Determinando a associação termodinâmica e cinética de um aptamer de DNA e tetraciclina usando calorimetria de titulação isotérmica

Resumo

O presente protocolo descreve o uso da Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) para analisar a cinética de associação e dissociação da ligação entre um aptâmero de DNA e tetraciclina, incluindo a preparação de amostras, padrões de corrida e amostras, e a interpretação dos dados resultantes.

Resumo

A determinação da afinidade de ligação e do comportamento entre um aptâmero e seu alvo é o passo mais crucial na seleção e uso de um aptâmero para aplicação. Devido às diferenças drásticas entre o aptâmero e as pequenas moléculas, os cientistas precisam se esforçar muito para caracterizar suas propriedades de ligação. A Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) é uma abordagem poderosa para esse fim. O ITC vai além da determinação de constantes de dissociação (K_d) e pode fornecer as alterações de entalpia e estequiometria de ligação da interação entre duas moléculas na fase de solução. Essa abordagem conduz a titulação contínua usando moléculas livres de rótulo e registra o calor liberado ao longo do tempo sobre os eventos de ligação produzidos por cada titulação, de modo que o processo possa medir sensivelmente a ligação entre as macromoléculas e seus pequenos alvos. Aqui, o artigo introduz um procedimento passo-a-passo da medição ITC de um aptâmero selecionado com um pequeno alvo, a tetraciclina. Este exemplo comprova a versatilidade da técnica e seu potencial para outras aplicações.

Introdução

Aptamers são fragmentos de ssDNA ou RNA selecionados através de um processo evolutivo com alta afinidade de ligação e especificidade aos alvos desejados^1,2, que podem funcionar como elementos avançados de reconhecimento ou anticorpos químicos 3,4,5. Assim, a afinidade de ligação e especificidade dos aptâmeros aos seus alvos desempenham um papel crucial na seleção e aplicação de um aptâmero, e a Calorimetria de Titulação Isotérmica (ITC) tem sido amplamente utilizada para esses fins de caracterização. Muitas abordagens têm sido usadas para determinar a afinidade dos aptâmeros, incluindo ITC, ressonância plasmônica de superfície (SPR), titulação colorimétrica, termoforese em microescala (MST) e interferometria de biocamada (BLI). Entre elas, a TIC é uma das mais recentes técnicas para determinar a associação termodinâmica e cinética de duas moléculas na fase de solução. Essa abordagem realiza titulação contínua utilizando moléculas livres de rótulo e registra calor liberado ao longo do tempo sobre os eventos de ligação produzidos por cada titulação ^6,7. Ao contrário de outros métodos, o ITC pode oferecer afinidade de ligação, vários sítios de ligação e associação termodinâmica e cinética (Figura 1A). A partir desses parâmetros iniciais, as mudanças de energia livre de Gibbs e as mudanças de entropia são determinadas usando a seguinte relação:

ΔG = ΔH-TΔS

Isso significa que o ITC oferece um perfil termodinâmico completo da interação molecular para elucidar os mecanismos de ligação (Figura 1B). Determinar a afinidade de ligação para pequenas moléculas com um aptâmero é difícil devido aos tamanhos drasticamente diferentes entre o aptâmero e o alvo. Enquanto isso, o ITC pode fornecer medição sensível sem rotular e imobilizar moléculas, o que fornece um meio de manter a estrutura natural do aptâmero e do alvo durante a medição. Com os atributos mencionados, o ITC pode ser usado como o método padrão para a caracterização da ligação entre um aptâmero e pequenos alvos.

Após a seleção pelo grupo Gu, este aptâmero foi integrado com diferentes plataformas, incluindo biossensores eletroquímicos à base de aptâmeros, um ensaio de aptâmero ligado a enzimas competitivas e uma placa de microtitulação, que pode alcançar a detecção de alto rendimento de tetraciclina 8,9,10. No entanto, suas características vinculantes não foram elucidadas o suficiente para escolher a plataforma adequada⁸; vale a pena caracterizar a ligação do aptâmero à tetraciclina usando ITC.

Protocolo

NOTA: A Figura 2 mostra as principais etapas do experimento ITC para determinar a associação termodinâmica e cinética de um aptâmero de DNA e tetraciclina.

1. Preparação das amostras

NOTA: As amostras para ITC têm de ser preparadas no mesmo tampão para o aptâmero e o ligante, a fim de evitar a libertação de calor causada pela mistura de diferentes tampões da célula e da seringa da amostra. Isto é tipicamente conseguido através da diálise de todos os materiais no mesmo tampão. O tampão é trocado usando um protocolo adaptado do protocolo de um concentrador de corte de peso molecular (MWC) de 3 kDa com algumas modificações, como abaixo:

1. Ativar a membrana da coluna de diálise (3 kDa MWC) com 1x PBS, pH 7,4, adquirida do fabricante, utilizando as seguintes etapas: preencher com tampão 1x (PBS), equilibrar por 10 min no RT e centrifugar a 5.000 x g por 15 min.
2. Remova o buffer e carregue 500 μL de amostras de aptâmero na coluna, centrifugar a 5.000 x g e repeti-lo 4x para trocar o buffer original por 1x PBS. Quando o tampão passa pela membrana, todas as moléculas com uma massa inferior a 3 kDa passarão pela membrana, e o aptâmero permanecerá no lado superior da membrana.
3. Recolha o aptâmero de ADN dialisado utilizando uma pipeta e transfira-o para o(s) novo(s) tubo(s) de 1,5 ml.
4. Recolher o último tampão de fluxo para dissolver a tetraciclina. O pó de tetraciclina é puro e pequeno, por isso a diálise não é necessária. No entanto, utilize o tampão dialisado anterior para o ADN para o alvo para garantir que o tampão para a experiência na seringa corresponde ao tampão na célula de referência.
5. Determine a concentração de aptâmero novamente usando um espectrômetro UV-visível. Use o último tampão de troca para ajustar a concentração para tetraciclina de 40 μM e aptâmero de 2 μM.
6. Dobrar o aptâmero de ADN aquecendo a 90 °C durante 10 min, arrefecendo a 4 °C durante 10 min e, em seguida, regressando ao RT durante 20 min.
7. Desgaseifique o aptâmero dobrado e a tetraciclina dialisada utilizando uma estação de desgaseificação ou uma bomba de vácuo regulada para 600 mmHg a 25 °C durante 25 minutos para eliminar os gases dissolvidos.

2. Lavar o instrumento e executar o kit de teste

1. Limpe as portas do solvente para garantir que todo o caminho da amostra esteja limpo. Limpe descartando a solução residual e carregando-os com metanol puro, água e tampão. Cada porta contém mais de 250 mL para garantir solução suficiente para a limpeza.
   NOTA: O processo de limpeza é concluído automaticamente pelo software de controle ITC programável pelo usuário.
2. Teste a limpeza da máquina executando o ITC usando buffer em um buffer (ou seja, 1x PBS em 1x PBS).
   NOTA: Uma linha de base de ruído normal é visível entre o pequeno buffer em picos de injeção de buffer. Quando a seringa de titulação e as cânulas estiverem adequadamente limpas e completamente secas, a linha de base será estável; um aumento ou diminuição na linha de base reflete instrumentação suja ou bolhas dentro do instrumento, que precisam ser corrigidas antes de executar amostras reais.
3. Teste a precisão da máquina com um kit padrão que inclui EDTA e CaCl₂ (Figura 3), usando o programa padrão e seguindo as instruções do fabricante.

3. Funcionamento da amostra para determinar a ligação entre o aptâmero e a tetraciclina

1. Configure os parâmetros de funcionamento: uma taxa de agitação de 200 rpm, funcionando a 25 °C, 2 μM de aptâmero e 40 μM de tetraciclina, 30 injeções com 2,0 μL cada, um tempo de atraso de 180 s.
2. Verifique os volumes necessários usando uma calculadora de programa em execução. Com este parâmetro de execução, execute a medição de ITC com 230 μL de tetraciclina de 40 μM na seringa ITC e 485 μL de aptâmero de 2 μM na célula de amostra ITC usando o ITC.
3. Carregue as placas de seringa de tetraciclina dialisada e o aptâmero dobrado na célula da amostra, evitando bolhas, utilizando uma pipeta.
4. Comece a executar o instrumento ITC clicando no botão Iniciar no software.
   NOTA: O processo de execução do instrumento ITC é totalmente automatizado após o enchimento manual da célula de referência e das placas de amostra de titulante.

4. Analisando dados usando software

1. Abra o software de análise de dados clicando duas vezes para começar a analisar os dados.
2. Abra o caminho dos dados brutos salvos para saber a tendência de vinculação.
3. Abra a guia modelagem e use diferentes modelos de vinculação para encontrar o melhor ajuste para a curva de dados. Em seguida, o software calcula automaticamente o termograma ITC e vários parâmetros termodinâmicos, incluindo entalpia (ΔH), entropia (ΔS), energia livre (ΔG), constante de ligação de equilíbrio (Ka) e estequiometria.
4. Colete os parâmetros termodinâmicos determinados a partir dos dados e informações do modelo de ajuste.
5. Crie um relatório, incluindo imagens do termograma ITC e vários parâmetros termodinâmicos, como mostra a Figura 4 e a Tabela 1.

Resultados

A ITC fornece uma constante de dissociação precisa (K_d), a estequiometria de ligação e os parâmetros termodinâmicos das interações de duas moléculas⁶. Neste exemplo, o aptâmero selecionado por Kim et al.9,11 liga-se à tetraciclina com afinidades de ligação de K d 1 = ¹³ μM^, K_d 2 = 53 nM. Curiosamente, essa ligação foi determinada usando o método de filtração de ...

Discussão

O método aqui apresentado foi modificado de acordo com as instruções da TA Instruments e é suficiente para determinar a afinidade de ligação e termodinâmica de muitos aptâmeros e alvos selecionados em nosso centro. As etapas cruciais desse procedimento incluem a troca do buffer para ter um alvo correspondente ao ligante, a execução de amostras com parâmetros adequados e a localização do modelo de ajuste de ligação apropriado para analisar os dados. O registro contínuo da liberação de calor requer a elim...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'	Integrated DNA Technologies, Inc		The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells	TA Instruments	61000.901	Isothermal titration calorimetry system
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
Centrifuge	Eppendorf	5417R	The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)	TA Instruments	6326	This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices	Pall Laboratory	OD030C34	3 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4	IBI Scientific	IB70165	Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes	labForce (a Thomas Scientific Brand)	1149K01
Tetracycline, Hydrochoride	EMD Millipore Corperation	CAS64-75-5