In This Article

Summary

Obecny protokół podkreśla zastosowanie techniki western blotting do badania funkcji i aktywności kotransportera neuronalnego K-Cl KCC2. Protokół opisuje badanie fosforylacji KCC2 w miejscach regulatora kinazy Thr906/1007 poprzez western blot. W tym tekście pokrótce omówiono również dodatkowe metody potwierdzania aktywności KCC2.

Abstract

Kotransportery chlorku potasu 2 (KCC2) należą do rodziny nośników substancji rozpuszczonych 12 (SLC12) kotransporterów chlorku kationu (CCC), znajdują się wyłącznie w neuronach i są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania homeostazy Cl-, a w konsekwencji funkcjonalnego hamowania GABA-ergicznego. Niepowodzenie w prawidłowej regulacji KCC2 jest szkodliwe i wiąże się z występowaniem kilku chorób neurologicznych, w tym padaczki. Poczyniono znaczne postępy w zakresie zrozumienia mechanizmów związanych z regulacją KCC2, co przypisuje się rozwojowi technik umożliwiających naukowcom badanie jego funkcji i działania; albo poprzez bezpośrednie (ocena fosforylacji miejsc regulatorowych kinazy), albo pośrednie (obserwacja i monitorowanie aktywności GABA). W tym miejscu protokół podkreśla, w jaki sposób badać fosforylację KCC2 w miejscach regulatorowych kinaz - Thr906 i Thr1007 - przy użyciu techniki western blotting. Istnieją inne klasyczne metody stosowane do bezpośredniego pomiaru aktywności KCC2, takie jak test wychwytu jonów rubidu i talu. Dalsze techniki, takie jak elektrofizjologia patch-clamp-electrophysiolog, są wykorzystywane do pomiaru aktywności GABA; stąd pośrednie odzwierciedlenie aktywowanego i/lub inaktywowanego KCC2 na podstawie oceny homeostazy wewnątrzkomórkowych jonów chlorkowych. Kilka z tych dodatkowych technik zostanie pokrótce omówionych w tym manuskrypcie.

Introduction

Kotransportery chlorku potasu 2 (KCC2) należą do rodziny nośników substancji rozpuszczonych 12 (SLC12) kotransporterów chlorku kationu (CCC), znajdują się wyłącznie w neuronach i są niezbędne do prawidłowego funkcjonowania homeostazy Cl-, a w konsekwencji funkcjonalnego hamowania GABA-ergiczne1,2,3,4. Utrzymanie niskiego wewnątrzneuronalnego stężenia Cl- ([Cl-]i) na poziomie 4-6 mM przez KCC2 ułatwia hiperpolaryzację kwasu γ-aminomasłowego (GABA)/glicyny i hamowanie synaps w mózgu i rdzeniu kręgowym5. Niepowodzenie w prawidłowej regulacji KCC2 wiąże się z występowaniem kilku chorób neurologicznych, w tym epilepsji4. Co więcej, zmniejszona ekstruzja Cl− za pośrednictwem KCC2 i upośledzone hiperpolaryzujące prądy GABAA i / lub prądy za pośrednictwem receptora glicyny są związane z padaczką, bólem neuropatycznym i spastycznością6,7. Neuronalny KCC2 jest ujemnie modulowany poprzez fosforylację kluczowych reszt regulatorowych w obrębie C-końcowej domeny wewnątrzkomórkowej przez kompleks sygnalizacyjny kinazy reagującej na stres oksydacyjny (OSR) związany bez lizyny (WNK)-STE20/SPS1 (SPAK)/reagujący na stres oksydacyjny (OSR)1, co ułatwia utrzymanie zdepolaryzowanej aktywności GABA w niedojrzałych neuronach2,8,9. WNK-SPAK/OSR1 fosforyluje reszty treoniny 906 i 1007 (Thr906/Thr1007), a następnie obniża ekspresję genu mRNA KCC2, co w konsekwencji prowadzi do pogorszenia jego funkcji fizjologicznej8,10. Co ważniejsze jednak, faktem jest już, że kompleks kinazy WNK-SPAK/OSR1 jest znany z fosforylacji i hamowania ekspresji KCC21,2,4,11,12, oraz że hamowanie szlaków sygnałowych kompleksu kinazy do fosforylacji Thr906/Thr1007 zostało związane ze zwiększoną ekspresją genu mRNA KCC213,14,15. Ważne jest, aby zauważyć, że regulacja neuronalnej ekspresji kotransporterów KCC2 i Na+-K+-2Cl- 1 (NKCC1) poprzez fosforylację białek działa jednocześnie i w odwrotnych wzorcach1,4,16.

Nastąpił stały i znaczący postęp w zakresie zrozumienia mechanizmów związanych z regulacją KCC2, co przypisuje się rozwojowi technik, które umożliwiają badaczom badanie jego funkcji i aktywności; zarówno poprzez bezpośrednie (ocena fosforylacji miejsc regulatorowych kinazy), jak i pośrednie (obserwowanie i monitorowanie aktywności GABA). Przedstawiony tutaj protokół podkreśla zastosowanie technik western blotting do badania funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K+-Cl- KCC2 poprzez badanie fosforylacji kotransportera w miejscach regulatorowych kinazy Thr906/1007.

Western blot to metoda używana do wykrywania określonych białek z próbki tkanki lub komórki. Ta metoda najpierw rozdziela białka według wielkości za pomocą elektroforezy. Białka są następnie elektroforetycznie przenoszone na stałe podłoże (zwykle błonę), zanim białko docelowe zostanie oznaczone za pomocą specyficznego przeciwciała. Przeciwciała są sprzężone z różnymi znacznikami lub przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem, które są wykrywane za pomocą metod kolorymetrycznych, chemiluminescencyjnych lub fluorescencyjnych. Pozwala to na wykrycie określonego białka docelowego z mieszaniny białek. Technika ta została wykorzystana do scharakteryzowania fosfospecyficznych miejsc KCCs1 i została wykorzystana do identyfikacji inhibitorów kinaz, które hamują fosforylację KCC3 Thr991/Thr104817. Postępując zgodnie z tym protokołem, można specyficznie wykryć całkowitą i ufosforylowaną KCC2 z lizatów komórkowych / tkankowych. Zasadniczo wykrywanie przeciwciał sprzężonych z białkami za pomocą tej techniki jest bardzo istotne, ponieważ pomaga lepiej zrozumieć działania kooperacyjne w fosfomiejscach KCC2, co rzuca światło na mechanizmy molekularne zaangażowane w ich fizjologiczne regulacje. Analiza ilościowa całkowitej ekspresji białka jest reprezentatywna dla funkcji i aktywności KCC2. Istnieją inne klasyczne metody stosowane do bezpośredniego pomiaru aktywności KCC2, takie jak test wychwytu jonów rubidu i talu. Dalsze techniki, takie jak elektrofizjologia patch-clamp-electrophysiolog, są wykorzystywane do pomiaru aktywności GABA; stąd pośrednie odzwierciedlenie aktywowanego i/lub inaktywowanego KCC2 na podstawie oceny homeostazy wewnątrzkomórkowych jonów chlorkowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

UWAGA: Protokół opisuje metodę western blotting do wykrywania konkretnych białek będących przedmiotem zainteresowania.

1. Hodowla komórkowa i transfekcja

  1. Ogrzać wszystkie odczynniki w kąpieli perełkowej (37 °C) przed zabiegiem hodowli komórkowej. Przygotuj pożywkę hodowlaną, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, po 1% 2 mM L-glutaminy, 100 ml aminokwasów endogennych, 100 mM pirogronianu sodu i 100 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny.
  2. Stabilnie transfekowaną nerkę ludzką zarodkową KCC2b szczura rozmrozić 293 komórki (HEK293rnKCC2b)18 całkowicie w kąpieli perełkowej (37 °C). Przenieść komórki z probówki kriowialnej do probówki wirówkowej zawierającej 5 ml świeżej pożywki. Wiruj komórkę w temperaturze 1200 ×g przez 3-5 minut.
  3. Użyć pipety aspiratora (przymocowanej do pompy próżniowej) do zassania supernatantu i dodać 10 ml świeżej pożywki w celu ponownego zawieszenia komórek. Przenieść zawiesinę komórek na talerz o średnicy 10 cm.
  4. Umieścić naczynie w inkubatorze i pozostawić je do wzrostu przez 48 godzin w temperaturze 37 °С w wilgotnej atmosferze 5%CO2. Monitoruj okres inkubacji, aby zapewnić zdrowy wzrost komórek. Dalej dziel komórki, gdy osiągną ponad 90% zbieżności po okresie inkubacji.
  5. Odessać starą pożywkę z naczynia na komórki i delikatnie spłukać komórki 2 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Dodaj 2 ml trypsyny i inkubuj przez około 1-2 minuty w temperaturze pokojowej.
  6. Użyj 2 ml kompletnego podłoża, aby delikatnie umyć trypsynizowane komórki w naczyniu. Dodaj 9 ml świeżej pożywki do nowych naczyń i dodaj 1 ml roztworu ze starego naczynia do każdego z nowych. Przenieś szalki z podzielonymi komórkami z powrotem do inkubatora na 48 godzin, aby osiągnąć ≥ 90% zgrywki.
  7. Traktować komórki dimetylosulfotlenkiem (DMSO) jako kontrolą, 8 μM staurosporyną lub 0,5 mM N-etylomaleimidem (NEM) przez 15 minut przed zebraniem komórek w buforze do lizy.

2. Przygotowanie lizatów komórkowych i ładowanie próbek

  1. Odessać pożywkę na szalce hodowlanej (z procedur transfekcji). Umieść kulturę komórkową na lodzie i umyj komórki lodowatym PBS.
  2. Odessać PBS, a następnie dodać 1,0 ml lodowatego buforu do lizy zawierającego 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 1 mM glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego eter)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA), 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 50 mM fluorku sodu, 5 mM pirofosforanu sodu, 10 mM fosforanu β-glicerofosforanu, 1 mM ortowananianu sodu, 1% (m/v) Triton X-100, 0,27 M sacharozy, 1 mM benzaminy, 0,1% (v/v) 2-merkaptoetanolu i 2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) do naczynia.
    UWAGA: Objętość buforu do lizy podczas zbierania komórek różni się w zależności od wielkości naczynia, na przykład 1 ml buforu do lizy jest odpowiedni na 1 x 10 7 komórek/100 mm szalka/150 cm2 kolba, podczas gdy 0,5 ml jest odpowiednie na 5 x 106 komórek/60 mm talerz/75 cm2 kolba.
  3. Użyj zimnego plastikowego skrobaka do komórek, aby zeskrobać komórki z dna naczynia, a następnie delikatnie użyj pipety, aby przenieść zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej już na lodzie. Ciągle mieszać probówkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Wirować lizaty komórkowe w zimnej wirówce (4 °C) o sile 16 000 x g przez 20 minut, delikatnie wyjąć probówkę z wirówki i umieścić ją na lodzie. Zebrać supernatant do wstępnie schłodzonej świeżej probówki i wyrzucić granulki.
    UWAGA: Może być konieczne zróżnicowanie siły i czasu wirowania w zależności od typu komórki. Jednak ogólne wytyczne zalecają wirowanie przy 16 000 x g przez 20 minut. Musi to być jednak ustalone dla każdego eksperymentu. Na przykład delikatne komórki, takie jak leukocyty, wymagają bardzo niskiej prędkości wirowania.

3. Przygotowanie leków immunoprecypitacyjnych z lizatów komórkowych

  1. Odpipetować 300 μl białka-G-sefarozy do probówki mikrowirówkowej. Wirować roztwór o sile 500 x g przez 2 minuty i wyrzucić supernatant.
  2. Dodaj 500 μl PBS i dobrze wymieszaj roztwór. Wirować roztwór o sile 500 x g przez 2 minuty i wyrzucić supernatant. Powtórz ten krok.
  3. Zmieszać 1 mg przeciwciał anty-KCC2 Thr906 i anty-KCC2 Thr1007 z 200 μl kulek białkowych G-sefarozy i uzupełnić objętość do 500 μl PBS. Wstrząsać na platformie wibracyjnej lub obracającym się kole przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Umyć 2x za pomocą PBS.
  4. Przeprowadzić oznaczanie ilościowe białek na lizatach całych komórek i dodać 1 mg lizatu komórkowego do przemytych kulek. Delikatnie inkubować w rotatorze od końca do końca przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Odwirować kulki i umyć je 3x PBS zawierającym 150 mM chlorku sodu (NaCl).
  5. Leki immunostrącające (kulki) przemyć 3x 200 μL PBS. Zawiesić końcowe osady w 100 μl 1x buforu próbki dodecylosiarczanu litu (LDS).
  6. Potrząsać probówkami w wytrząsarce wirnikowej w temperaturze pokojowej przez 5 minut i inkubować je w bloku grzewczym w temperaturze 75 °C przez 10 minut. Odwirować załadowaną próbkę o masie 11 000 x g przez 2 minuty i użyć supernatantu do napełnienia żelem.

4. Wykonywanie western blot

  1. Zmontować aparat odlewniczy i wlać świeżo przygotowany 8% żel oddzielający (patrz Tabela 1 w celu uzyskania przepisu/przygotowania), aby odlać żel, pozostawiając około 2 cm wolnej przestrzeni od górnej części szkła odlewniczego. Dodać 200 μl absolutnego izopropanolu do zestawu i odstawić w temperaturze pokojowej na 60 min.
    UWAGA: Receptura żelu poliakryloamidowego do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanu sodu i poliakryloamidu (SDS-PAGE) zależy od wielkości białka będącego przedmiotem zainteresowania (Tabela 2). Dlatego zanotuj wielkość białka przed określeniem pożądanej zawartości procentowej żelu.
  2. Za pomocą pipety usuń izopropanol i ostrożnie spłucz żel około 200 μl wody destylowanej. Dodaj świeżo przygotowany 6% żel do układania w stosy (patrz Tabela 1 dla przepisu/przygotowania), aby wypełnić około 2 cm przestrzeni na zestawie odlewniczym. Delikatnie włóż grzebień do studzienki i odstaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.
  3. Umieść odlany żel w zbiorniku do elektroforezy.
  4. Rozpuść 30,3 g zasady Tris, 144,1 g glicyny i 10 g SDS w 1000 ml wody destylowanej, aby przygotować 10-krotny bufor transferowy. Przygotuj 1x bufor do biegania, dodając 10 ml 10% SDS i 100 ml 10x buforu transferowego do 890 ml wody destylowanej.
  5. Wlej 1x działający bufor do zbiornika. Załadować 5 μl markera masy cząsteczkowej do pierwszego dołka i taką samą ilość białka do każdego dołka żelu SDS-PAGE (od 18 do 30 μl, w zależności od użytego rozmiaru grzebienia). Napełnij puste studzienki 1x LDS i uruchom żel przez około 90-120 minut przy napięciu 120 V.
  6. Rozpuścić 58,2 g zasady Tris i 29,3 g glicyny w 1000 ml wody destylowanej, aby przygotować 10-krotny bufor transferowy. Aktywuj membranę nitrocelulozową za pomocą 1x buforu transferowego zawierającego 20% metanolu. Przepłukać żel i membranę buforem transferowym i delikatnie rozprowadzić je na stosie do przygotowania.
    UWAGA: Nie ma potrzeby dostosowywania pH biegowych i transferowych, ponieważ powinny one mieć optymalne wymagane pH. Wskazane jest również przygotowanie tych i przechowywanie ich w temperaturze pokojowej przed eksperymentem, aby zaoszczędzić czas.
  7. Ułóż kanapkę do przeniesienia w następującej kolejności: elektroda ujemna (ramka/koniec) - pianka warstwowa - bibuła filtracyjna - płukany żel SDS-PAGE - płukana membrana nitrocelulozowa - bibuła filtracyjna - pianka warstwowa - elektroda dodatnia (czerwona ramka). Ułóż zmontowaną kanapkę w zbiorniku transferowym i pracuj pod napięciem 90 V przez 90 minut lub 30 V przez 360 minut.

5. Barwienie przeciwciał i rozwój obrazu

  1. Zdejmij membranę i pozostaw do wyschnięcia. Zablokuj membranę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą buforu blokującego wykonanego z 5% odtłuszczonego mleka w soli fizjologicznej buforowanej Tris, zawierającej 0,1% 1x Tween 20 (1x TBS-T).
  2. Inkubować błony z odpowiednimi rozcieńczeniami przeciwciała pierwszorzędowego8,15,19 i beta-aktyny (kontrola obciążenia) w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Umyj membranę w trzech praniach 1x TBS-T przez 5 minut każde.
    UWAGA: Inkubacja oddzielnej błony z kontrolami obciążenia, takimi jak beta-aktyna, alfa-tubulina lub przeciwciała przeciwko dehydrogenazie 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego, ma na celu normalizację innych wyników western blot podczas późniejszej kwantyfikacji. Zalecane rozcieńczenie dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego jest dostępne w instrukcji producenta.
  3. Inkubować przemytą błonę z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym 5000-krotnie w buforze blokującym przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj membranę 3x w 1x TBS-T przez 5 minut każdy.
    UWAGA: Zdecydowanie zaleca się, aby przeciwciało drugorzędowe zostało podniesione przeciwko gatunkowi, u którego wytwarzane jest przeciwciało pierwszorzędowe. Na przykład, jeśli pierwszorzędowe przeciwciało całkowitego KCC2 jest mysim anty-KCC2, należy użyć przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszy.
  4. Umieść umytą membranę na tablicy obrazowej. Wymieszaj równe objętości każdego odczynnika do wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i delikatnie rozprowadź zmieszany roztwór na membranie, aby uzyskać sygnały.

6. Akwizycja obrazu za pomocą systemu obrazowania i kwantyfikacja danych

  1. Przenieś płytę obrazową do odpowiedniej komory w systemie obrazowania w celu obrazowania. Otwórz oprogramowanie do obrazowania na komputerze w celu przetworzenia obrazu.
  2. Na pasku narzędzi kliknij przycisk Nowy protokół i wybierz opcję Pojedynczy kanał. Kliknij Wybierz w oknie dialogowym Obrazowanie/aplikacja żelu, przewiń do pozycji Blot i wybierz opcję Chemi Hi Sensitivity lub Chemi Hi Resolution. Następnie kliknij Ustawienia akumulacji sygnału, aby ustawić czas trwania i liczbę obrazów do pobrania.
  3. Kliknij opcję Position Gel (Pozycja żelu) w obszarze protocol setup (Ustawienia protokołu) i w razie potrzeby dostosuj żel w systemie obrazowania. Kliknij przycisk Uruchom protokół, aby pobrać obrazy.
  4. Kliknij prawym przyciskiem myszy jeden z pobranych obrazów w polu katalogu obrazowania, aby zapisać obrazy na komputerze. Przejdź do żądanego obrazu i kliknij Wybierz obraz i kontynuuj w oknie dialogowym uruchamiania.
  5. Kliknij ikonę Przekształcenia obrazu, aby dostosować kontrast i nasycenie pikseli obrazu. Kliknij ikonę Zrzut ekranu na ogólnym pasku narzędzi, aby zapisać obraz na komputerze w zależności od żądanego formatu obrazu.
  6. Zmierz gęstości pasma za pomocą oprogramowania ImageJ i przeanalizuj za pomocą odpowiednich narzędzi statystycznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Tutaj reprezentatywny wynik przedstawiony w Rysunek 1 badał wpływ staurosporyny i NEM na fosforylację KCC2 i NKCC1 za pośrednictwem WNK-SPAK/OSR1 w liniach komórkowych HEK293 stabilnie eksprymujących KCC2b (HEKrnKCC2b)18 przy użyciu techniki western blotting. Szczegółowe informacje na temat reprezentatywnych wyników są omówione w Zhang et al.15. Podobnie jak NEM, staurosporyna jest szerokim inhibitorem kinazy, kt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Do pomiaru aktywności SLC12 CCC, które ulegają ekspresji w neuronach, zastosowano wiele metod, w tym KCC2. Udowodniono, że wiele z tych technik poszerza wiedzę naukową na temat analizy funkcjonalnego znaczenia tych transporterów i ich wzorców struktura-funkcja w różnych mutacjach związanych z chorobą. Co najważniejsze, istnieją zalety i zastrzeżenia dotyczące różnych metod21. Jednak protokół opisany powyżej nakreślił, w jaki sposób ocenić fosforylację KCC2 w miejscach reg...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

Ta praca była wspierana przez The Royal Society UK (Grant no. IEC\NSFC\201094) oraz stypendium doktoranckie Wspólnoty Narodów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40% akryloamidSigma-AldrichA2917Służy do produkcji żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE 
Amon Per SulfateSigma-Aldrich248614Służy do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE 
anti pSPAKDundee UniversityS670BStosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting
anty-KCC2Dundee UniversityS700C Stosowanyjako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting
anty-KCC2 pSer940Thermo Fisher ScientificPA5-95678Stosowany jako pierwszorzędowe
KCC2 pThr1007Dundee UniversityS961CStosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do western blotting
anty-KCC2 pThr906Dundee UniversityS959CStosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting
anty-mysiTechnologia sygnalizacji komórkowej66002Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe dla western blotting
anty-NKCC1Dundee UniversityS841BUżywany jako pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko
NKCC1 pThr203/207/212Dundee UniversityS763BStosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do technologii
sygnalizacji komórkowejprzeciw królikowiBlotting C29F4Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe do western blotting
anty-owczegoabcamab6900Stosowany jako przeciwciało drugorzędowe do western blotting
anty-SPAKDundee UniversityS669DStosowany jako przeciwciało pierwszorzędowe do western blotting
anty-β-tubulina IIISigma-AldrichT8578Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blott
BenzamineMerck UK135828Stosowany jako składnik buforu do lizy
Beta-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148Stosowany jako składnik buforu ładującego i buforu do lizy
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209Stosowany do ilościowego oznaczania białek lizatu
Aparatura odlewniczaAtto WSE-1165WSłuży do uruchamiania elektroforezy strony SDS
WirówkaEppendorf5804Używana do przygotowania lizatu
WirówkaVWRMicroStar 17RUżywana do przędzenia próbek
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLUżywany do eksperymentu z hodowlą komórkową
Suszone mleko odtłuszczone MarvelN/ASłuży do blokowania bufor
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoki poziom glukozySigma-AldrichD6429Używany do hodowli komórkowych
Odczynnik ECLPerkin ElmerORTT755/2655Używany do wywoływania obrazu do western blotting
EDTAFisher ScientificD/0700/53Stosowany jako składnik buforu do lizy
EGTASigma-Aldriche4378Stosowany jako składnik lizy bufor
Elektroforeza ZasilaczBioRadPowerPAC HCDo zasilania do uruchomienia elektroforezy stronicowej SDS
EtanolThermoFisherE/0650DF/17Służy do przygotowania wysterylizowanych urządzeń i środowiska
Surowica bydlęca płodu -  inaktywowana termicznieMerck Life Sciences UKF9665Używana do hodowli komórkowych
DymnikWalkerA7277Używany do hodowli komórkowych
Blotting żelowy - WhatmanGE Healthcare 10426981Używany w western blotting do produkcji kanapki transferowej
GlycineSigma-Aldrich15527Używany do produkcji
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USAWersja 6.0Używany do kreślenia wykresów i analizowania danych dla  western blotting
HClAcros Organics10647282Służy do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE 
Blok grzewczyGrantQBT1Służy do podgrzewania próbek ładujących WB
Ogniwa HEK293Merck UK12022001-1VLLinia komórkowa do eksperymentu hodowlanego
ImageJ SoftwareWayne Rasband i współpracownicy; NIH, Stany Zjednoczone ImageJ 1.53eSłuży do pomiaru intensywności pasma z obrazów western blotting
System obrazowaniaBioRadChemiDoc MPSłuży do wykonywania obrazów western blot
InkubatorLEECLEEC precision 190DUżywany do hodowli komórkowych
IsopropanolHoneywell24137Stosowany w żelu odlewniczym do elektroforezy
Roztwór L-glutaminySigma-AldrichG7513Używany do hodowli komórkowych
Dodecylosiarczan litu (LDS)NovexNP0008Używany jako bufor ładujący do western blotting
MEM Aminokwas endogenny Merck Life Sciences UKM7145Używany do hodowli komórkowych
MikrowirówkaEppendorf5418Używany do przygotowania lizatów do WB
Czytnik mikropłytekBioRadiMarkUżywany do odczytu stężenia białka lizatu
Microsoft PowerpointMicrosoft, USAPowerPoint2016Służy do edycji obrazów western blot
Markermasy cząsteczkowejBioRad1610373Używany do western blotting
N-etylomaleimidThermo Fisher Scientific23030Używany do eksperymentu z hodowlą komórkową
Membrana nitrocelulozowaFisher Scientific45004091Używany do western blot
Penicylina-StreptomycynaGibco15140122Używany do hodowli komórkowych
pH-metrMettler ToledoSeven compact s210Służy do monitorowania pH roztworów buforowych
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)Sigma-AldrichP7626Stosowany jako składnik buforu do lizy
Bufor fosforanowy Sól fizjologicznaSigma-AldrichD8537Stosowany do hodowli komórkowych
PKCδ pThr505Technologia sygnalizacji komórkowej9374Stosowany jako pierwszorzędowe przeciwciało do western blotting
Sepharose Protein GGeneronPG50-00-0002Stosowany do immunoprecypitacji
Chlorek soduSigma-AldrichS7653Stosowany jako składnik buforu płuczącego
Chlorek soduSigma-AldrichS7653Używany do przygotowania buforu TBS-T
Dodecyl Siarczan soduSigma-AldrichL5750Służy do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE 
orthovanadan soduSigma-AldrichS6508Stosowany jako składnik buforu do lizy
Pirogronian soduSigma-AldrichS8636Stosowany do hodowli komórkowych
sod-β-glicerofosforan MerckUKG9422Stosowany jako składnik buforu do lizy
Staurosporyna (od Streptomyces sp.)Scientific Laboratory Supplies, UKS4400-1MGUżywany do eksperymentu z hodowlą komórkową
SacharozaScientifc Laboratory SuppliesS0389Używany jako składnik buforu do lizy
TEMEDSigma-AldrichT7024Używany do wytwarzania żelu separującego i układającego w stosy dla SDS-PAGE 
Komora transferowaBioRad1658005EDUStosowana w western blottingu do przenoszenia białka na błonie
TrisSigma-AldrichT6066Stosowana do wytwarzania żelu separacyjnego i układającego w stosy dla SDS-PAGE 
Triton-X100Sigma-AldrichT8787Używany jako składnik buforu do lizy
Roztwór trypsyny-EDTA MerckLife Sciences UKT4049Używany do hodowli komórkowej
Tween-20Sigma-AldrichP3179Używany jako marka bufora TBS-T
Pompa próżniowaCharles AustenDymax 5Używany do hodowli komórkowych
VortexScientific IndustriesK-550-GEUżywany do przygotowania próbek
Mieszalnik wirowyScientific Industries LtdVortex-Genie  K-550-GESłuży do mieszania rozdzielczej próbki
Kąpiel wodna GrantInstruments Ltd. (JB Academy)JBA5Służy do inkubacji roztworów
przeciwciało przeciwko

References

  1. de Los Heros, P., et al. The WNK-regulated SPAK/OSR1 kinases directly phosphorylate and inhibit the K+-Cl- co-transporters. Biochemical Journal. 458 (3), 559-573 (2014).
  2. Heubl, M., et al. GABAA receptor dependent synaptic inhibition rapidly tunes KCC2 activity via the Cl(-)-sensitive WNK1 kinase. Nature Communications. 8 (-), 1776(2017).
  3. Schulte, J. T., Wierenga, C. J., Bruining, H. Chloride transporters and GABA polarity in developmental, neurological and psychiatric conditions. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 90, 260-271 (2018).
  4. Shekarabi, M., et al. WNK Kinase Signaling in Ion Homeostasis and Human Disease. Cell Metabolism. 25 (2), 285-299 (2017).
  5. Rivera, C., et al. The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarizing during neuronal maturation. Nature. 397 (6716), 251-255 (1999).
  6. Kahle, K. T., et al. Modulation of neuronal activity by phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC2. Trends in Neuroscience. 36 (12), 726-737 (2013).
  7. Andrews, K., Josiah, S. S., Zhang, J. The Therapeutic Potential of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 in Huntington's Disease and Its Comorbidities. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 9142(2020).
  8. Friedel, P., et al. WNK1-regulated inhibitory phosphorylation of the KCC2 cotransporter maintains the depolarizing action of GABA in immature neurons. Science Signaling. 8 (383), 65(2015).
  9. Watanabe, M., et al. Developmentally regulated KCC2 phosphorylation is essential for dynamic GABA-mediated inhibition and survival. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  10. Rinehart, J., et al. Sites of regulated phosphorylation that control K-Cl cotransporter activity. Cell. 138 (3), 525-536 (2009).
  11. Lu, D. C. -Y., et al. The role of WNK in modulation of KCl cotransport activity in red cells from normal individuals and patients with sickle cell anaemia. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 471 (11-12), 1539-1549 (2019).
  12. Huang, H., et al. The WNK-SPAK/OSR1 Kinases and the Cation-Chloride Cotransporters as Therapeutic Targets for Neurological Diseases. Aging and Disease. 10 (3), 626-636 (2019).
  13. AlAmri, M. A., Kadri, H., Alderwick, L. J., Jeeves, M., Mehellou, Y. The Photosensitising Clinical Agent Verteporfin Is an Inhibitor of SPAK and OSR1 Kinases. Chembiochem. 19 (19), 2072-2080 (2018).
  14. Zhang, J., et al. Modulation of brain cation-Cl(-) cotransport via the SPAK kinase inhibitor ZT-1a. Nature Communications. 11 (1), 78(2020).
  15. Zhang, J., et al. Staurosporine and NEM mainly impair WNK-SPAK/OSR1 mediated phosphorylation of KCC2 and NKCC1. PLoS One. 15 (5), 0232967(2020).
  16. Alessi, D. R., et al. The WNK-SPAK/OSR1 pathway: master regulator of cation-chloride cotransporters. Science Signaling. 7 (334), 3(2014).
  17. Zhang, J., et al. Functional kinomics establishes a critical node of volume-sensitive cation-Cl(-) cotransporter regulation in the mammalian brain. Scientific Reports. 6, 35986(2016).
  18. Hartmann, A. M., et al. Opposite effect of membrane raft perturbation on transport activity of KCC2 and NKCC1. Journal of Neurochemistry. 111 (2), 321-331 (2009).
  19. Pisella, L. I., et al. Impaired regulation of KCC2 phosphorylation leads to neuronal network dysfunction and neurodevelopmental pathology. Science Signaling. 12 (603), (2019).
  20. Blaesse, P., et al. Oligomerization of KCC2 correlates with development of inhibitory neurotransmission. The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10407-10419 (2006).
  21. Medina, I., Pisella, L. I. Neuronal Chloride Transporters in Health and Disease. , Elsevier. 21-41 (2020).
  22. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  23. Friedel, P., et al. A Novel View on the Role of Intracellular Tails in Surface Delivery of the Potassium-Chloride Cotransporter KCC2. eNeuro. 4 (4), (2017).
  24. Lee, Y. -C., et al. Impact of detergents on membrane protein complex isolation. Journal of Proteome Research. 17 (1), 348-358 (2018).
  25. Vallée, B., Doudeau, M., Godin, F., Bénédetti, H. Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (148), e59820(2019).
  26. Johansen, K., Svensson, L. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , Springer. 15-28 (1998).
  27. Mahmood, T., Yang, P. -C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429(2012).
  28. Klein, J. D., O'Neill, W. C. Volume-sensitive myosin phosphorylation in vascular endothelial cells: correlation with Na-K-2Cl cotransport. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 269 (6), 1524-1531 (1995).
  29. Hannemann, A., Flatman, P. W. Phosphorylation and transport in the Na-K-2Cl cotransporters, NKCC1 and NKCC2A, compared in HEK-293 cells. PLoS One. 6 (3), 17992(2011).
  30. Liu, J., Ma, X., Cooper, G. F., Lu, X. Explicit representation of protein activity states significantly improves causal discovery of protein phosphorylation networks. BMC Bioinformatics. 21 (13), 1-17 (2020).
  31. Terstappen, G. C. Nonradioactive rubidium ion efflux assay and its applications in drug discovery and development. Assay and Drug Development Technologies. 2 (5), 553-559 (2004).
  32. Carmosino, M., Rizzo, F., Torretta, S., Procino, G., Svelto, M. High-throughput fluorescent-based NKCC functional assay in adherent epithelial cells. BMC Cell Biology. 14 (1), 1-9 (2013).
  33. Adragna, N. C., et al. Regulated phosphorylation of the K-Cl cotransporter KCC3 is a molecular switch of intracellular potassium content and cell volume homeostasis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 255(2015).
  34. Zhang, D., Gopalakrishnan, S. M., Freiberg, G., Surowy, C. S. A thallium transport FLIPR-based assay for the identification of KCC2-positive modulators. Journal of Biomolecular Screening. 15 (2), 177-184 (2010).
  35. Yu, H. B., Li, M., Wang, W. P., Wang, X. L. High throughput screening technologies for ion channels. Acta Pharmacologica Sinica. 37 (1), 34-43 (2016).
  36. Hill, C. L., Stephens, G. J. An Introduction to Patch Clamp Recording. Patch Clamp Electrophysiology. , 1-19 (2021).
  37. Conway, L. C., et al. N-Ethylmaleimide increases KCC2 cotransporter activity by modulating transporter phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 292 (52), 21253-21263 (2017).
  38. Heigele, S., Sultan, S., Toni, N., Bischofberger, J. Bidirectional GABAergic control of action potential firing in newborn hippocampal granule cells. Nature Neuroscience. 19 (2), 263-270 (2016).
  39. Moore, Y. E., Deeb, T. Z., Chadchankar, H., Brandon, N. J., Moss, S. J. Potentiating KCC2 activity is sufficient to limit the onset and severity of seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 10166-10171 (2018).
  40. Kim, H. R., Rajagopal, L., Meltzer, H. Y., Martina, M. Depolarizing GABAA current in the prefrontal cortex is linked with cognitive impairment in a mouse model relevant for schizophrenia. Science Advances. 7 (14), 5032(2021).
  41. Yelhekar, T. D., Druzin, M., Karlsson, U., Blomqvist, E., Johansson, S. How to properly measure a current-voltage relation?-interpolation vs. ramp methods applied to studies of GABAA receptors. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 10(2016).
  42. Ishibashi, H., Moorhouse, A. J., Nabekura, J. Perforated whole-cell patch-clamp technique: a user's guide. Patch Clamp Techniques. , 71-83 (2012).
  43. Ebihara, S., Shirato, K., Harata, N., Akaike, N. Gramicidin-perforated patch recording: GABA response in mammalian neurones with intact intracellular chloride. The Journal of Physiology. 484 (1), 77-86 (1995).
  44. Kyrozis, A., Reichling, D. B. Perforated-patch recording with gramicidin avoids artifactual changes in intracellular chloride concentration. Journal of Neuroscience Methods. 57 (1), 27-35 (1995).
  45. Lamsa, K., Palva, J. M., Ruusuvuori, E., Kaila, K., Taira, T. Synaptic GABAA activation inhibits AMPA-kainate receptor-mediated bursting in the newborn (P0-P2) rat hippocampus. Journal of Neurophysiology. 83 (1), 359-366 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Kotransporter K Clregulacja KCC2analiza bia ekWestern blottingfosforylacja kinazyfunkcje fizjologicznekom rki KCC2b szczuraludzkie kom rki nerki embrionalnej 293hodowla kom rkowatrypsynazacjabufor do lizyleczenie staurosporynsultlenek dimetyluprob wka mikrowir wkowap ukanie PBS