Untersuchung der Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 mittels Western Blotting

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll hebt die Anwendung der Western-Blotting-Technik hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen. Das Protokoll beschreibt die Untersuchung der KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen Thr906/1007 mittels Western Blotting. Außerdem werden zusätzliche Methoden zur Bestätigung der KCC2-Aktivität in diesem Text kurz hervorgehoben.

Zusammenfassung

Kaliumchlorid-Cotransporter 2 (KCC2) sind ein Mitglied der gelösten Trägerfamilie 12 (SLC12) von Kation-Chlorid-Cotransportern (CCCs), die ausschließlich im Neuron vorkommen und für das reibungslose Funktionieren der Cl-Homöostase und folglich für die funktionelle GABAerge Hemmung unerlässlich sind. Das Versagen bei der richtigen Regulierung von KCC2 ist schädlich und wurde mit der Prävalenz mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich Epilepsie, in Verbindung gebracht. Es wurden beträchtliche Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen erzielt, die an der Regulierung von KCC2 beteiligt sind, die für die Entwicklung von Techniken verantwortlich sind, die es Forschern ermöglichen, seine Funktionen und Aktivitäten zu untersuchen; entweder durch direkte (Beurteilung der Phosphorylierung von Kinase-regulatorischen Stellen) oder indirekte (Beobachtung und Überwachung der GABA-Aktivität) Untersuchungen. Hier zeigt das Protokoll, wie die KCC2-Phosphorylierung an Kinase-regulatorischen Stellen - Thr906 und Thr1007 - mit der Western-Blotting-Technik untersucht werden kann. Es gibt andere klassische Methoden, die verwendet werden, um die KCC2-Aktivität direkt zu messen, wie Rubidium-Ionen- und Thallium-Ionen-Aufnahme-Assay. Weitere Techniken wie Patch-Clamp-Elektrophysiologie werden zur Messung der GABA-Aktivität eingesetzt; Daher indirekt reflektiert aktiviertes und/oder inaktiviertes KCC2, wie durch die Beurteilung der intrazellulären Chloridionenhomöostase informiert. Einige dieser zusätzlichen Techniken werden in diesem Manuskript kurz diskutiert.

Einleitung

Kaliumchlorid-Cotransporter 2 (KCC2) ist ein Mitglied der gelösten Trägerfamilie 12 (SLC12) von Kation-Chlorid-Cotransportern (CCCs), die ausschließlich im Neuron vorkommen und für das reibungslose Funktionieren der ^{Cl-Homöostase} und folglich für die funktionelle GABAerge Hemmung 1,2,3,4 unerlässlich sind. Die Aufrechterhaltung einer niedrigen intraneuronalen Cl-Konzentration ([Cl-]_i) bei 4-6 mM durch KCC2 erleichtert die Hyperpolarisation von ^{γ-Aminobuttersäure} (GABA)/Glycin und die synaptische Hemmung im Gehirn und Rückenmark ⁵. Das Versagen bei der richtigen Regulation von KCC2 wurde mit der Prävalenz mehrerer neurologischer Erkrankungen, einschließlich Epilepsie⁴, in Verbindung gebracht. Darüber hinaus wurden verminderte KCC2-vermittelte Cl−-Extrusion und gestörte hyperpolarisierende_GABA-A- und/oder Glycinrezeptor-vermittelte Ströme mit Epilepsie, neuropathischen Schmerzen und Spastik in Verbindung gebracht ^6,7. Neuronales KCC2 wird durch Phosphorylierung wichtiger regulatorischer Reste innerhalb seiner C-terminalen intrazellulären Domäne durch den mit No-Lysin (WNK)-STE20/SPS1-verwandten Prolin/Alanin-reichen (SPAK)/Oxidative Stress-responsive (OSR) Kinase-Signalkomplex¹ negativ moduliert, was die Aufrechterhaltung der depolarisierten GABA-Aktivität in unreifen Neuronen erleichtert ^2,8,9 . Der WNK-SPAK/OSR1 phosphoryliert die Threoninreste 906 und 1007 (Thr906/Thr1007) und reguliert anschließend die mRNA-Genexpression von KCC2 herunter, was zu einer Verschlechterung seiner physiologischen Funktion führt ^8,10. Noch wichtiger ist jedoch, dass es bereits eine Tatsache ist, dass der WNK-SPAK/OSR1-Kinase-Komplex dafür bekannt ist, die KCC2-Expression 1,2,4,11,12 zu phosphorylieren und zu hemmen, und dass die Hemmung der Kinase-Komplex-Signalwege zum Phosphorylat Thr906/Thr1007 mit der erhöhten Expression des KCC2-mRNA-Gens in Verbindung gebracht wurde^13,14,15 . Es ist wichtig zu beachten, dass die Regulation der neuronalen KCC2- und Na⁺-K⁺-^{2Cl-Cotransporter} 1 (NKCC1) Expression über Proteinphosphorylierung gleichzeitig und in umgekehrten Mustern 1,4,16 funktioniert.

Es wurden beständige und beträchtliche Fortschritte beim Verständnis der Mechanismen erzielt, die an der Regulierung von KCC2 beteiligt sind, die der Entwicklung von Techniken zugeschrieben wurden, die es Forschern ermöglichen, seine Funktionen und Aktivitäten zu untersuchen; entweder durch direkte (Beurteilung der Phosphorylierung von Kinase-regulatorischen Stellen) oder indirekte (Beobachtung und Überwachung der GABA-Aktivität) Untersuchungen. Das hier vorgestellte Protokoll hebt die Anwendung von Western-Blotting-Techniken hervor, um die Funktionen und Aktivitäten des neuronalen K⁺-Cl-Co-Transporters KCC2 zu untersuchen, indem die Phosphorylierung des Cotransporters an ^{Kinase-regulatorischen} Stellen Thr906/1007 untersucht wird.

Western Blot ist eine Methode, um bestimmte Proteine von Interesse aus einer Gewebe- oder Zellprobe nachzuweisen. Diese Methode trennt die Proteine zunächst durch Elektrophorese nach Größe. Die Proteine werden dann elektrophoretisch auf einen festen Träger (meist eine Membran) übertragen, bevor das Zielprotein mit einem spezifischen Antikörper markiert wird. Die Antikörper werden an verschiedene Tags oder fluorophorkonjugierte Antikörper konjugiert, die entweder kolorimetrische, Chemilumineszenz- oder Fluoreszenzmethoden nachgewiesen werden. Dadurch kann ein spezifisches Zielprotein aus einer Mischung von Proteinen nachgewiesen werden. Diese Technik wurde verwendet, um phosphospezifische Stellen von KCCs¹ zu charakterisieren und Kinase-Inhibitoren zu identifizieren, die die KCC3 Thr991/Thr1048-Phosphorylierung^{hemmen 17}. Durch die Befolgung dieses Protokolls kann man spezifisch Gesamt- und phosphoryliertes KCC2 aus Zell- / Gewebelysaten nachweisen. Prinzipiell ist der Nachweis von proteinkonjugierten Antikörpern durch diese Technik sehr hilfreich, da er dazu beiträgt, das Verständnis kooperativer Aktivitäten an den Phospho-Stellen von KCC2 zu verbessern, was Aufschluss über die molekularen Mechanismen gibt, die an ihrer physiologischen Regulation beteiligt sind. Die quantitative Analyse der Gesamtproteinexpression ist repräsentativ für die Funktion und Aktivität von KCC2. Es gibt andere klassische Methoden zur direkten Messung der KCC2-Aktivität, wie Rubidiumionen- und Thalliumionenaufnahme-Assay. Weitere Techniken wie Patch-Clamp-Elektrophysiologie werden zur Messung der GABA-Aktivität eingesetzt; Daher indirekt reflektiert aktiviertes und/oder inaktiviertes KCC2, wie durch die Beurteilung der intrazellulären Chloridionenhomöostase informiert.

Protokoll

HINWEIS: Das Protokoll beschreibt die Western-Blotting-Methode, um bestimmte Proteine von Interesse zu erkennen.

1. Zellkultur und Transfektion

1. Erwärmen Sie alle Reagenzien vor dem Zellkulturvorgang im Kugelbad (37 °C). Bereiten Sie das Kulturmedium Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) vor, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, jeweils 1% 2mM L-Glutamin, 100x nicht-essentieller Aminosäure, 100 mM Natriumpyruvat und 100 Einheiten / ml Penicillin-Streptomycin.
2. Ratte KCC2b humane embryonale Niere 293 Zellen (HEK293^rnKCC2b)¹⁸ stabil im Perlenbad (37 °C) auftauen. Die Zellen werden aus dem Kryoröhrchen in ein Zentrifugenröhrchen mit 5 ml frischem Medium überführt. Drehen Sie die Zelle bei 1200 ×g für 3-5 min.
3. Verwenden Sie eine Aspiratorpipette (befestigt an einer Vakuumpumpe), um den Überstand abzusaugen, und fügen Sie 10 ml frisches Medium hinzu, um die Zellen wieder zu suspendieren. Die Zellsuspension auf eine 10 cm lange Tellerplatte geben.
4. Stellen Sie die Schale in den Inkubator und lassen Sie sie 48 h bei 37 ° C in einer befeuchteten 5%_{CO2-Atmosphäre} wachsen. Überwachen Sie die Inkubationszeit, um ein gesundes Zellwachstum zu gewährleisten. Weitere Spaltung der Zellen, wenn sie nach der Inkubationszeit eine Konfluenz von über 90% erreicht haben.
5. Saugen Sie die alten Medien aus der Zellschale ab und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit 2 ml Phosphatpuffersalzlösung (PBS) ab. Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie für ca. 1-2 min bei Raumtemperatur.
6. Verwenden Sie 2 ml komplettes Medium, um die trypsinisierten Zellen in der Schale vorsichtig zu waschen. Fügen Sie 9 ml frische Medien zu neuen Gerichten hinzu und fügen Sie 1 ml Lösung aus dem alten Gericht zu jedem der neuen hinzu. Die gespaltenen Zellschalen für 48 h zurück in den Inkubator geben, um ≥ 90% Konfluenz zu erreichen.
7. Behandeln Sie die Zellen entweder mit Dimethylsulfoxid (DMSO) als Kontrolle, 8 μM Staurosporin oder 0,5 mM N-Ethylmaleimid (NEM) für 15 Minuten, bevor Sie die Zellen im Lysepuffer ernten.

2. Vorbereitung von Zelllysaten und Beladung von Proben

1. Absaugen der Medien auf der Kulturschale (aus Transfektionsverfahren). Die Zellkultur auf Eis legen und die Zellen mit eiskaltem PBS waschen.
2. Das PBS wird abgesaugt, dann 1,0 ml eiskalter Lysepuffer mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-Tetraessigsäure (EGTA), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 50 mM Natriumfluorid, 5 mM Natriumpyrophosphat, 10 mM Natrium-β-glycerophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat, 1% (w/v) Triton X-100, 0,27 M Saccharose, 1 mM Benzamin, 0,1% (v/v) 2-Mercaptoethanol und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) in die Schale.
   HINWEIS: Das Volumen des Lysepuffers während der Zellernte variiert mit der Schalengröße, zum Beispiel ist 1 ml Lysepuffer pro 1 x 10⁷ Zellen / 100 mm Schale / 150 cm 2 Kolben geeignet, während 0,5 ml pro 5 x 10⁶ Zellen / 60 mm Schale / 75 cm² Kolben geeignet ist.
3. Verwenden Sie einen kalten Kunststoffzellenschaber, um die Zellen vom Boden der Schale abzukratzen, und verwenden Sie dann vorsichtig eine Pipette, um die Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen, das bereits auf Eis liegt. Rühren Sie das Rohr 30 min lang konstant bei 4 °C.
4. Die Zelllysate in einer Kaltzentrifuge (4 °C) bei 16.000 x g für 20 min schleudern, das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge nehmen und auf Eis legen. Sammeln Sie den Überstand in ein vorgekühltes frisches Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet.
   HINWEIS: Je nach Zelltyp kann es notwendig sein, die Zentrifugationskraft und -zeit zu variieren. Allgemeine Richtlinien empfehlen jedoch die Zentrifugation bei 16.000 x g für 20 Minuten. Dies muss jedoch für jedes Experiment ermittelt werden. Zum Beispiel benötigen empfindliche Zellen wie Leukozyten eine sehr leichte Zentrifugationsgeschwindigkeit.

3. Herstellung von Immunpräzipitantien aus Zelllysaten

1. 300 μL Protein-G-Sepharose werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. Die Lösung bei 500 x g für 2 min drehen und den Überstand verwerfen.
2. Fügen Sie 500 μL PBS hinzu und wirbeln Sie die Lösung gut durch. Die Lösung bei 500 x g für 2 min drehen und den Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt.
3. Mischen Sie 1 mg Anti-KCC2 Thr906 und Anti-KCC2 Thr1007 Antikörper mit 200 μL Protein-G-Sepharose-Perlen und bilden Sie das Volumen auf 500 μL mit PBS. Auf einer vibrierenden Plattform oder einem rotierenden Rad 2 h bei 4 °C schütteln. 2x mit PBS waschen.
4. Führen Sie eine Proteinquantifizierung an den Ganzzelllysaten durch und fügen Sie 1 mg des Zelllysats zu den gewaschenen Perlen hinzu. In einem End-to-End-Rotator 2 h bei 4 °C vorsichtig inkubieren. Die Perlen herunterdrehen und 3x mit PBS waschen, das 150 mM Natriumchlorid (NaCl) enthält.
5. Immunpräzipitanten (Perlen) 3x mit 200 μL PBS waschen. Resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 100 μL 1x Lithiumdodecylsulfat (LDS) Probenpuffer.
6. Die Röhrchen in einem Rotorschüttler bei Raumtemperatur 5 min schütteln und in einem Heizblock bei 75 °C 10 min inkubieren. Zentrifugieren Sie die Beladungsprobe bei 11.000 x g für 2 min und verwenden Sie den Überstand zum Beladen des Gels.

4. Durchführung des Western Blots

1. Gießen Sie die Gießvorrichtung zusammen und gießen Sie frisch zubereitetes 8% Trenngel (siehe Tabelle 1 für Rezept/Zubereitung), um das Gel zu gießen, so dass etwa 2 cm Platz von der Oberseite des Gießglases bleibt. 200 μL absolutes Isopropanol in den Aufbau geben und 60 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
   HINWEIS: Das Polyacrylamid-Gelrezept für die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) hängt von der Größe des interessierenden Proteins ab (Tabelle 2). Notieren Sie sich daher die Proteingröße, bevor Sie den gewünschten Gelprozentsatz bestimmen.
2. Verwenden Sie eine Pipette, um das Isopropanol zu entfernen und spülen Sie das Gel vorsichtig mit etwa 200 μL destilliertem Wasser ab. Fügen Sie frisch zubereitetes 6%iges Stapelgel hinzu (siehe Tabelle 1 für Rezept/Zubereitung), um den ca. 2 cm großen Raum auf dem Gießaufbau aufzufüllen. Vorsichtig in den Brunnenkamm einlegen und 30 min bei Raumtemperatur stehen lassen.
3. Fixieren Sie das gegossene Gel in den Elektrophoresetank.
4. Lösen Sie 30,3 g Tris-Base, 144,1 g Glycin und 10 g SDS in 1000 ml destilliertem Wasser, um 10x Transferpuffer herzustellen. Bereiten Sie 1x Laufpuffer vor, indem Sie 10 mL 10% SDS und 100 mL 10x Transferpuffer zu 890 mL destilliertem Wasser hinzufügen.
5. Gießen Sie 1x Laufpuffer in den Tank. Laden Sie 5 μL Molekulargewichtsmarker in die erste Vertiefung und eine gleiche Menge Protein in jede Vertiefung des SDS-PAGE-Gels (zwischen 18-30 μL, abhängig von der verwendeten Kammgröße). Leere Vertiefungen mit 1x LDS auffüllen und das Gel ca. 90-120 min bei 120 V laufen lassen.
6. 58,2 g Tris-Base und 29,3 g Glycin werden in 1000 ml destilliertem Wasser gelöst, um einen 10-fachen Transferpuffer herzustellen. Aktivieren Sie die Nitrocellulosemembran mit 1x Transferpuffer, der 20% Methanol enthält. Spülen Sie das Gel und die Membran mit dem Transferpuffer ab und verteilen Sie sie vorsichtig auf dem Vorbereitungsstapel.
   HINWEIS: Es ist nicht erforderlich, den pH-Wert der Lauf- und Transferpuffer anzupassen, da sie den optimalen pH-Wert aufweisen sollten. Außerdem ist es ratsam, diese Puffer vorzubereiten und vor dem Experiment bei Raumtemperatur zu lagern, um Zeit zu sparen.
7. Ordnen Sie das zu übertragende Sandwich in dieser Reihenfolge an: negative Elektrode (schwarzer Rahmen/Ende) - Sandwichschaum - Filterpapier - gespültes SDS-PAGE Gel - gespülte Nitrozellulosemembran - Filterpapier - Sandwichschaum - positive Elektrode (roter Rahmen). Stapeln Sie das montierte Sandwich in den Transfertank und laufen Sie mit 90 V für 90 min oder 30 V für 360 min.

5. Antikörperfärbung und Bildentwicklung

1. Entfernen Sie die Membran und lassen Sie sie trocknen. Blockieren Sie die Membran für 1 h bei Raumtemperatur mit einem Blockpuffer aus 5% Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
2. Die Membranen werden mit geeigneten Verdünnungen des primären Antikörpers 8,15,19 und des Beta-Aktins (Belastungskontrolle) in Blockierpuffer für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie die Membran in drei Waschgängen von je 1x TBS-T für jeweils 5 min.
   HINWEIS: Die Inkubation der separaten Membran mit Belastungskontrollen wie Beta-Aktin, Alpha-Tubulin oder Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase-Antikörpern dient dazu, die anderen westlichen Blotting-Ergebnisse während der nachfolgenden Quantifizierung zu normalisieren. Die empfohlene Verdünnung für jeden primären Antikörper ist im Handbuch des Herstellers verfügbar.
3. Inkubieren Sie die gewaschene Membran mit sekundären Antikörpern, die 5000-fach in Blockierpuffer verdünnt sind, für 60 min bei Raumtemperatur. Auch hier waschen Sie die Membran 3x in 1x TBS-T für jeweils 5 min.
   HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, dass der sekundäre Antikörper gegen die Spezies erhöht wird, bei der der primäre Antikörper erhöht wird. Wenn beispielsweise der primäre Antikörper des Gesamt-KCC2 Maus-Anti-KCC2 ist, muss der sekundäre Antikörper für Anti-Maus verwendet werden.
4. Legen Sie die gewaschene Membran auf die Bildplatine. Mischen Sie gleiche Volumina jedes Reagenzes für verbesserte Chemilumineszenz (ECL) und verteilen Sie die gemischte Lösung vorsichtig auf der Membran, um Signale zu entwickeln.

6. Bildaufnahme mit einem Bildgebungssystem und Datenquantifizierung

1. Bringen Sie die Bildkarte für die Bildgebung in das entsprechende Fach des Bildgebungssystems. Öffnen Sie die Imaging-Software auf dem Computer für die Bildverarbeitung.
2. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Neues Protokoll und wählen Sie Single Channel (Einzelner Kanal). Klicken Sie im Dialogfeld Gelbildgebung/Anwendung auf Auswählen, scrollen Sie zu Blot und wählen Sie entweder Chemi Hi Sensitivity (Chemi Hi Sensitivität) oder Chemi Hi Resolution (Chemi Hi Sensitivität) oder Chemi Hi Resolution (Chemi Hi Resolution). Klicken Sie dann auf Signal Accumulation Setup, um die Dauer und Anzahl der aufzunehmenden Bilder festzulegen.
3. Klicken Sie unter Protokolleinstellungen auf Gel positionieren und passen Sie das Gel ggf. im Bildgebungssystem an. Klicken Sie auf Protokoll ausführen , um die Bilder abzurufen.
4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eines der erfassten Bilder im Feld Imaging-Katalog, um die Bilder auf dem Computer zu speichern. Navigieren Sie zum gewünschten Bild und klicken Sie im Dialogfeld Ausführen auf Bild auswählen und fortfahren .
5. Klicken Sie auf das Symbol Bildtransformation , um den Kontrast und die Pixelsättigung des Bildes anzupassen. Klicken Sie auf das Screenshot-Symbol in der allgemeinen Symbolleiste, um das Bild je nach gewünschtem Bildformat auf dem Computer zu speichern.
6. Messen Sie die Banddichten mit der ImageJ-Software und analysieren Sie sie mit geeigneten statistischen Tools.

Ergebnisse

Hier untersuchte das repräsentative Ergebnis in Abbildung 1 den Einfluss von Staurosporin und NEM auf die WNK-SPAK/OSR1-vermittelte Phosphorylierung von KCC2 und NKCC1 in HEK293-Zelllinien, die KCC2b (HEK^rnKCC2b)¹⁸ stabil exprimieren, unter Verwendung der Western Blotting-Technik. Umfassende Details zu den repräsentativen Ergebnissen werden in Zhang et ^al.15 diskutiert. Ähnlich wie NEM ist Staurosporin ein breiter Kinase-...

Diskussion

Viele Methoden wurden verwendet, um die Aktivitäten von SLC12 von CCCs zu messen, die in den Neuronen exprimiert werden, einschließlich KCC2. Viele dieser Techniken haben sich als wissenschaftliche Erkenntnisse über die Analyse der funktionellen Relevanz dieser Transporter und ihrer Struktur-Funktionsmuster bei verschiedenen krankheitsbedingten Mutationen erwiesen. Entscheidend ist, dass die verschiedenen Methoden Vorteile und Vorbehalte haben²¹. Das oben erläuterte Protokoll beschreibt jedoch...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting - Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions