Determinación de la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica

Resumen

El presente protocolo describe el uso de la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para analizar la cinética de asociación y disociación de la unión entre un aptámero de ADN y tetraciclina, incluida la preparación de muestras, los patrones de ejecución y las muestras, y la interpretación de los datos resultantes.

Resumen

La determinación de la afinidad y el comportamiento de unión entre un aptámero y su objetivo es el paso más crucial en la selección y el uso de un aptámero para su aplicación. Debido a las drásticas diferencias entre el aptámero y las moléculas pequeñas, los científicos deben esforzarse mucho en caracterizar sus propiedades de unión. La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es un enfoque poderoso para este propósito. ITC va más allá de determinar constantes de disociación (K_d) y puede proporcionar los cambios de entalpía y la estequiometría de unión de la interacción entre dos moléculas en la fase de solución. Este enfoque lleva a cabo una valoración continua utilizando moléculas sin etiquetas y registra el calor liberado a lo largo del tiempo sobre los eventos de unión producidos por cada valoración, por lo que el proceso puede medir con sensibilidad la unión entre macromoléculas y sus pequeños objetivos. Aquí, el artículo presenta un procedimiento paso a paso de la medición ITC de un aptámero seleccionado con un objetivo pequeño, la tetraciclina. Este ejemplo demuestra la versatilidad de la técnica y su potencial para otras aplicaciones.

Introducción

Los aptámeros son fragmentos de ssDNA o ARN seleccionados a través de un proceso de evolución con alta afinidad y especificidad de unión a las dianas deseadas^1,2, que pueden funcionar como elementos de reconocimiento avanzado o anticuerpos químicos 3,4,5. Por lo tanto, la afinidad y especificidad de unión de los aptámeros a sus objetivos juegan un papel crucial en la selección y aplicación de un aptámero, y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se ha utilizado ampliamente para estos fines de caracterización. Se han utilizado muchos enfoques para determinar la afinidad de los aptámeros, incluyendo ITC, resonancia de plasmones de superficie (SPR), titulación colorimétrica, termoforesis a microescala (MST) e interferometría de biocapa (BLI). Entre ellas, ITC es una de las últimas técnicas para determinar la asociación termodinámica y cinética de dos moléculas en la fase de solución. Este enfoque lleva a cabo una valoración continua utilizando moléculas sin etiquetas y registra el calor liberado a lo largo del tiempo sobre los eventos de unión producidos por cada valoración ^6,7. A diferencia de otros métodos, ITC puede ofrecer afinidad de unión, varios sitios de unión y asociación termodinámica y cinética (Figura 1A). A partir de estos parámetros iniciales, los cambios de energía libre de Gibbs y los cambios de entropía se determinan utilizando la siguiente relación:

ΔG = ΔH-TΔS

Eso significa que ITC ofrece un perfil termodinámico completo de la interacción molecular para dilucidar los mecanismos de unión (Figura 1B). Determinar la afinidad de unión para moléculas pequeñas con un aptámero es difícil debido a los tamaños drásticamente diferentes entre el aptámero y el objetivo. Mientras tanto, ITC puede proporcionar mediciones sensibles sin etiquetar e inmovilizar moléculas, lo que proporciona un medio para mantener la estructura natural del aptámero y el objetivo durante la medición. Con los atributos mencionados, ITC se puede utilizar como el método estándar para la caracterización de la unión entre un aptámero y objetivos pequeños.

Después de la selección por parte del grupo Gu, este aptámero se integró con diferentes plataformas, incluidos biosensores electroquímicos basados en aptámeros, un ensayo competitivo de aptámero ligado a enzimas y una placa de microtitulación, que puede lograr una detección de alto rendimiento de tetraciclina ^8,9,10. Sin embargo, sus características de unión no se han dilucidado lo suficientemente bien como para elegir la plataforma adecuada⁸; vale la pena caracterizar la unión del aptámero a la tetraciclina utilizando ITC.

Protocolo

NOTA: La Figura 2 muestra los pasos principales del experimento ITC para determinar la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina.

1. Preparación de las muestras

NOTA: Las muestras para ITC deben prepararse en el mismo tampón tanto para el aptámero como para el ligando, a fin de evitar la liberación de calor causada por la mezcla de diferentes tampones de la celda y la jeringa de la muestra. Esto generalmente se logra a través de la diálisis de todos los materiales en el mismo tampón. El tampón se intercambia utilizando un protocolo adaptado del protocolo de un concentrador de corte de peso molecular (MWC) de 3 kDa con algunas modificaciones, como se muestra a continuación:

1. Active la membrana de la columna de diálisis (3 kDa MWC) con 1x PBS, pH 7.4, comprada al fabricante, siguiendo los siguientes pasos: llene con 1x tampón (PBS), equilibre durante 10 min a RT y centrifugar a 5,000 x g durante 15 min.
2. Retire el tampón y cargue 500 μL de muestras de aptámero en la columna, centrifugar a 5.000 x g y repetirlo 4 veces para cambiar el tampón original por 1x PBS. Cuando el tampón atraviesa la membrana, todas las moléculas con una masa inferior a 3 kDa pasarán a través de la membrana y el aptámero permanecerá en la parte superior de la membrana.
3. Recoja el aptámero de ADN dializado con una pipeta y transfiéralo a los nuevos tubos de 1,5 ml.
4. Recoja el último tampón de flujo para disolver la tetraciclina. El polvo de tetraciclina es puro y pequeño, por lo que no se necesita diálisis. Sin embargo, utilice el tampón dializado anterior para el ADN del objetivo para asegurarse de que el tampón para el experimento en la jeringa coincida con el tampón en la celda de referencia.
5. Determine de nuevo la concentración del aptámero utilizando un espectrómetro UV-visible. Utilice el último tampón de intercambio para ajustar la concentración a 40 μM de tetraciclina y 2 μM de aptámero.
6. Doblar el aptámero de ADN calentando a 90 °C durante 10 min, enfriando a 4 °C durante 10 min y luego volviendo a RT durante 20 min.
7. Desgasifique el aptámero plegado y la tetraciclina dializada utilizando una estación de desgasificación o una bomba de vacío ajustada a 600 mmHg a 25 °C durante 25 min para eliminar los gases disueltos.

2. Lavado del instrumento y funcionamiento del kit de prueba

1. Limpie los puertos de disolvente para asegurarse de que toda la ruta de la muestra esté despejada. Limpie desechando la solución residual y cargándola con metanol puro, agua y tampón. Cada puerto contiene más de 250 ml para garantizar suficiente solución para la limpieza.
   NOTA: El proceso de limpieza se completa automáticamente mediante un software de control ITC programable por el usuario.
2. Pruebe la limpieza de la máquina ejecutando ITC usando buffer en un buffer (es decir, 1x PBS en 1x PBS).
   NOTA: Una línea base de ruido normal es visible entre el pequeño búfer en los picos de inyección de tampón. Cuando la jeringa de titulación y las cánulas se limpian adecuadamente y se secan por completo, la línea de base será estable; Un aumento o disminución en la línea de base refleja instrumentación sucia o burbujas dentro del instrumento, que deben corregirse antes de ejecutar muestras reales.
3. Pruebe la precisión de la máquina con un kit estándar que incluye EDTA y CaCl₂ (Figura 3), utilizando el programa predeterminado y siguiendo las instrucciones del fabricante.

3. Ejecución de la muestra para determinar la unión entre el aptámero y la tetraciclina

1. Configure los parámetros de funcionamiento: una velocidad de agitación de 200 rpm, funcionando a 25 °C, 2 μM aptámero y 40 μM tetraciclina, 30 inyecciones con 2,0 μL cada una, un tiempo de retardo de 180 s.
2. Compruebe los volúmenes necesarios utilizando una calculadora de programas en ejecución. Con este parámetro de ejecución, realice la medición ITC con 230 μL de tetraciclina de 40 μM en la jeringa ITC y 485 μL de aptámero de 2 μM en la celda de muestra ITC utilizando el ITC.
3. Cargue las placas de jeringa de tetraciclina dializada y el aptámero plegado en la celda de muestra, evitando burbujas, utilizando una pipeta.
4. Comience a ejecutar el instrumento ITC haciendo clic en el botón de inicio del software.
   NOTA: El proceso de funcionamiento del instrumento ITC está totalmente automatizado después de llenar manualmente la celda de referencia y las placas de muestra de valorante.

4. Análisis de datos usando software

1. Abra el software de análisis de datos haciendo doble clic para comenzar a analizar los datos.
2. Abra la ruta de los datos sin procesar guardados para conocer la tendencia de vincular.
3. Abra la pestaña de modelado y utilice diferentes modelos de enlace para encontrar el que mejor se ajuste a la curva de datos. Luego, el software calcula automáticamente el termograma ITC y varios parámetros termodinámicos, incluida la entalpía (ΔH), la entropía (ΔS), la energía libre (ΔG), la constante de enlace de equilibrio (Ka) y la estequiometría.
4. Recopile los parámetros termodinámicos determinados a partir de los datos y la información del modelo de ajuste.
5. Cree un informe, que incluya imágenes del termograma ITC y varios parámetros termodinámicos, como se muestra en la Figura 4 y la Tabla 1.

Resultados

ITC proporciona una constante de disociación precisa (K_d), la estequiometría de unión y los parámetros termodinámicos de las interacciones de dos moléculas⁶. En este ejemplo, el aptámero seleccionado por Kim et al.9,11 se une a la tetraciclina con afinidades de unión de K d 1 = ¹³ μM^, K_d 2 = 53 nM. Curiosamente, esta unión se determinó utilizando el método de filtraci...

Discusión

El método presentado aquí fue modificado de acuerdo con las instrucciones de TA Instruments y es suficiente para determinar la afinidad de unión y la termodinámica de muchos aptámeros y objetivos seleccionados en nuestro centro. Los pasos cruciales de este procedimiento incluyen el intercambio del tampón para tener un objetivo que coincida con el ligando, ejecutar muestras con los parámetros adecuados y encontrar el modelo de ajuste de unión apropiado para analizar los datos. El registro continuo de la liberació...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'	Integrated DNA Technologies, Inc		The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells	TA Instruments	61000.901	Isothermal titration calorimetry system
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
Centrifuge	Eppendorf	5417R	The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)	TA Instruments	6326	This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices	Pall Laboratory	OD030C34	3 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4	IBI Scientific	IB70165	Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes	labForce (a Thomas Scientific Brand)	1149K01
Tetracycline, Hydrochoride	EMD Millipore Corperation	CAS64-75-5