קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) כדי לנתח את קינטיקה של הקשר והדיסוציאציה של הקשירה בין אפטמר DNA לטטרציקלין, כולל הכנת דגימות, הפעלת תקנים ודגימות, ופענוח הנתונים המתקבלים.

Abstract

קביעת זיקה והתנהגות מחייבת בין אפטמר לבין מטרתו היא השלב המכריע ביותר בבחירת אפטמר ליישום ובשימוש בו. בשל ההבדלים הדרסטיים בין האפטמר למולקולות קטנות, מדענים צריכים להשקיע מאמץ רב באפיון תכונות הקשירה שלהן. קלורימטריה איזותרמית של טיטרציה (ITC) היא גישה רבת עוצמה למטרה זו. ITC חורג מקביעת קבועי ההתנתקות (K_d) ויכול לספק את השינויים האנתלפיים ואת הסטויכיומטריה המחייבת של האינטראקציה בין שתי מולקולות בשלב התמיסה. גישה זו מבצעת טיטרציה רציפה באמצעות מולקולות נטולות תוויות ומתעדת חום המשתחרר לאורך זמן על אירועי הקשירה המיוצרים על ידי כל טיטרציה, כך שהתהליך יכול למדוד ברגישות את הקשירה בין מקרומולקולות לבין המטרות הקטנות שלהן. כאן, המאמר מציג הליך שלב אחר שלב של מדידת ITC של אפטמר נבחר עם מטרה קטנה, טטרציקלין. דוגמה זו מוכיחה את הרבגוניות של הטכניקה ואת הפוטנציאל שלה ליישומים אחרים.

Introduction

Aptamers הם מקטעי ssDNA או RNA שנבחרו בתהליך אבולוציה עם זיקה וספציפיות גבוהה ליעדים הרצויים ^1,2, שיכולים לעבוד כיסודות זיהוי מתקדמים או נוגדנים כימיים ^3,4,5. לפיכך, זיקתם וספציפיותם של האפטמרים למטרותיהם ממלאות תפקיד מכריע בבחירה וביישום של אפטאמר, וקלורימטריה איזותרמית של טיטרציה (ITC) נמצאת בשימוש נרחב למטרות אפיון אלה. גישות רבות שימשו לקביעת הזיקה של אפטמרים, כולל ITC, תהודת פלסמון פני השטח (SPR), טיטרציה צבעונית, תרמופורזה בקנה מידה זעיר (MST) ואינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI). ביניהם, ITC היא אחת הטכניקות האחרונות כדי לקבוע את הקשר התרמודינמי והקינטי של שתי מולקולות בשלב התמיסה. גישה זו מבצעת טיטרציה רציפה באמצעות מולקולות נטולות תוויות ומתעדת חום המשתחרר לאורך זמן על אירועי הקשירה המיוצרים על ידי כל טיטרציה ^6,7. בניגוד לשיטות אחרות, ITC יכול להציע זיקה מחייבת, מספר אתרי קשירה וקשר תרמודינמי וקינטי (איור 1A). מפרמטרים ראשוניים אלה, השינויים באנרגיה החופשית של גיבס ושינויי האנטרופיה נקבעים באמצעות הקשר הבא:

ΔG = ΔH-TΔS

משמעות הדבר היא ש-ITC מציע פרופיל תרמודינמי מלא של האינטראקציה המולקולרית כדי להבהיר את מנגנוני הקשירה (איור 1B). קביעת זיקת הקשירה למולקולות קטנות עם אפטמר קשה בשל הגדלים השונים באופן דרסטי בין אפטמר למטרה. בינתיים, ITC יכול לספק מדידה רגישה ללא תיוג ושיתוק מולקולות, מה שמספק אמצעי לשמירה על המבנה הטבעי של האפטמר והמטרה במהלך המדידה. עם התכונות שהוזכרו, ITC יכול לשמש כשיטה סטנדרטית לאפיון קשירה בין aptamer לבין מטרות קטנות.

לאחר בחירה על ידי קבוצת Gu, אפטמר זה שולב עם פלטפורמות שונות, כולל ביוסנסורים מבוססי אפטמר אלקטרוכימיים, בדיקת אפטמר תחרותית הקשורה לאנזים, וצלחת מיקרוטיטר, שיכולה להשיג זיהוי תפוקה גבוהה של טטרציקלין ^8,9,10. עם זאת, המאפיינים המחייבים שלה לא הובהרו מספיק טוב כדי לבחור את הפלטפורמה הנכונה⁸; כדאי לאפיין את הכריכה של aptamer לטטרציקלין באמצעות ITC.

Protocol

הערה: איור 2 מציג את השלבים העיקריים של ניסוי ITC לקביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין.

1. הכנת דוגמאות

הערה: יש להכין דגימות עבור ITC באותו חיץ הן עבור האפטמר והן עבור הליגנד כדי למנוע שחרור חום הנגרם על ידי ערבוב מאגרים שונים מתא הדגימה והמזרק. זה מושג בדרך כלל באמצעות דיאליזה של כל החומרים לתוך אותו חיץ. המאגר מוחלף באמצעות פרוטוקול המותאם מהפרוטוקול של רכז חיתוך משקל מולקולרי של 3 kDa (MWC) עם כמה שינויים, כמפורט להלן:

1. הפעל את הממברנה של עמודת הדיאליזה (3 kDa MWC) עם 1x PBS, pH 7.4, שנרכש מהיצרן, באמצעות השלבים הבאים: מלא במאגר 1x (PBS), שיווי משקל למשך 10 דקות ב- RT, וצנטריפוגה ב- 5,000 x g למשך 15 דקות.
2. הסר את המאגר וטען 500 μL של דגימות aptamer לתוך העמודה, צנטריפוגה ב 5,000 x גרם, ולחזור על זה 4x כדי להחליף את המאגר המקורי עבור 1x PBS. כאשר החיץ עובר דרך הממברנה, כל המולקולות עם מסה קטנה מ -3 kDa יעברו דרך הממברנה, והאפטמר יישאר בצד העליון של הממברנה.
3. אסוף את ה-DNA aptamer שעבר דיאליזה באמצעות פיפט והעבר אותו לצינור(ים) החדשים של 1.5 מ"ל.
4. אסוף את מאגר הזרימה האחרון כדי להמיס טטרציקלין. אבקת טטרציקלין היא טהורה וקטנה, ולכן אין צורך בדיאליזה. עם זאת, השתמש במאגר הדיאליזה הקודם עבור דנ"א עבור המטרה כדי להבטיח שהמאגר לניסוי במזרק יתאים למאגר בתא הייחוס.
5. קבע שוב את ריכוז האפטמר באמצעות ספקטרומטר הנראה לעין UV. השתמש במאגר החליפין האחרון כדי להתאים את הריכוז ל-40 μM טטרציקלין ו-2 μM aptamer.
6. קפלו את ה-DNA aptamer על ידי חימום ב-90°C למשך 10 דקות, קירור ב-4°C למשך 10 דקות, ולאחר מכן חזרו ל-RT למשך 20 דקות.
7. דגה את האפטאמר המקופל והטטרציקלין המקופל באמצעות תחנת degassing או משאבת ואקום המוגדרת ל-600 מ"מ כספית ב-25 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות כדי לחסל גזים מומסים.

2. שטיפת המכשיר והפעלת ערכת הבדיקה

1. נקה את יציאות הממס כדי לוודא שכל נתיב הדגימה ברור. נקו על ידי השלכת תמיסת הפסולת והעמסתה במתנול טהור, מים וחוצץ. כל יציאה מכילה יותר מ -250 מ"ל כדי להבטיח פתרון מספיק לניקוי.
   הערה: תהליך הניקוי הושלם באופן אוטומטי על-ידי תוכנת בקרת ITC הניתנת לתכנות על-ידי המשתמש.
2. בדוק את ניקיון המחשב על-ידי הפעלת ITC באמצעות מאגר לתוך מאגר (כלומר, 1x PBS לתוך 1x PBS).
   הערה: קו בסיס רגיל של רעש נראה בין המאגר הזעיר לפסגות הזרקת חיץ. כאשר מזרק הטיטרציה והצינוריות מנוקים כראוי ויבשים לחלוטין, קו הבסיס יהיה יציב; עלייה או ירידה בנקודת ההתחלה משקפת מכשור מלוכלך או בועות בתוך המכשיר, שיש לתקן לפני הפעלת דגימות בפועל.
3. בדוק את דיוק המכונה באמצעות ערכה סטנדרטית הכוללת EDTA ו- CaCl₂ (איור 3), באמצעות תוכנית ברירת המחדל וביצוע הוראות היצרן.

3. הרצת הדגימה לקביעת הקשירה בין אפטמר לטטרציקלין

1. הגדר את פרמטרי הריצה: קצב ערבוב של 200 סל"ד, ריצה ב 25 מעלות צלזיוס, 2 μM aptamer ו 40 μM טטרציקלין, 30 זריקות עם 2.0 μL כל אחד, זמן עיכוב של 180 שניות.
2. בדוק את אמצעי האחסון הדרושים באמצעות מחשבון תוכנית פועלת. עם פרמטר ריצה זה, בצע מדידת ITC עם 230 μL של 40 μM טטרציקלין במזרק ITC ו 485 μL של 2 μM aptamer בתא הדגימה ITC באמצעות ITC.
3. העמיסו את לוחות המזרק טטרציקלין המקופלים ואת האפטמר המקופל לתוך תא הדגימה, תוך הימנעות מבועות, באמצעות פיפטה.
4. התחל להפעיל את מכשיר ה- ITC על ידי לחיצה על כפתור התחל בתוכנה.
   הערה: תהליך ההפעלה של מכשיר ITC הוא אוטומטי לחלוטין לאחר מילוי ידני של תאי הייחוס ולוחות דגימת הטיטראנט.

4. ניתוח נתונים באמצעות תוכנה

1. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים על ידי לחיצה כפולה כדי להתחיל לנתח את הנתונים.
2. פתח את הנתיב של הנתונים הגולמיים שנשמרו כדי לדעת את הנטייה של כריכה.
3. פתח את כרטיסיית המידול והשתמש במודלי איגוד שונים כדי למצוא את ההתאמה הטובה ביותר לעקומת הנתונים. לאחר מכן, התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את התרמוגרמה של ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים, כולל אנתלפיה (ΔH), אנטרופיה (ΔS), אנרגיה חופשית (ΔG), קבוע קשירת שיווי משקל (Ka) וסטויכיומטריה.
4. אסוף את הפרמטרים התרמודינמיים שנקבעו מהנתונים וממידע המודל המתאים.
5. צור דוח, הכולל תמונות של התרמוגרמה ITC ופרמטרים תרמודינמיים שונים, כפי שמוצג באיור 4 ובטבלה 1.

תוצאות

ITC מספק קבוע התנתקות מדויק (K_d), את הסטויכיומטריה המחייבת ואת הפרמטרים התרמודינמיים של אינטראקציות דו-מולקולות⁶. בדוגמה זו, האפטמר שנבחר על ידי Kim et al.9,11 נקשר לטטרציקלין עם זיקות קשירה של K d 1 = ¹³ μM^, K_d 2 = 53 nM. מעניין לצי...

Discussion

השיטה המוצגת כאן שונתה בהתאם להוראת ת"א מכשירים והיא מספיקה כדי לקבוע את זיקת הקשירה והתרמודינמיקה של אפטאמרים ומטרות נבחרות רבות במרכזנו. שלבים מכריעים מהליך זה כוללים החלפת המאגר כך שיהיה לו יעד התואם את הליגנד, הרצת דגימות עם פרמטרים מתאימים ומציאת מודל התאמת המחייב המתאים לניתוח הנתו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'	Integrated DNA Technologies, Inc		The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells	TA Instruments	61000.901	Isothermal titration calorimetry system
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
Centrifuge	Eppendorf	5417R	The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)	TA Instruments	6326	This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices	Pall Laboratory	OD030C34	3 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4	IBI Scientific	IB70165	Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes	labForce (a Thomas Scientific Brand)	1149K01
Tetracycline, Hydrochoride	EMD Millipore Corperation	CAS64-75-5