Determinazione dell'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e di una tetraciclina mediante calorimetria isotermica a titolazione

Riepilogo

Il presente protocollo descrive l'uso della calorimetria isotermica di titolazione (ITC) per analizzare l'associazione e la cinetica di dissociazione del legame tra un aptamero del DNA e una tetraciclina, compresa la preparazione del campione, gli standard di esecuzione e i campioni e l'interpretazione dei dati risultanti.

Abstract

La determinazione dell'affinità e del comportamento di legame tra un aptamero e il suo bersaglio è il passo più cruciale nella selezione e nell'utilizzo di un aptamero per l'applicazione. A causa delle drastiche differenze tra l'aptamero e le piccole molecole, gli scienziati devono impegnarsi molto per caratterizzare le loro proprietà leganti. La calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è un approccio potente per questo scopo. L'ITC va oltre la determinazione delle costanti di dissociazione (K_d) e può fornire le variazioni di entalpia e la stechiometria di legame dell'interazione tra due molecole nella fase di soluzione. Questo approccio conduce la titolazione continua utilizzando molecole label-free e registra il calore rilasciato nel tempo sugli eventi di legame prodotti da ciascuna titolazione, in modo che il processo possa misurare sensibilmente il legame tra le macromolecole e i loro piccoli bersagli. Qui, l'articolo introduce una procedura passo-passo della misurazione ITC di un aptamero selezionato con un piccolo bersaglio, la tetraciclina. Questo esempio dimostra la versatilità della tecnica e il suo potenziale per altre applicazioni.

Introduzione

Gli aptameri sono frammenti di ssDNA o RNA selezionati attraverso un processo evolutivo con elevata affinità di legame e specificità ai bersagli desiderati ^1,2, che possono funzionare come elementi di riconoscimento avanzato o anticorpi chimici 3,4,5. Pertanto, l'affinità di legame e la specificità degli aptameri ai loro bersagli svolgono un ruolo cruciale nella selezione e nell'applicazione di un aptamero e la calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è stata ampiamente utilizzata per questi scopi di caratterizzazione. Molti approcci sono stati utilizzati per determinare l'affinità degli aptameri, tra cui ITC, risonanza plasmonica di superficie (SPR), titolazione colorimetrica, termoforesi su microscala (MST) e interferometria a biostrati (BLI). Tra questi, ITC è una delle ultime tecniche per determinare l'associazione termodinamica e cinetica di due molecole nella fase di soluzione. Questo approccio conduce la titolazione continua utilizzando molecole label-free e registra il calore rilasciato nel tempo sugli eventi di legame prodotti da ciascuna titolazione ^6,7. A differenza di altri metodi, ITC può offrire affinità di legame, diversi siti di legame e associazione termodinamica e cinetica (Figura 1A). Da questi parametri iniziali, le variazioni di energia libera di Gibbs e le variazioni di entropia sono determinate usando la seguente relazione:

ΔG = ΔH-TΔS

Ciò significa che ITC offre un profilo termodinamico completo dell'interazione molecolare per chiarire i meccanismi di legame (Figura 1B). Determinare l'affinità di legame per piccole molecole con un aptamero è difficile a causa delle dimensioni drasticamente diverse tra aptamero e bersaglio. Nel frattempo, ITC può fornire misurazioni sensibili senza etichettare e immobilizzare le molecole, il che fornisce un mezzo per mantenere la struttura naturale dell'aptamero e del bersaglio durante la misurazione. Con gli attributi menzionati, ITC può essere utilizzato come metodo standard per la caratterizzazione del legame tra un aptamero e piccoli bersagli.

Dopo la selezione da parte del gruppo Gu, questo aptamero è stato integrato con diverse piattaforme, tra cui biosensori elettrochimici basati su aptamero, un test aptamero enzimatico competitivo e una piastra di microtitolazione, che può ottenere un rilevamento ad alta produttività della tetraciclina 8,9,10. Tuttavia, le sue caratteristiche di legame non sono state chiarite abbastanza bene da scegliere^{la piattaforma 8} corretta; vale la pena caratterizzare il legame dell'aptamero alla tetraciclina usando ITC.

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Protocollo

NOTA: La Figura 2 mostra le fasi principali dell'esperimento ITC per determinare l'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e della tetraciclina.

1. Preparazione dei campioni

NOTA: I campioni per ITC devono essere preparati nello stesso tampone sia per l'aptamero che per il ligando per evitare il rilascio di calore causato dalla miscelazione di tamponi diversi dalla cella del campione e dalla siringa. Ciò si ottiene in genere attraverso la dialisi di tutti i materiali nello stesso tampone. Il buffer viene scambiato utilizzando un protocollo adattato dal protocollo di un concentratore di taglio del peso molecolare (MWC) da 3 kDa con alcune modifiche, come di seguito:

1. Attivare la membrana della colonna di dialisi (3 kDa MWC) con 1x PBS, pH 7,4, acquistata dal produttore, utilizzando i seguenti passaggi: riempire con 1x tampone (PBS), equilibrare per 10 minuti a RT e centrifugare a 5.000 x g per 15 minuti.
2. Rimuovere il tampone e caricare 500 μL di campioni di aptamero nella colonna, centrifugare a 5.000 x g e ripeterlo 4 volte per sostituire il tampone originale con 1x PBS. Quando il tampone passa attraverso la membrana, tutte le molecole con una massa inferiore a 3 kDa passeranno attraverso la membrana e l'aptamero rimarrà sul lato superiore della membrana.
3. Raccogliere l'aptamero del DNA dializzato usando un pipet e trasferirlo nei nuovi tubi da 1,5 ml.
4. Raccogliere l'ultimo buffer di flusso per sciogliere la tetraciclina. La polvere di tetraciclina è pura e piccola, quindi la dialisi non è necessaria. Tuttavia, utilizzare il tampone dializzato precedente per il DNA per il bersaglio per assicurarsi che il tampone per l'esperimento nella siringa corrisponda al tampone nella cella di riferimento.
5. Determinare nuovamente la concentrazione dell'aptamero utilizzando uno spettrometro UV-visibile. Utilizzare l'ultimo tampone di scambio per regolare la concentrazione a 40 μM di tetraciclina e 2 μM di aptamero.
6. Ripiegare l'aptamero del DNA riscaldando a 90 °C per 10 minuti, raffreddando a 4 °C per 10 minuti e quindi tornando a RT per 20 minuti.
7. Degasare l'aptamero piegato e la tetraciclina dializzata utilizzando una stazione di degasaggio o una pompa per vuoto impostata a 600 mmHg a 25 °C per 25 minuti per eliminare i gas disciolti.

2. Lavare lo strumento e far funzionare il kit di prova

1. Pulire le porte del solvente per assicurarsi che l'intero percorso del campione sia chiaro. Pulire scartando la soluzione di scarto e caricandoli con metanolo puro, acqua e tampone. Ogni porta contiene più di 250 ml per garantire una soluzione sufficiente per la pulizia.
   NOTA: Il processo di pulizia viene completato automaticamente dal software di controllo ITC programmabile dall'utente.
2. Testare la pulizia della macchina eseguendo ITC utilizzando il buffer in un buffer (ad esempio, 1x PBS in 1x PBS).
   NOTA: una normale linea di base del rumore è visibile tra il piccolo buffer nei picchi di iniezione del buffer. Quando la siringa di titolazione e le cannule sono adeguatamente pulite e completamente asciutte, la linea di base sarà stabile; Un aumento o una diminuzione della linea di base riflette la strumentazione sporca o le bolle all'interno dello strumento, che devono essere corrette prima di eseguire campioni effettivi.
3. Testare l'accuratezza della macchina con un kit standard che include EDTA e CaCl₂ (Figura 3), utilizzando il programma predefinito e seguendo le istruzioni del produttore.

3. Esecuzione del campione per determinare il legame tra aptamero e tetraciclina

1. Impostare i parametri di funzionamento: una velocità di agitazione di 200 giri / min, funzionante a 25 °C, 2 μM aptamero e 40 μM tetraciclina, 30 iniezioni con 2,0 μL ciascuna, un tempo di ritardo di 180 s.
2. Controllare i volumi richiesti utilizzando un calcolatore di programmi in esecuzione. Con questo parametro corrente, eseguire la misurazione ITC con 230 μL di tetraciclina da 40 μM nella siringa ITC e 485 μL di aptamero da 2 μM nella cella campione ITC utilizzando ITC.
3. Caricare le piastre della siringa tetraciclina dializzate e l'aptamero piegato nella cella del campione, evitando bolle, usando una pipetta.
4. Avviare l'esecuzione dello strumento ITC facendo clic sul pulsante Start sul software.
   NOTA: Il processo di funzionamento dello strumento ITC è completamente automatizzato dopo aver riempito manualmente la cella di riferimento e le piastre campione titolanti.

4. Analisi dei dati tramite software

1. Aprire il software di analisi dei dati facendo doppio clic per avviare l'analisi dei dati.
2. Aprire il percorso dei dati grezzi salvati per conoscere la tendenza all'associazione.
3. Aprire la scheda Modellazione e utilizzare diversi modelli di associazione per trovare la soluzione migliore per la curva di dati. Quindi, il software calcola automaticamente il termogramma ITC e vari parametri termodinamici, tra cui entalpia (ΔH), entropia (ΔS), energia libera (ΔG), costante di legame all'equilibrio (Ka) e stechiometria.
4. Raccogliere i parametri termodinamici determinati dai dati e dalle informazioni del modello di adattamento.
5. Creare un report, includendo immagini del termogramma ITC e vari parametri termodinamici, come mostrato nella Figura 4 e nella Tabella 1.

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Risultati

ITC fornisce un'accurata costante di dissociazione (K_d), la stechiometria di legame e i parametri termodinamici delle interazioni a due molecole⁶. In questo esempio, l'aptamero selezionato da Kim et al.9,11 si lega alla tetraciclina con affinità di legame di K d 1 = ¹³ μM^, K_d 2 = 53 nM. È interessante notare che questo legame è stato determinato utilizzando il metodo di filtr...

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Discussione

Il metodo qui presentato è stato modificato secondo le istruzioni di TA Instruments ed è sufficiente per determinare l'affinità di legame e la termodinamica di molti aptameri e bersagli selezionati presso il nostro centro. I passaggi cruciali di questa procedura includono lo scambio del buffer per avere un target corrispondente al ligando, l'esecuzione di campioni con parametri appropriati e la ricerca del modello di adattamento di binding appropriato per analizzare i dati. La registrazione continua del rilascio di ca...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'	Integrated DNA Technologies, Inc		The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells	TA Instruments	61000.901	Isothermal titration calorimetry system
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
Centrifuge	Eppendorf	5417R	The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)	TA Instruments	6326	This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices	Pall Laboratory	OD030C34	3 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4	IBI Scientific	IB70165	Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes	labForce (a Thomas Scientific Brand)	1149K01
Tetracycline, Hydrochoride	EMD Millipore Corperation	CAS64-75-5