Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) لتحليل حركية الارتباط والتفكك للربط بين أبتامر الحمض النووي والتتراسيكلين، بما في ذلك إعداد العينات، وتشغيل المعايير والعينات، وتفسير البيانات الناتجة.

Abstract

إن تحديد التقارب والسلوك الملزم بين aptamer وهدفه هو الخطوة الأكثر أهمية في اختيار واستخدام aptamer للتطبيق. نظرا للاختلافات الجذرية بين الأبتامر والجزيئات الصغيرة ، يحتاج العلماء إلى بذل الكثير من الجهد في توصيف خصائصها الملزمة. يعد كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) نهجا قويا لهذا الغرض. يتجاوز ITC تحديد ثوابت الانفصال (Kd) ويمكن أن يوفر تغيرات المحتوى الحراري وقياس stoichiometry المرتبط للتفاعل بين جزيئين في مرحلة الحل. يجري هذا النهج معايرة مستمرة باستخدام جزيئات خالية من الملصقات ويسجل الحرارة المنبعثة بمرور الوقت على أحداث الربط التي تنتجها كل معايرة بالتحليل الحجمي ، بحيث يمكن للعملية قياس الارتباط بين الجزيئات الكبيرة وأهدافها الصغيرة بحساسية. هنا ، تقدم المقالة إجراء خطوة بخطوة لقياس ITC ل aptamer مختار مع هدف صغير ، التتراسيكلين. يثبت هذا المثال براعة التقنية وإمكاناتها للتطبيقات الأخرى.

Introduction

Aptamers هي شظايا ssDNA أو RNA يتم اختيارها من خلال عملية تطور ذات تقارب وخصوصية عالية الارتباط بالأهداف المرجوة1,2 ، والتي يمكن أن تعمل كعناصر التعرف المتقدمة أو الأجسام المضادة الكيميائية 3,4,5. وبالتالي ، فإن التقارب والخصوصية الملزمين ل aptamers لأهدافهم يلعبان دورا حاسما في اختيار وتطبيق aptamer ، وقد تم استخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) على نطاق واسع لأغراض التوصيف هذه. تم استخدام العديد من الأساليب لتحديد تقارب aptamers ، بما في ذلك ITC ، ورنين البلازمون السطحي (SPR) ، والمعايرة بالتحليل الحجمي اللوني ، والرحلان الحراري المجهري (MST) ، وقياس تداخل الطبقة الحيوية (BLI). من بينها ، ITC هي واحدة من أحدث التقنيات لتحديد الارتباط الديناميكي الحراري والحركي لجزيئين في مرحلة الحل. يقوم هذا النهج بإجراء معايرة مستمرة باستخدام جزيئات خالية من الملصقات ويسجل الحرارة المنبعثة بمرور الوقت على أحداث الربط الناتجة عن كل معايرة 6,7. وخلافا للطرق الأخرى، يمكن لمركز التجارة الدولية أن يوفر تقاربا ملزما، والعديد من مواقع الربط، والارتباط الديناميكي الحراري والحركي (الشكل 1 ألف). من هذه المعلمات الأولية ، يتم تحديد تغيرات الطاقة الحرة Gibbs وتغيرات الإنتروبيا باستخدام العلاقة التالية:

ΔG = ΔH-TΔS

وهذا يعني أن مركز التجارة الدولية يقدم لمحة ديناميكية حرارية كاملة للتفاعل الجزيئي لتوضيح آليات الربط (الشكل 1B). من الصعب تحديد تقارب الارتباط للجزيئات الصغيرة ذات الأبتامر بسبب الأحجام المختلفة بشكل كبير بين أبتامر والهدف. وفي الوقت نفسه ، يمكن أن يوفر مركز التجارة الدولية قياسا حساسا دون وضع علامات على الجزيئات وشل حركتها ، مما يوفر وسيلة للحفاظ على البنية الطبيعية للأبتيمر والهدف أثناء القياس. مع السمات المذكورة ، يمكن استخدام ITC كطريقة قياسية لتوصيف الارتباط بين aptamer والأهداف الصغيرة.

بعد الاختيار من قبل مجموعة Gu ، تم دمج هذا aptamer مع منصات مختلفة ، بما في ذلك أجهزة الاستشعار الحيوية الكهروكيميائية القائمة على aptamer ، وفحص aptamer المرتبط بالإنزيم التنافسي ، ولوحة microtiter ، والتي يمكن أن تحقق كشفا عالي الإنتاجية للتتراسيكلين 8,9,10. ومع ذلك ، لم يتم توضيح خصائصه الملزمة بشكل جيد بما يكفي لاختيار النظام الأساسيالمناسب 8 ؛ يجدر توصيف ربط الأبتامر بالتتراسيكلين باستخدام ITC.

Protocol

ملاحظة: يوضح الشكل 2 الخطوات الرئيسية لتجربة مركز التجارة الدولية لتحديد الارتباط الديناميكي الحراري والحركي لأبتمير الحمض النووي والتتراسيكلين.

1. إعداد العينات

ملاحظة: يجب إعداد عينات لمركز التجارة الدولية في نفس المخزن المؤقت لكل من الأبتامر والليغاند لتجنب إطلاق الحرارة الناجم عن خلط مخازن مؤقتة مختلفة من خلية العينة والمحقنة. ويتحقق ذلك عادة من خلال غسيل الكلى لجميع المواد في نفس المخزن المؤقت. يتم تبادل المخزن المؤقت باستخدام بروتوكول مقتبس من بروتوكول مكثف قطع الوزن الجزيئي 3 kDa (MWC) مع بعض التعديلات ، على النحو التالي:

  1. قم بتنشيط غشاء عمود غسيل الكلى (3 kDa MWC) باستخدام 1x PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، الذي تم شراؤه من الشركة المصنعة ، باستخدام الخطوات التالية: املأ بمخزن مؤقت 1x (PBS) ، وتوازن لمدة 10 دقائق في RT ، وأجهزة طرد مركزي عند 5000 × g لمدة 15 دقيقة.
  2. قم بإزالة المخزن المؤقت وتحميل 500 ميكرولتر من عينات aptamer في العمود ، وأجهزة الطرد المركزي عند 5000 × g ، وكررها 4x لاستبدال المخزن المؤقت الأصلي ب 1x PBS. عندما يمر المخزن المؤقت عبر الغشاء ، ستمر جميع الجزيئات ذات الكتلة الأقل من 3 kDa عبر الغشاء ، وسيبقى aptamer على الجانب العلوي من الغشاء.
  3. اجمع أبتامر الحمض النووي المشوه باستخدام ماصة وانقله إلى أنبوب (أنابيب) 1.5 مل الجديد.
  4. جمع المخزن المؤقت تدفق الأخير لإذابة التتراسيكلين. مسحوق التتراسيكلين نقي وصغير ، لذلك ليست هناك حاجة إلى غسيل الكلى. ومع ذلك ، استخدم المخزن المؤقت السابق للحمض النووي للهدف للتأكد من أن المخزن المؤقت للتجربة في المحقنة يتطابق مع المخزن المؤقت في الخلية المرجعية.
  5. حدد تركيز أبتامر مرة أخرى باستخدام مطياف مرئي للأشعة فوق البنفسجية. استخدم المخزن المؤقت الأخير للتبادل لضبط التركيز على 40 ميكرومتر تتراسيكلين و 2 ميكرومتر أبتامر.
  6. قم بطي أبتامر الحمض النووي عن طريق التسخين عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، والتبريد عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم العودة إلى RT لمدة 20 دقيقة.
  7. قم بتفريغ الأبتامر المطوي والتتراسيكلين الديالي باستخدام محطة إزالة الغاز أو مضخة تفريغ تم ضبطها على 600 مم زئبق عند 25 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة للقضاء على الغازات الذائبة.

2. غسل الأداة وتشغيل مجموعة الاختبار

  1. قم بتنظيف منافذ المذيبات لضمان وضوح مسار العينة بالكامل. نظف عن طريق التخلص من محلول النفايات وتحميلها بالميثانول النقي والماء والعازل. يحتوي كل منفذ على أكثر من 250 مل لضمان حل كاف للتنظيف.
    ملاحظة: يتم إكمال عملية التنظيف تلقائيا بواسطة برنامج تحكم ITC قابل للبرمجة من قبل المستخدم.
  2. اختبر نظافة الجهاز عن طريق تشغيل ITC باستخدام المخزن المؤقت في مخزن مؤقت (أي 1x PBS إلى 1x PBS).
    ملاحظة: يظهر خط أساس الضوضاء العادي بين المخزن المؤقت الصغير إلى قمم حقن المخزن المؤقت. عندما يتم تنظيف حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي والقنية بشكل كاف وجافة تماما ، سيكون خط الأساس مستقرا ؛ تعكس الزيادة أو النقصان في خط الأساس الأجهزة أو الفقاعات القذرة داخل الأداة ، والتي تحتاج إلى تصحيح قبل تشغيل العينات الفعلية.
  3. اختبر دقة الجهاز باستخدام مجموعة قياسية تتضمن EDTA و CaCl2 (الشكل 3) ، باستخدام البرنامج الافتراضي واتباع الإرشادات الواردة من الشركة المصنعة.

3. تشغيل العينة لتحديد الارتباط بين أبتامر والتتراسيكلين

  1. قم بإعداد معلمات التشغيل: معدل تحريك يبلغ 200 دورة في الدقيقة ، يعمل عند 25 درجة مئوية ، 2 μM aptamer و 40 μM tetracycline ، 30 حقنة مع 2.0 ميكرولتر لكل منهما ، وقت تأخير 180 ثانية.
  2. تحقق من وحدات التخزين المطلوبة باستخدام آلة حاسبة برنامج قيد التشغيل. باستخدام معلمة التشغيل هذه ، قم بإجراء قياس ITC باستخدام 230 ميكرولتر من 40 ميكرومتر من التتراسيكلين في حقنة ITC و 485 ميكرولتر من 2 ميكرومتر aptamer في خلية عينة ITC باستخدام ITC.
  3. قم بتحميل ألواح حقنة التتراسيكلين المائلة والأبتامر المطوي في خلية العينة ، وتجنب الفقاعات ، باستخدام ماصة.
  4. ابدأ تشغيل أداة ITC بالنقر فوق زر البدء الموجود في البرنامج.
    ملاحظة: تتم عملية تشغيل أداة ITC مؤتمتة بالكامل بعد ملء الخلية المرجعية وألواح عينات المعايرة يدويا.

4. تحليل البيانات باستخدام البرامج

  1. افتح برنامج تحليل البيانات بالنقر المزدوج لبدء تحليل البيانات.
  2. افتح مسار البيانات الخام المحفوظة لمعرفة ميل الربط.
  3. افتح علامة تبويب النمذجة واستخدم نماذج ربط مختلفة للعثور على أفضل ملاءمة لمنحنى البيانات. بعد ذلك ، يقوم البرنامج تلقائيا بحساب مخطط الحرارة ITC ومختلف المعلمات الديناميكية الحرارية ، بما في ذلك المحتوى الحراري (ΔH) ، والانتروبيا (ΔS) ، والطاقة الحرة (ΔG) ، وثابت ربط التوازن (Ka) ، و stoichiometry.
  4. جمع المعلمات الديناميكية الحرارية المحددة من البيانات ومعلومات نموذج التركيب.
  5. قم بإنشاء تقرير، يتضمن صورا للمخطط الحراري لمركز التجارة الدولية ومختلف المعلمات الديناميكية الحرارية، كما هو موضح في الشكل 4 والجدول 1.

النتائج

يوفر ITC ثابت فك ارتباط دقيق (Kd) ، وقياس stoichiometry ملزم ، والمعلمات الديناميكية الحرارية للتفاعلات ثنائية الجزيء6. في هذا المثال، يرتبط الأبتامر الذي اختاره كيم وآخرون.9,11 بالتتراسيكلين مع تقاربات ملزمة من K d 1 = 13 μM، K d 2 = 53 nM

Discussion

تم تعديل الطريقة المعروضة هنا وفقا لتعليمات من TA Instruments وهي كافية لتحديد تقارب الارتباط والديناميكا الحرارية للعديد من aptamers والأهداف المختارة في مركزنا. تتضمن الخطوات الحاسمة من هذا الإجراء تبادل المخزن المؤقت للحصول على هدف يطابق الرباط ، وتشغيل العينات بمعلمات مناسبة ، وإيجاد نموذج من...

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا البحث من قبل تمويل البحث والتطوير من Aptagen LLC.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG
C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG
TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'		Integrated DNA Technologies, IncThe sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold CellsTA Instruments61000.901Isothermal titration calorimetry system
CaCl2Avantor (VWR)E506-100MLCalcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
CentrifugeEppendorf5417RThe Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)TA Instruments6326This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTATekNovaE0375EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisherND-ONE-WUV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal DevicesPall LaboratoryOD030C343 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4IBI ScientificIB70165Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge TubeslabForce (a Thomas Scientific Brand)1149K01
Tetracycline, HydrochorideEMD Millipore CorperationCAS64-75-5

References

  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  3. Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
  4. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
  5. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
  6. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
  7. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
  8. Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
  9. Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
  10. Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
  11. Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
  12. Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
  13. Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
  14. Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
  15. Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
  16. Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
  17. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

186 ITC Kd

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved