Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme

Résumé

Le présent protocole décrit l’utilisation de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) pour analyser l’association et la cinétique de dissociation de la liaison entre un aptamère d’ADN et la tétracycline, y compris la préparation des échantillons, les étalons et les échantillons, et l’interprétation des données résultantes.

Résumé

La détermination de l’affinité et du comportement de liaison entre un aptamère et sa cible est l’étape la plus cruciale dans la sélection et l’utilisation d’un aptamère pour l’application. En raison des différences drastiques entre l’aptamère et les petites molécules, les scientifiques doivent faire beaucoup d’efforts pour caractériser leurs propriétés de liaison. La calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est une approche puissante à cette fin. L’ITC va au-delà de la détermination des constantes de dissociation (K d) et peut fournir les changements d’enthalpie et la stœchiométrie de liaison de l’interaction entre deux molécules dans la phase_de solution. Cette approche effectue un titrage continu à l’aide de molécules sans marquage et enregistre la chaleur libérée au fil du temps sur les événements de liaison produits par chaque titrage, de sorte que le processus peut mesurer avec sensibilité la liaison entre les macromolécules et leurs petites cibles. Ici, l’article présente une procédure étape par étape de la mesure ITC d’un aptamère sélectionné avec une petite cible, la tétracycline. Cet exemple prouve la polyvalence de la technique et son potentiel pour d’autres applications.

Introduction

Les aptamères sont des fragments d’ADNss ou d’ARN sélectionnés par un processus d’évolution avec une affinité et une spécificité de liaison élevées aux cibles souhaitées^1,2, qui peuvent fonctionner comme des éléments de reconnaissance avancés ou des anticorps chimiques 3,4,5. Ainsi, l’affinité et la spécificité de liaison des aptamères à leurs cibles jouent un rôle crucial dans la sélection et l’application d’un aptamère, et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) a été largement utilisée à ces fins de caractérisation. De nombreuses approches ont été utilisées pour déterminer l’affinité des aptamères, notamment l’ITC, la résonance plasmonique de surface (SPR), le titrage colorimétrique, la thermophorèse à micro-échelle (MST) et l’interférométrie de la couche biologique (BLI). Parmi elles, l’ITC est l’une des dernières techniques permettant de déterminer l’association thermodynamique et cinétique de deux molécules en phase de solution. Cette approche effectue un titrage continu à l’aide de molécules sans marquage et enregistre la chaleur libérée au fil du temps lors des événements de liaison produits par chaque titrage ^6,7. Contrairement à d’autres méthodes, l’ITC peut offrir une affinité de liaison, plusieurs sites de liaison et une association thermodynamique et cinétique (Figure 1A). À partir de ces paramètres initiaux, les changements d’énergie libre de Gibbs et les changements d’entropie sont déterminés à l’aide de la relation suivante:

ΔG = ΔH-TΔS

Cela signifie que l’ITC offre un profil thermodynamique complet de l’interaction moléculaire pour élucider les mécanismes de liaison (Figure 1B). Il est difficile de déterminer l’affinité de liaison pour les petites molécules avec un aptamère en raison des tailles radicalement différentes entre l’aptamère et la cible. Pendant ce temps, ITC peut fournir des mesures sensibles sans marquage ni immobilisation des molécules, ce qui permet de conserver la structure naturelle de l’aptamère et de la cible pendant la mesure. Avec les attributs mentionnés, ITC peut être utilisé comme méthode standard pour la caractérisation de la liaison entre un aptamère et de petites cibles.

Après sélection par le groupe Gu, cet aptamère a été intégré à différentes plates-formes, y compris des biocapteurs électrochimiques à base d’aptamères, un test compétitif d’aptamère lié à une enzyme et une plaque de microtitrage, qui peut permettre une détection à haut débit de la tétracycline 8,9,10. Cependant, ses caractéristiques de liaison n’ont pas été suffisamment bien élucidées pour choisir la plate-forme appropriée⁸; il convient de caractériser la liaison de l’aptamère à la tétracycline à l’aide de l’ITC.

Protocole

NOTE: La figure 2 montre les principales étapes de l’expérience ITC pour déterminer l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et de la tétracycline.

1. Préparation des échantillons

REMARQUE : Les échantillons pour l’ITC doivent être préparés dans le même tampon pour l’aptamère et le ligand afin d’éviter le dégagement de chaleur causé par le mélange de différents tampons de la cellule d’échantillon et de la seringue. Ceci est généralement réalisé par dialyse de tous les matériaux dans le même tampon. Le tampon est échangé à l’aide d’un protocole adapté du protocole d’un concentrateur de seuil de masse moléculaire (MWC) de 3 kDa avec quelques modifications, comme ci-dessous:

1. Activer la membrane de la colonne de dialyse (3 kDa MWC) avec 1x PBS, pH 7,4, acheté auprès du fabricant, en suivant les étapes suivantes: remplir avec 1x tampon (PBS), équilibrer pendant 10 min à TA et centrifuger à 5 000 x g pendant 15 min.
2. Retirez le tampon et chargez 500 μL d’échantillons d’aptamères dans la colonne, centrifugez à 5 000 x g et répétez-le 4x pour échanger le tampon d’origine contre 1x PBS. Lorsque le tampon traverse la membrane, toutes les molécules d’une masse inférieure à 3 kDa traversent la membrane et l’aptamère reste sur la face supérieure de la membrane.
3. Prélever l’aptamère d’ADN dialysé à l’aide d’une pipette et le transférer dans le(s) nouveau(x) tube(s) de 1,5 mL.
4. Recueillir le dernier tampon d’écoulement pour dissoudre la tétracycline. La poudre de tétracycline est pure et petite, de sorte que la dialyse n’est pas nécessaire. Cependant, utilisez le tampon dialysé précédent pour l’ADN de la cible afin de vous assurer que le tampon de l’expérience dans la seringue correspond au tampon de la cellule de référence.
5. Déterminez à nouveau la concentration d’aptamères à l’aide d’un spectromètre UV-visible. Utilisez le dernier tampon d’échange pour ajuster la concentration à 40 μM de tétracycline et 2 μM d’aptamère.
6. Plier l’aptamère d’ADN en le chauffant à 90 °C pendant 10 min, en refroidissant à 4 °C pendant 10 min, puis en retournant à TA pendant 20 min.
7. Dégazer l’aptamère plié et dialyser la tétracycline à l’aide d’une station de dégazage ou d’une pompe à vide réglée à 600 mmHg à 25 °C pendant 25 min pour éliminer les gaz dissous.

2. Lavage de l’instrument et fonctionnement du kit de test

1. Nettoyez les orifices de solvant pour vous assurer que tout le chemin de l’échantillon est clair. Nettoyez en jetant la solution de déchets et en les chargeant de méthanol pur, d’eau et de tampon. Chaque port contient plus de 250 ml pour assurer une solution suffisante pour le nettoyage.
   REMARQUE: Le processus de nettoyage est automatiquement complété par un logiciel de contrôle ITC programmable par l’utilisateur.
2. Testez la propreté de la machine en exécutant ITC en utilisant un tampon dans un tampon (c.-à-d. 1x PBS dans 1x PBS).
   REMARQUE: Une ligne de base de bruit normale est visible entre le minuscule tampon dans les pics d’injection de tampon. Lorsque la seringue de titrage et les canules sont correctement nettoyées et complètement sèches, la ligne de base sera stable; Une augmentation ou une diminution de la ligne de base reflète une instrumentation sale ou des bulles à l’intérieur de l’instrument, qui doivent être corrigées avant d’exécuter des échantillons réels.
3. Testez la précision de la machine avec un kit standard comprenant de l’EDTA et du CaCl₂ (Figure 3), en utilisant le programme par défaut et en suivant les instructions du fabricant.

3. Exécution de l’échantillon pour déterminer la liaison entre l’aptamère et la tétracycline

1. Paramétrer les paramètres de fonctionnement : une vitesse d’agitation de 200 tr/min, fonctionnant à 25 °C, 2 μM d’aptamère et 40 μM de tétracycline, 30 injections de 2,0 μL chacune, un temps de retard de 180 s.
2. Vérifiez les volumes requis à l’aide d’une calculatrice de programme en cours d’exécution. Avec ce paramètre courant, effectuer une mesure ITC avec 230 μL de tétracycline 40 μM dans la seringue ITC et 485 μL d’aptamère 2 μM dans la cellule d’échantillon ITC à l’aide de l’ITC.
3. Charger les plaques de seringue de tétracycline dialysées et l’aptamère plié dans la cellule d’échantillon, en évitant les bulles, à l’aide d’une pipette.
4. Commencez à exécuter l’instrument ITC en cliquant sur le bouton de démarrage du logiciel.
   NOTE: Le processus de fonctionnement de l’instrument ITC est entièrement automatisé après le remplissage manuel de la cellule de référence et des plaques d’échantillonnage de titre.

4. Analyse des données à l’aide d’un logiciel

1. Ouvrez le logiciel d’analyse de données en double-cliquant pour commencer à analyser les données.
2. Ouvrez le chemin des données brutes enregistrées pour connaître la tendance de la liaison.
3. Ouvrez l’onglet Modélisation et utilisez différents modèles de liaison pour trouver le meilleur ajustement pour la courbe de données. Ensuite, le logiciel calcule automatiquement le thermogramme ITC et divers paramètres thermodynamiques, notamment l’enthalpie (ΔH), l’entropie (ΔS), l’énergie libre (ΔG), la constante de liaison à l’équilibre (Ka) et la stœchiométrie.
4. Collecter les paramètres thermodynamiques déterminés à partir des données et des informations du modèle d’ajustement.
5. Créez un rapport, comprenant des images du thermogramme ITC et de divers paramètres thermodynamiques, comme illustré à la figure 4 et au tableau 1.

Résultats

ITC fournit une constante de dissociation précise (K_d), la stœchiométrie de liaison et les paramètres thermodynamiques des interactions à deux molécules⁶. Dans cet exemple, l’aptamère choisi par Kim et coll.9,11 se lie à la tétracycline avec des affinités de liaison de K d 1 = ¹³ μM^, K_d 2 = 53 nM. Fait intéressant, cette liaison a été déterminée à l’aide de la...

Discussion

La méthode présentée ici a été modifiée selon les instructions de TA Instruments et est suffisante pour déterminer l’affinité de liaison et la thermodynamique de nombreux aptamères et cibles sélectionnés dans notre centre. Les étapes cruciales de cette procédure comprennent l’échange du tampon pour avoir une cible correspondant au ligand, l’exécution d’échantillons avec les paramètres appropriés et la recherche du modèle d’ajustement de liaison approprié pour analyser les données. L’enreg...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'	Integrated DNA Technologies, Inc		The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells	TA Instruments	61000.901	Isothermal titration calorimetry system
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
Centrifuge	Eppendorf	5417R	The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)	TA Instruments	6326	This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices	Pall Laboratory	OD030C34	3 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4	IBI Scientific	IB70165	Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes	labForce (a Thomas Scientific Brand)	1149K01
Tetracycline, Hydrochoride	EMD Millipore Corperation	CAS64-75-5