyacrylamide pour l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) dépend de la taille de la protéine d’intérêt (tableau 2). Par conséquent, notez la taille de la protéine avant de déterminer le pourcentage de gel souhaité.
  2. Utilisez une pipette pour enlever l’isopropanol et rincez soigneusement le gel avec environ 200 μL d’eau distillée. Ajouter du gel empilable à 6 % fraîchement préparé (voir le tableau 1 pour la recette/préparation) pour remplir l’espace d’environ 2 cm sur la configuration de coulée. Ajuster délicatement dans le peigne du puits et laisser reposer à température ambiante pendant 30 min.
  3. Fixez le gel coulé dans le réservoir d’électrophorèse.
  4. Dissoudre 30,3 g de Tris base, 144,1 g de glycine et 10 g de SDS dans 1000 mL d’eau distillée pour préparer un tampon de transfert 10x. Préparer 1x tampon courant en ajoutant 10 ml de SDS à 10 % et 100 mL de tampon de transfert 10x à 890 mL d’eau distillée.
  5. Versez 1x tampon courant dans le réservoir. Charger 5 μL de marqueur de poids moléculaire dans le premier puits et une quantité égale de protéines dans chaque puits du gel SDS-PAGE (entre 18 et 30 μL, selon la taille du peigne utilisé). Remplissez les puits vides avec 1x LDS et faites fonctionner le gel pendant environ 90-120 minutes à 120 V.
  6. Dissoudre 58,2 g de Tris base et 29,3 g de glycine dans 1000 mL d’eau distillée pour préparer 10x tampon de transfert. Activer la membrane de nitrocellulose avec 1x tampon de transfert contenant 20% de méthanol. Rincez le gel et la membrane avec le tampon de transfert et étalez-les délicatement sur la pile de préparation.
    REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’ajuster le pH des tampons de fonctionnement et de transfert car ils doivent être au pH optimal requis. Aussi, il est conseillé de préparer ces tampons et de les stocker à température ambiante avant l’expérience pour gagner du temps.
  7. Disposez le sandwich à transférer dans cet ordre: électrode négative (cadre/extrémité noir) - mousse sandwich - papier filtre - gel FDS-PAGE rincé - membrane nitrocellulose rincée - papier filtre - mousse sandwich - électrode positive (cadre rouge). Empiler le sandwich assemblé dans le réservoir de transfert et fonctionner à 90 V pendant 90 min ou 30 V pendant 360 min.

5. Coloration des anticorps et développement de l’image

  1. Retirez la membrane et laissez-la sécher. Bloquer la membrane pendant 1 h à température ambiante à l’aide d’un tampon de blocage fabriqué à partir de lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée Tris contenant 0,1 % 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. Incuber les membranes avec des dilutions appropriées d’anticorps primaires 8,15,19 et de bêta-actine (contrôle de charge) dans un tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante ou pendant une nuit à 4 °C. Lavez la membrane en trois lavages de 1x TBS-T pendant 5 min chacun.
    REMARQUE : L’incubation de la membrane séparée avec des contrôles de charge tels que les anticorps bêta-actine, alpha-tubuline ou glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase vise à normaliser les autres résultats du Western blot lors de la quantification ultérieure. La dilution recommandée pour chaque anticorps primaire est disponible dans le manuel du fabricant.
  3. Incuber la membrane lavée avec un anticorps secondaire dilué 5000 fois dans un tampon bloquant pendant 60 min à température ambiante. Encore une fois, lavez la membrane 3x dans 1x TBS-T pendant 5 minutes chacune.
    REMARQUE : Il est fortement recommandé que l’anticorps secondaire soit élevé contre l’espèce chez laquelle l’anticorps primaire est élevé. Par exemple, si l’anticorps primaire de KCC2 total est anti-KCC2 de souris, alors l’anticorps secondaire pour l’anti-souris doit être utilisé.
  4. Placez la membrane lavée sur la carte d’imagerie. Mélanger des volumes égaux de chaque réactif de chimiluminescence améliorée (ECL) et étaler doucement la solution mélangée sur la membrane pour développer des signaux.

6. Acquisition d’images à l’aide d’un système d’imagerie et quantification des données

  1. Transférez la carte d’imagerie dans le compartiment approprié du système d’imagerie pour l’imagerie. Ouvrez le logiciel d’imagerie sur l’ordinateur pour le traitement de l’image.
  2. Dans la barre d’outils, cliquez sur Nouveau protocole et choisissez Single Channel (Canal unique). Cliquez sur Sélectionner sous la boîte de dialogue Imagerie sur gel/application, faites défiler jusqu’à Blot et sélectionnez Chemi Hi Sensitivity ou Chemi Hi Resolution. Cliquez ensuite sur Configuration de l’accumulation de signaux pour définir la durée et le nombre d’images à acquérir.
  3. Cliquez sur Position Gel sous la configuration du protocole et ajustez le gel dans le système d’imagerie si nécessaire. Cliquez sur Exécuter le protocole pour acquérir les images.
  4. Cliquez avec le bouton droit sur l’une des images acquises sous la zone du catalogue d’images pour enregistrer les images sur l’ordinateur. Accédez à l’image souhaitée et cliquez sur Sélectionner une image et continuer dans la boîte de dialogue Exécuter.
  5. Cliquez sur l’icône Transformation d’image pour ajuster le contraste et la saturation en pixels de l’image . Cliquez sur l’icône Capture d’écran dans la barre d’outils générale pour enregistrer l’image sur l’ordinateur en fonction du format d’image souhaité.
  6. Mesurez les densités de bandes à l’aide du logiciel ImageJ et analysez-les à l’aide d’outils statistiques appropriés.

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Résultats

Ici, le résultat représentatif présenté à la figure 1 a étudié l’impact de la staurosporine et de la NEM sur la phosphorylation médiée par WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 et NKCC1 dans les lignées cellulaires HEK293 exprimant de manière stable KCC2b (HEKrnKCC2b)18 en utilisant la technique de transfert Western. Des détails complets sur les résultats représentatifs sont discutés dans Zhang et al.15. Semblable à NEM, l...

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Discussion

De nombreuses méthodes ont été utilisées pour mesurer les activités de SLC12 des CCC qui sont exprimées dans les neurones, y compris KCC2. Bon nombre de ces techniques se sont avérées améliorer les connaissances scientifiques sur l’analyse de la pertinence fonctionnelle de ces transporteurs et de leurs schémas structure-fonction dans différentes mutations liées à la maladie. De manière critique, il y a des avantages et des mises en garde aux différentes méthodes21. Cependant, le ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Royal Society UK (subvention no. IEC\NSFC\201094) et une bourse de doctorat du Commonwealth.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
40% acrylamideSigma-AldrichA2917Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Ammonium Per SulfateSigma-Aldrich248614Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
anti pSPAKDundee UniversityS670BUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2Dundee UniversityS700CUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007Dundee UniversityS961CUsed as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906Dundee UniversityS959CUsed as primary antibody for western blotting
anti-mouseCell Signalling technology66002Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1Dundee UniversityS841BUsed as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212Dundee UniversityS763BUsed as primary antibody for western blotting
anti-rabbitCell Signalling technologyC29F4Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheepabcamab6900Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAKDundee UniversityS669DUsed as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin IIISigma-AldrichT8578Used as primary antibody for western blotting
BenzamineMerck UK135828Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209Used for lysate protein quantification
Casting apparatusAtto WSE-1165WUsed to run SDS-page electrophoresis
CentrifugeEppendorf5804Used in lysate preparation
CentrifugeVWRMicroStar 17RUsed for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLUsed for cell culture experiment
Dried Skimmed MilkMarvelN/AUsed to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucoseSigma-AldrichD6429Used for cell culture
ECL reagentPerkin ElmerORTT755/2655Used to develop image for western blotting
EDTAFisher ScientificD/0700/53Used as component of lysis buffer
EGTASigma-Aldriche4378Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power SupplyBioRadPowerPAC HCTo supply power to run SDS-page electrophoresis
EthanolThermoFisherE/0650DF/17Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivatedMerck Life Sciences UKF9665Used for cell culture
FumehoodWalkerA7277Used for cell culture
Gel Blotting - WhatmanGE Healthcare 10426981Used in western blotting to make transfer sandwich
GlycineSigma-Aldrich15527Used to make buffers
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USAVersion 6.0Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HClAcros Organics10647282Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Heating blockGrantQBT1Used to heat WB loading samples
HEK293 cellsMerck UK12022001-1VLCell line for culture experiment
ImageJ SoftwareWayne Rasband and Contributors; NIH, USA ImageJ 1.53eUsed to measure band intensities from western blotting images
Imaging systemBioRadChemiDoc MPUsed to take western blotting images
IncubatorLEECLEEC precision 190DUsed for cell culture
IsopropanolHoneywell24137Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solutionSigma-AldrichG7513Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)NovexNP0008Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid Merck Life Sciences UKM7145Used for cell culture
MicrocentrifugeEppendorf5418Used for preparing lysates for WB
Microplate readerBioRadiMarkUsed for lysate protein concentration readout
Microsoft PowerpointMicrosoft, USAPowerPoint2016Used to edit western blotting images
Molecular Weight MarkerBioRad1610373Used for western blotting
N-ethylmaleimideThermo Fisher Scientific23030Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membraneFisher Scientific45004091Used for western blotting
Penicillin-StreptomycinGibco15140122Used for cell culture
pH MeterMettler ToledoSeven compact s210Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer SalineSigma-AldrichD8537Used for cell culture
PKCδ pThr505Cell Signalling technology9374Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein GGeneronPG50-00-0002Used for immunoprecipitation
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653Used as component of wash buffer
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl SulfateSigma-AldrichL5750Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
sodium orthovanadateSigma-AldrichS6508Used as component of lysis buffer
Sodium PyruvateSigma-AldrichS8636Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphateMerck UKG9422Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)Scientific Laboratory Supplies, UKS4400-1MGUsed for cell culture experiment
SucroseScientifc Laboratory SuppliesS0389Used as component of lysis buffer
TEMEDSigma-AldrichT7024Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Transfer ChamberBioRad1658005EDUUsed in western blotting to transfer protein on membrane
TrisSigma-AldrichT6066Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE 
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA SolutionMerck Life Sciences UKT4049Used for cell culture
Tween-20Sigma-AldrichP3179Used as make TBS-T buffer
Vacuum pumpCharles AustenDymax 5Used for cell culture
VortexScientific IndustriesK-550-GEUsed in sample preparation
Vortex mixerScientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GEUsed of mixing resolved sample
Water bathGrant Instruments Ltd. (JB Academy)JBA5Used to incubate solutions

Références

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