Estudio de las funciones y actividades del cotransportador neuronal K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

Resumen

El presente protocolo destaca la aplicación de la técnica Western blotting para estudiar las funciones y actividades del cotransportador neuronal K-Cl KCC2. El protocolo describe la investigación de la fosforilación de KCC2 en los sitios reguladores de quinasa Thr906/1007 a través de Western blotting. Además, los métodos adicionales para confirmar la actividad de KCC2 se destacan brevemente en este texto.

Resumen

El cotransportador de cloruro de potasio 2 (KCC2) es un miembro de la familia de portadores de solutos 12 (SLC12) de los cotransportadores de cloruro catiónico (CCC), que se encuentra exclusivamente en la neurona y es esencial para el buen funcionamiento de la homeostasis de Cl^- y, en consecuencia, la inhibición GABAérgica funcional. La falla en la regulación adecuada de KCC2 es perjudicial y se ha asociado con la prevalencia de varias enfermedades neurológicas, incluida la epilepsia. Se ha avanzado considerablemente en la comprensión de los mecanismos implicados en la regulación del KCC2, acreditados para el desarrollo de técnicas que permitan a los investigadores estudiar sus funciones y actividades; ya sea a través de investigaciones directas (evaluación de la fosforilación de sitios reguladores de quinasas) o indirectas (observación y monitoreo de la actividad GABA). Aquí, el protocolo destaca cómo investigar la fosforilación de KCC2 en sitios reguladores de quinasa - Thr906 y Thr1007 - utilizando la técnica de Western Blotting. Existen otros métodos clásicos utilizados para medir directamente la actividad de KCC2, como el ion rubidio y el ensayo de captación de iones talio. Otras técnicas como la electrofisiología de parche-pinza se utilizan para medir la actividad de GABA; por lo tanto, refleja indirectamente KCC2 activado y/o inactivado según lo informado por la evaluación de la homeostasis del ion cloruro intracelular. Algunas de estas técnicas adicionales se discutirán brevemente en este manuscrito.

Introducción

El cotransportador de cloruro de potasio 2 (KCC2) es un miembro de la familia de portadores de solutos 12 (SLC12) de los cotransportadores catión-cloruro (CCC), que se encuentra exclusivamente en la neurona y es esencial para el buen funcionamiento de la homeostasis del Cl^- y, en consecuencia, de la inhibición GABAérgica funcional 1,2,3,4. El mantenimiento de una baja concentración intraneuronal de Cl- ([Cl-]_i) a 4-6 mM por KCC2 facilita la hiperpolarización del ácido ^{γ-aminobutírico} (GABA)/glicina y la inhibición sináptica en el cerebro y la médula espinal⁵. El fracaso en la regulación adecuada de KCC2 se ha asociado con la prevalencia de varias enfermedades neurológicas, incluyendo la epilepsia⁴. Además, la disminución de la extrusión de Cl⁻ mediada por KCC2 y la alteración de las corrientes hiperpolarizantes mediadas por GABA_A y/o receptores de glicina han sido implicadas en la epilepsia, el dolor neuropático y la espasticidad ^6,7. El KCC2 neuronal se modula negativamente a través de la fosforilación de residuos reguladores clave dentro de su dominio intracelular C-terminal por^{el complejo de} señalización de quinasa 1 con no-lisina (WNK)-STE20/SPS1 relacionado con prolina/alanina (SPAK)/oxidativo sensible al estrés (OSR), que facilita el mantenimiento de la actividad GABA despolarizada en neuronas inmaduras 2,8,9 . El WNK-SPAK/OSR1 fosforila los residuos de treonina 906 y 1007 (Thr906/Thr1007) y posteriormente regula a la baja la expresión génica del ARNm de KCC2, lo que lleva a un consiguiente deterioro de su función fisiológica ^8,10. Más importante aún, sin embargo, ya es un hecho que se sabe que el complejo quinasa WNK-SPAK / OSR1 fosforila e inhibe la expresión de KCC2 1,2,4,11,12, y que la inhibición de las vías de señalización del complejo quinasa para fosforilar Thr906 / Thr1007 se ha relacionado con el aumento de la expresión del gen ARNm KCC2 ^13,14,15 . Es importante señalar que la regulación de la expresión neuronal de los cotransportadores KCC2 y Na+-K⁺-2Cl^- 1 (NKCC1) a través de la fosforilación de proteínas funciona concomitantemente y en patrones inversos 1,4,16.

Ha habido avances consistentes y considerables en cuanto a la comprensión de los mecanismos involucrados en la regulación de KCC2, acreditados para el desarrollo de técnicas que permitan a los investigadores estudiar sus funciones y actividades; ya sea a través de investigaciones directas (evaluación de la fosforilación de sitios reguladores de quinasas) o indirectas (observación y monitoreo de la actividad GABA). El protocolo presentado aquí destaca la aplicación de técnicas de western blotting para estudiar las funciones y actividades del cotransportador neuronal K⁺-Cl^- KCC2 mediante la investigación de la fosforilación del cotransportador en los sitios reguladores de quinasas Thr906/1007.

Western blot es un método utilizado para detectar proteínas específicas de interés de una muestra de tejido o célula. Este método primero separa las proteínas por tamaño a través de la electroforesis. Luego, las proteínas se transfieren electroforéticamente a un soporte sólido (generalmente una membrana) antes de que la proteína objetivo se marque con un anticuerpo específico. Los anticuerpos se conjugan a diferentes etiquetas o anticuerpos conjugados con fluoróforos que se detectan mediante métodos colorimétricos, quimioluminiscencia o fluorescencia. Esto permite detectar una proteína diana específica a partir de una mezcla de proteínas. Esta técnica se ha utilizado para caracterizar sitios fosfoespecíficos de KCCs¹ y se ha utilizado para identificar inhibidores de quinasa que inhiben la fosforilación de KCC3 Thr991/Thr1048¹⁷. Al seguir este protocolo, se puede detectar específicamente KCC2 total y fosforilado a partir de lisados celulares/tisulares. En principio, la detección de anticuerpos conjugados con proteínas mediante esta técnica es muy instrumental, ya que ayuda a mejorar la comprensión de las actividades cooperativas en los fosfositios de KCC2, lo que arroja luz sobre los mecanismos moleculares implicados en sus regulaciones fisiológicas. El análisis cuantitativo de la expresión total de proteínas es representativo de la función y actividad de KCC2. Existen otros métodos clásicos utilizados para medir directamente la actividad de KCC2, como el ion rubidio y el ensayo de captación de iones talio. Otras técnicas como la electrofisiología de parche-pinza se utilizan para medir la actividad de GABA; por lo tanto, refleja indirectamente KCC2 activado y/o inactivado según lo informado por la evaluación de la homeostasis del ion cloruro intracelular.

Protocolo

NOTA: El protocolo describe el método Western blotting para detectar proteínas específicas de interés.

1. Cultivo celular y transfección

1. Calentar todos los reactivos en el baño de perlas (37 °C) antes del procedimiento de cultivo celular. Prepare el medio de cultivo, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1% de 2mM de L-glutamina, 100x aminoácido no esencial, 100 mM de piruvato de sodio y 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina.
2. Descongelar células embrionarias humanas 293 de rata KCC2b (HEK293^rnKCC2b)¹⁸ transfectadas de forma estable completamente en el baño de perlas (37 °C). Transfiera las células del tubo criovial a un tubo centrífugo que contenga 5 ml de medios frescos. Gire la celda a 1200 ×g durante 3-5 min.
3. Use una pipeta aspiradora (fijada a una bomba de vacío) para aspirar el sobrenadante y agregue 10 ml de medios frescos para volver a suspender las células. Transfiera la suspensión celular a una placa de plato de 10 cm.
4. Coloque el plato en la incubadora y déjelo crecer durante 48 h a 37 ° С en una atmósfera humidificada de 5% de_CO2 . Controle el período de incubación para garantizar un crecimiento celular saludable. Dividir aún más las células cuando han alcanzado más del 90% de confluencia después del período de incubación.
5. Aspire el medio viejo fuera del plato de células y enjuague suavemente las células con 2 ml de solución salina tampón fosfato (PBS). Añadir 2 ml de tripsina e incubar durante unos 1-2 min a temperatura ambiente.
6. Use 2 ml de medio completo para lavar suavemente las células tripsinizadas en el plato. Agregue 9 ml de medios frescos a los platos nuevos y agregue 1 ml de solución del plato viejo a cada uno de los nuevos. Transfiera las placas de células divididas a la incubadora durante 48 h para alcanzar ≥ confluencia del 90%.
7. Trate las células con dimetilsulfóxido (DMSO) como control, estaurosporina 8 μM o 0.5 mM N-etilmaleimida (NEM) durante 15 minutos antes de cosechar las células en tampón de lisis.

2. Preparación de lisados celulares y carga de muestras

1. Aspirar los medios en la placa de cultivo (de los procedimientos de transfección). Coloque el cultivo celular en hielo y lave las células con PBS helado.
2. Aspirar el PBS, luego agregar 1.0 ml de tampón de lisis helada que contiene 50 mM de tris-HCl (pH 7.5), 1 mM de etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N′,N′-tetraacético (EGTA), 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 50 mM de fluoruro de sodio, 5 mM pirofosfato de sodio, 10 mM de sodio-β-glicerofosfato, 1 mM de ortovanadato de sodio, 1% (p/v) Tritón X-100, 0,27 M de sacarosa, 1 mM de benzamina, 0.1% (v/v) 2-mercaptoetanol y 2 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) al plato.
   NOTA: El volumen del tampón de lisis durante la recolección celular varía según el tamaño de los platos, por ejemplo, 1 ml de tampón de lisis es adecuado por 1 x 10^{7 células} /plato de 100 mm/matraz de¹⁵⁰ cm 2, mientras que 0,5 ml es adecuado por matraz de 5 x 10⁶ células/plato de 60 mm/matraz de 75 cm² .
3. Use un raspador de células de plástico frío para raspar las células del fondo del plato, luego use suavemente una pipeta para transferir la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga que ya esté en hielo. Agitar constantemente el tubo durante 30 min a 4 °C.
4. Girar los lisados celulares en una centrífuga fría (4 °C) a 16.000 x g durante 20 min, retirar el tubo suavemente de la centrífuga y colocarlo sobre hielo. Recoja el sobrenadante en un tubo fresco preenfriado y deseche el pellet.
   NOTA: Puede ser necesario variar la fuerza de centrifugación y el tiempo dependiendo del tipo de célula. Sin embargo, las pautas generales fomentan la centrifugación a 16,000 x g durante 20 min. Sin embargo, esto debe determinarse para cada experimento. Por ejemplo, las células delicadas como los leucocitos necesitan una velocidad de centrifugación muy ligera.

3. Preparación de inmunoprecipitantes a partir de lisados celulares

1. Pipetear 300 μL de proteína-G-sefarosa en un tubo de microcentrífuga. Girar la solución a 500 x g durante 2 min y desechar el sobrenadante.
2. Añadir 500 μL de PBS y vorátice bien la solución. Girar la solución a 500 x g durante 2 min y desechar el sobrenadante. Repita este paso.
3. Mezclar 1 mg de anticuerpos anti-KCC2 Thr906 y anti-KCC2 Thr1007 con 200 μL de perlas de proteína G-sefarosa y completar el volumen a 500 μL con PBS. Agitar sobre una plataforma vibratoria o rueda giratoria durante 2 h a 4 °C. Lavar 2x con PBS.
4. Realice la cuantificación de proteínas en los lisados celulares completos y agregue 1 mg del lisado celular a las perlas lavadas. Incubar suavemente en un rotador de extremo a extremo durante 2 h a 4 °C. Gire las perlas y lávelas 3 veces con PBS que contenga 150 mM de cloruro de sodio (NaCl).
5. Lavar los inmunoprecipitantes (perlas) 3x con 200 μL de PBS. Resuspender el pellet final en 100 μL de 1x tampón de muestra de dodecil sulfato de litio (LDS).
6. Agitar los tubos en un agitador de rotor a temperatura ambiente durante 5 min e incubarlos en un bloque de calentamiento a 75 °C durante 10 min. Centrifugar la muestra de carga a 11.000 x g durante 2 min y utilizar el sobrenadante para la carga en gel.

4. Realización del western blot

1. Ensamble el aparato de fundición y vierta el gel separador recién preparado al 8% (consulte la Tabla 1 para la receta / preparación) para fundir el gel dejando aproximadamente 2 cm de espacio desde la parte superior del vidrio de fundición. Agregue 200 μL de isopropanol absoluto a la configuración y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 60 minutos.
   NOTA: La receta de gel de poliacrilamida para la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) depende del tamaño de la proteína de interés (Tabla 2). Por lo tanto, tome nota del tamaño de la proteína antes de determinar el porcentaje de gel deseado.
2. Use una pipeta para eliminar el isopropanol y enjuague cuidadosamente el gel con aproximadamente 200 μL de agua destilada. Agregue gel de apilamiento al 6% recién preparado (consulte la Tabla 1 para la receta / preparación) para llenar el espacio de aproximadamente 2 cm en la configuración de fundición. Encaje suavemente en el peine del pozo y deje reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
3. Fije el gel fundido en el tanque de electroforesis.
4. Disuelva 30.3 g de Tris base, 144.1 g de glicina y 10 g de SDS en 1000 ml de agua destilada para preparar 10x tampón de transferencia. Prepare 1x tampón de funcionamiento agregando 10 ml de SDS al 10% y 100 ml de tampón de transferencia 10x a 890 ml de agua destilada.
5. Vierta 1x búfer de funcionamiento en el tanque. Cargue 5 μL de marcador de peso molecular en el primer pocillo y una cantidad igual de proteína en cada pocillo del gel SDS-PAGE (entre 18-30 μL, dependiendo del tamaño del peine utilizado). Llene los pozos vacíos con 1x LDS y ejecute el gel durante aproximadamente 90-120 minutos a 120 V.
6. Disuelva 58.2 g de Tris base y 29.3 g de glicina en 1000 ml de agua destilada para preparar 10x tampón de transferencia. Active la membrana de nitrocelulosa con 1x tampón de transferencia que contiene 20% de metanol. Enjuague el gel y la membrana con el tampón de transferencia y extiéndalos suavemente sobre la pila de preparación.
   NOTA: No es necesario ajustar el pH de los tampones de funcionamiento y transferencia, ya que deben estar en el pH óptimo requerido. Además, es recomendable preparar estos tampones y almacenarlos a temperatura ambiente antes del experimento para ahorrar tiempo.
7. Organice el sándwich que se transferirá en este orden: electrodo negativo (marco / extremo negro) - espuma sándwich - papel de filtro - gel SDS-PAGE enjuagado - membrana de nitrocelulosa enjuagada - papel de filtro - espuma sándwich - electrodo positivo (marco rojo). Apile el sándwich ensamblado en el tanque de transferencia y funcione a 90 V durante 90 minutos o 30 V durante 360 minutos.

5. Tinción de anticuerpos y desarrollo de imágenes

1. Retire la membrana y déjela secar. Bloquear la membrana durante 1 h a temperatura ambiente utilizando un tampón de bloqueo hecho de leche desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris que contiene 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. Incubar las membranas con diluciones apropiadas del anticuerpo primario 8,15,19 y beta-actina (control de carga) en tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C. Lave la membrana en tres lavados de 1x TBS-T durante 5 minutos cada uno.
   NOTA: La incubación de la membrana separada con controles de carga como beta-actina, alfa-tubulina o anticuerpos gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa es para normalizar los otros resultados de Western blot durante la cuantificación posterior. La dilución recomendada para cada anticuerpo primario está disponible en el manual del fabricante.
3. Incubar la membrana lavada con anticuerpo secundario diluido 5000 veces en tampón de bloqueo durante 60 min a temperatura ambiente. Nuevamente, lave la membrana 3x en 1x TBS-T durante 5 minutos cada uno.
   NOTA: Se recomienda encarecidamente que el anticuerpo secundario se eleve contra la especie en la que se eleva el anticuerpo primario. Por ejemplo, si el anticuerpo primario de KCC2 total es anti-KCC2 de ratón, entonces se debe usar el anticuerpo secundario para anti-ratón.
4. Coloque la membrana lavada en el tablero de imágenes. Mezcle volúmenes iguales de cada reactivo de quimioluminiscencia mejorada (ECL) y extienda suavemente la solución mezclada sobre la membrana para desarrollar señales.

6. Adquisición de imágenes mediante un sistema de imágenes y cuantificación de datos

1. Transfiera la placa de imágenes al compartimento apropiado en el sistema de imágenes para obtener imágenes. Abra el software de imágenes en la computadora para el procesamiento de imágenes.
2. En la barra de herramientas, haga clic en Nuevo protocolo y elija Canal único. Haga clic en Seleccionar en el cuadro de diálogo de imágenes/aplicación de gel, desplácese hasta Mancha y seleccione Chemi Hi Sensitivity o Chemi Hi Resolution. Luego haga clic en Configuración de acumulación de señal para establecer la duración y el número de imágenes a adquirir.
3. Haga clic en Colocar gel en Configuración de protocolo y ajuste el gel en el sistema de imágenes si es necesario. Haga clic en Ejecutar protocolo para adquirir las imágenes.
4. Haga clic con el botón secundario en una de las imágenes adquiridas en el cuadro catálogo de imágenes para guardar las imágenes en el equipo. Navegue hasta la imagen deseada y haga clic en Seleccionar imagen y continuar en el cuadro de diálogo Ejecutar.
5. Haga clic en el icono Transformación de imagen para ajustar el contraste y la saturación de píxeles de la imagen . Haga clic en el icono Captura de pantalla en la barra de herramientas general para guardar la imagen en la computadora dependiendo del formato de imagen deseado.
6. Mida las densidades de banda utilizando el software ImageJ y analice utilizando herramientas estadísticas apropiadas.

Resultados

Aquí, el resultado representativo presentado en la Figura 1 investigó el impacto de la estaurosporina y NEM en la fosforilación mediada por WNK-SPAK/OSR1 de KCC2 y NKCC1 en líneas celulares HEK293 que expresan de manera estable KCC2b (HEK^rnKCC2b)¹⁸ utilizando la técnica de western blotting. Los detalles completos sobre los resultados representativos se discuten en Zhang et ^al.15. Similar a NEM, la estaurosporina es un i...

Discusión

Se han utilizado muchos métodos para medir las actividades de SLC12 de CCC que se expresan en las neuronas, incluido KCC2. Muchas de estas técnicas han demostrado mejorar el conocimiento científico sobre el análisis de la relevancia funcional de estos transportadores y sus patrones estructura-función en diferentes mutaciones relacionadas con la enfermedad. Críticamente, hay ventajas y advertencias para los diversos métodos²¹. Sin embargo, el protocolo explicado anteriormente, describió có...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions