JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, numune hazırlama, çalışma standartları ve numuneler dahil olmak üzere bir DNA aptamer ve tetrasiklin arasındaki bağlanmanın ilişkisini ve ayrışma kinetiğini analiz etmek için İzotermal Titrasyon Kalorimetrisinin (ITC) kullanımını açıklamaktadır.

Özet

Bir aptamer ile hedefi arasındaki bağlanma afinitesinin ve davranışının belirlenmesi, uygulama için bir aptamer seçilmesinde ve kullanılmasında en önemli adımdır. Aptamer ve küçük moleküller arasındaki ciddi farklılıklar nedeniyle, bilim adamlarının bağlanma özelliklerini karakterize etmek için çok çaba sarf etmeleri gerekir. İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi (ITC) bu amaç için güçlü bir yaklaşımdır. ITC, ayrışma sabitlerini (Kd) belirlemenin ötesine geçer ve çözelti fazındaki iki molekül arasındaki etkileşimin entalpi değişikliklerini ve bağlanma stokiyometrisini sağlayabilir. Bu yaklaşım, etiketsiz moleküller kullanarak sürekli titrasyon gerçekleştirir ve her bir titrasyonun ürettiği bağlanma olaylarına zaman içinde salınan ısıyı kaydeder, böylece süreç makromoleküller ile küçük hedefleri arasındaki bağlanmayı hassas bir şekilde ölçebilir. Bu makalede, küçük bir hedef olan tetrasiklin ile seçilen bir aptamerin ITC ölçümünün adım adım prosedürü tanıtılmaktadır. Bu örnek, tekniğin çok yönlülüğünü ve diğer uygulamalar için potansiyelini kanıtlamaktadır.

Giriş

Aptamerler, gelişmiş tanıma elementleri veya kimyasal antikorlar 3,4,5 olarak çalışabilen, istenen hedeflere 1,2 yüksek bağlanma afinitesi ve özgüllüğü olan bir evrim süreci ile seçilen ssDNA veya RNA fragmanlarıdır. Bu nedenle, aptamerlerin hedeflerine bağlanma afinitesi ve özgüllüğü, bir aptamer seçiminde ve uygulanmasında çok önemli bir rol oynamaktadır ve İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi (ITC) bu karakterizasyon amaçları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Apatimerlerin afinitesini belirlemek için ITC, yüzey plazmon rezonansı (SPR), kolorimetrik titrasyon, mikro ölçekli termoforez (MST) ve Biyo-Katman İnterferometrisi (BLI) dahil olmak üzere birçok yaklaşım kullanılmıştır. Bunlar arasında ITC, çözelti fazındaki iki molekülün termodinamik ve kinetik ilişkisini belirlemek için en son tekniklerden biridir. Bu yaklaşım, etiketsiz moleküller kullanarak sürekli titrasyon gerçekleştirir ve her bir titrasyon 6,7 tarafından üretilen bağlanma olaylarına zaman içinde salınan ısıyı kaydeder. Diğer yöntemlerden farklı olarak, ITC bağlanma afinitesi, çeşitli bağlanma bölgeleri ve termodinamik ve kinetik ilişki sunabilir (Şekil 1A). Bu başlangıç parametrelerinden, Gibbs serbest enerji değişimleri ve entropi değişimleri aşağıdaki ilişki kullanılarak belirlenir:

ΔG = ΔH-TΔS

Bu, ITC'nin bağlanma mekanizmalarını aydınlatmak için moleküler etkileşimin tam bir termodinamik profilini sunduğu anlamına gelir (Şekil 1B). Bir aptamer ile küçük moleküller için bağlanma afinitesini belirlemek, aptamer ve hedef arasındaki büyük ölçüde farklı boyutlar nedeniyle zordur. Bu arada, ITC, molekülleri etiketlemeden ve hareketsiz hale getirmeden hassas ölçüm sağlayabilir, bu da ölçüm sırasında aptamer ve hedefin doğal yapısını korumanın bir yolunu sağlar. Bahsedilen özelliklerle ITC, bir aptamer ve küçük hedefler arasındaki bağlanmanın karakterizasyonu için standart yöntem olarak kullanılabilir.

Gu grubu tarafından seçildikten sonra, bu aptamer elektrokimyasal aptamer bazlı biyosensörler, rekabetçi bir enzime bağlı aptamer testi ve tetrasiklin 8,9,10'un yüksek verimli tespitini sağlayabilen bir mikrotitre plakası dahil olmak üzere farklı platformlarla entegre edildi. Bununla birlikte, bağlayıcı özellikleri, uygun platform8'i seçmek için yeterince iyi aydınlatılmamıştır; aptamerin ITC kullanarak tetrasiklin ile bağlanmasını karakterize etmeye değer.

Protokol

NOT: Şekil 2 , bir DNA aptamer ve tetrasiklinin termodinamik ve kinetik ilişkisini belirlemek için ITC deneyinin ana adımlarını göstermektedir.

1. Numunelerin hazırlanması

NOT: ITC numunelerinin, numune hücresinden ve şırıngadan farklı tamponların karıştırılmasından kaynaklanan ısı salınımını önlemek için hem aptamer hem de ligand için aynı tamponda hazırlanması gerekir. Bu tipik olarak tüm malzemelerin aynı tampona diyalizi yoluyla elde edilir. Tampon, aşağıdaki gibi bazı modifikasyonlarla 3 kDa moleküler ağırlık kesme (MWC) yoğunlaştırıcısının protokolünden uyarlanmış bir protokol kullanılarak değiştirilir:

  1. Aşağıdaki adımları kullanarak üreticiden satın alınan 1x PBS, pH 7,4 ile diyaliz kolonunun membranını (3 kDa MWC) etkinleştirin: 1x tamponla (PBS) doldurun, RT'de 10 dakika dengeleyin ve 15 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj yapın.
  2. Arabelleği çıkarın ve sütuna 500 μL aptamer numunesi yükleyin, 5.000 x g'de santrifüj yapın ve orijinal arabelleği 1x PBS ile değiştirmek için 4 kat tekrarlayın. Tampon membrandan geçtiğinde, kütlesi 3 kDa'dan az olan tüm moleküller membrandan geçecek ve aptamer membranın üst tarafında kalacaktır.
  3. Diyalizli DNA aptamerini bir pipet kullanarak toplayın ve yeni 1,5 mL tüplere aktarın.
  4. Tetrasiklin'i çözmek için son akış tamponunu toplayın. Tetrasiklin tozu saf ve küçüktür, bu nedenle diyalize gerek yoktur. Bununla birlikte, şırıngadaki deney için tamponun referans hücredeki tamponla eşleştiğinden emin olmak için hedef için DNA için önceki diyalize tamponu kullanın.
  5. UV-görünür bir spektrometre kullanarak aptamer konsantrasyonunu tekrar belirleyin. Konsantrasyonu 40 μM tetrasiklin ve 2 μM aptamer olarak ayarlamak için son değişim tamponunu kullanın.
  6. DNA aptamerini 10 dakika boyunca 90 °C'de ısıtarak, 10 dakika boyunca 4 °C'de soğutarak ve ardından 20 dakika RT'ye geri dönerek katlayın.
  7. Çözünmüş gazları ortadan kaldırmak için 25 dakika boyunca 25 ° C'de 600 mmHg'ye ayarlanmış bir gaz giderme istasyonu veya vakum pompası kullanarak katlanmış aptamer ve diyalize tetrasiklin gazını çözün.

2. Cihazın yıkanması ve test kitinin çalıştırılması

  1. Tüm numune yolunun net olduğundan emin olmak için solvent portlarını temizleyin. Atık çözeltisini atarak ve saf metanol, su ve tamponla yükleyerek temizleyin. Her bağlantı noktası, temizlik için yeterli çözüm sağlamak için 250 mL'den fazla içerir.
    NOT: Temizleme işlemi, kullanıcı tarafından programlanabilir ITC kontrol yazılımı tarafından otomatik olarak tamamlanır.
  2. ITC'yi arabellek kullanarak bir arabelleğe (yani, 1x PBS'den 1x PBS'ye) çalıştırarak makinenin temizliğini test edin.
    NOT: Küçük tampon ile tampon enjeksiyon tepe noktaları arasında normal bir gürültü tabanı görülebilir. Titrasyon şırıngası ve kanülleri yeterince temizlendiğinde ve tamamen kuruduğunda, taban çizgisi sabit olacaktır; taban çizgisindeki bir artış veya azalma, gerçek numuneleri çalıştırmadan önce düzeltilmesi gereken cihazın içindeki kirli enstrümantasyonu veya kabarcıkları yansıtır.
  3. Makinenin doğruluğunu, EDTA ve CaCl2 (Şekil 3) içeren standart bir kit ile, varsayılan programı kullanarak ve üreticinin talimatlarını izleyerek test edin.

3. Aptamer ve tetrasiklin arasındaki bağlanmayı belirlemek için numunenin çalıştırılması

  1. Çalışma parametrelerini ayarlayın: 25 ° C'de çalışan 200 rpm'lik bir karıştırma hızı, 2 μM aptamer ve 40 μM tetrasiklin, her biri 2.0 μL ile 30 enjeksiyon, 180 s'lik bir gecikme süresi.
  2. Çalışan bir program hesaplayıcısı kullanarak gerekli birimleri kontrol edin. Bu çalışan parametre ile, ITC şırıngasında 230 μL 40 μM tetrasiklin ve ITC örnek hücresinde 485 μL 2 μM aptamer ile ITC ölçümü gerçekleştirin.
  3. Diyalize tetrasiklin şırınga plakalarını ve katlanmış aptamer'i bir pipet kullanarak kabarcıklardan kaçınarak numune hücresine yükleyin.
  4. Yazılımdaki başlat düğmesine tıklayarak ITC cihazını çalıştırmaya başlayın.
    NOT: ITC cihazı çalıştırma işlemi, referans hücresini ve titrant numune plakalarını manuel olarak doldurduktan sonra tamamen otomatiktir.

4. Yazılım kullanarak verileri analiz etme

  1. Verileri analiz etmeye başlamak için çift tıklayarak veri analizi yazılımını açın.
  2. Bağlama eğilimini bilmek için kaydedilen ham verilerin yolunu açın.
  3. Modelleme sekmesini açın ve veri eğrisine en uygun olanı bulmak için farklı bağlama modelleri kullanın. Daha sonra, yazılım ITC termogramını ve entalpi (ΔH), entropi (ΔS), serbest enerji (ΔG), denge bağlama sabiti (Ka) ve stokiyometri dahil olmak üzere çeşitli termodinamik parametreleri otomatik olarak hesaplar.
  4. Verilerden belirlenen termodinamik parametreleri ve montaj modeli bilgilerini toplar.
  5. ITC termogramının resimlerini ve çeşitli termodinamik parametreleri içeren bir rapor oluşturun, Şekil 4 ve Tablo 1'de gösterildiği gibi.

Sonuçlar

ITC, doğru bir ayrışma sabiti (Kd), bağlanma stokiyometrisi ve iki moleküllü etkileşimlerin termodinamik parametrelerinisağlar 6. Bu örnekte, Kim ve ark.9,11 tarafından seçilen aptamer, tetrasiklin ile K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nm bağlanma afiniteleri ile bağlanır. İlginç bir şekilde, bu bağlanma, denge filtrasyon yöntemi ve uygun bağlanma bölgesinden (site 2)...

Tartışmalar

Burada sunulan yöntem TA Instruments'ın talimatına göre modifiye edilmiştir ve merkezimizde seçilen birçok aptamer ve hedefin bağlanma afinitesini ve termodinamiğini belirlemek için yeterlidir. Bu yordamın önemli adımları, arabelleğin ligandla eşleşen bir hedefe sahip olacak şekilde değiştirilmesini, numunelerin uygun parametrelerle çalıştırılmasını ve verileri analiz etmek için uygun bağlama uydurma modelinin bulunmasını içerir. Isı salınımının sürekli kaydedilmesi, tamponun uyumsuz...

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu araştırma, Aptagen LLC'nin Araştırma ve Geliştirme Fonu tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG
C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG
TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'		Integrated DNA Technologies, IncThe sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold CellsTA Instruments61000.901Isothermal titration calorimetry system
CaCl2Avantor (VWR)E506-100MLCalcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
CentrifugeEppendorf5417RThe Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)TA Instruments6326This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTATekNovaE0375EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisherND-ONE-WUV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal DevicesPall LaboratoryOD030C343 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4IBI ScientificIB70165Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge TubeslabForce (a Thomas Scientific Brand)1149K01
Tetracycline, HydrochorideEMD Millipore CorperationCAS64-75-5

Referanslar

  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  2. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  3. Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
  4. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
  5. Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
  6. Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
  7. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
  8. Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
  9. Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
  10. Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
  11. Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
  12. Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
  13. Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
  14. Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
  15. Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
  16. Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
  17. Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 186zotermal titrasyon kalorimetrisi ITCDNA aptamertetrasiklinayr ma sabitleri Kdtermodinamik ve kinetik ili ki

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır