Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins mittels isothermer Titrationskalorimetrie

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) zur Analyse der Assoziation und Dissoziationskinetik der Bindung zwischen einem DNA-Aptamer und Tetracyclin, einschließlich Probenvorbereitung, Ausführung von Standards und Proben und Interpretation der resultierenden Daten.

Zusammenfassung

Die Bestimmung der Bindungsaffinität und des Bindungsverhaltens zwischen einem Aptamer und seinem Ziel ist der wichtigste Schritt bei der Auswahl und Verwendung eines Aptamers für die Anwendung. Aufgrund der drastischen Unterschiede zwischen dem Aptamer und kleinen Molekülen müssen Wissenschaftler viel Aufwand betreiben, um ihre Bindungseigenschaften zu charakterisieren. Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist ein leistungsfähiger Ansatz für diesen Zweck. ITC geht über die Bestimmung von Dissoziationskonstanten (K_d) hinaus und kann die Enthalpieänderungen und die Bindungsstöchiometrie der Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen in der Lösungsphase liefern. Dieser Ansatz führt eine kontinuierliche Titration mit markierungsfreien Molekülen durch und zeichnet die im Laufe der Zeit freigesetzte Wärme bei den Bindungsereignissen auf, die bei jeder Titration erzeugt werden, so dass der Prozess die Bindung zwischen Makromolekülen und ihren kleinen Zielen empfindlich messen kann. Hier stellt der Artikel ein schrittweises Verfahren der ITC-Messung eines ausgewählten Aptamers mit einem kleinen Ziel, Tetracyclin, vor. Dieses Beispiel beweist die Vielseitigkeit der Technik und ihr Potenzial für andere Anwendungen.

Einleitung

Aptamere sind ssDNA- oder RNA-Fragmente, die durch einen Evolutionsprozess mit hoher Bindungsaffinität und Spezifität zu den gewünschten Zielen ^1,2 selektiert werden, die als fortgeschrittene Erkennungselemente oder chemische Antikörper 3,4,5 wirken können. Daher spielen die Bindungsaffinität und Spezifität von Aptameren an ihre Ziele eine entscheidende Rolle bei der Auswahl und Anwendung eines Aptamers, und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) wurde für diese Charakterisierungszwecke häufig verwendet. Viele Ansätze wurden verwendet, um die Affinität von Aptameren zu bestimmen, einschließlich ITC, Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), kolorimetrische Titration, mikroskalige Thermophorese (MST) und Bio-Schichtinterferometrie (BLI). Unter ihnen ist ITC eine der neuesten Techniken, um die thermodynamische und kinetische Assoziation von zwei Molekülen in der Lösungsphase zu bestimmen. Dieser Ansatz führt eine kontinuierliche Titration unter Verwendung markierungsfreier Moleküle durch und zeichnet die im Laufe der Zeit freigesetzte Wärme bei den bei jeder Titration erzeugten Bindungsereignissen auf ^6,7. Im Gegensatz zu anderen Methoden kann ITC Bindungsaffinität, mehrere Bindungsstellen sowie thermodynamische und kinetische Assoziationen bieten (Abbildung 1A). Aus diesen Anfangsparametern werden die Gibbs-Änderungen der freien Energie und die Entropieänderungen unter Verwendung der folgenden Beziehung bestimmt:

ΔG = ΔH-TΔS

Das bedeutet, dass ITC ein vollständiges thermodynamisches Profil der molekularen Wechselwirkung bietet, um die Bindungsmechanismen aufzuklären (Abbildung 1B). Die Bestimmung der Bindungsaffinität für kleine Moleküle mit einem Aptamer ist aufgrund der drastisch unterschiedlichen Größen zwischen Aptamer und Target schwierig. In der Zwischenzeit kann ITC empfindliche Messungen ohne Markierung und Immobilisierung von Molekülen durchführen, was ein Mittel bietet, die natürliche Struktur des Aptamers und des Ziels während der Messung beizubehalten. Mit den genannten Attributen kann ITC als Standardmethode zur Charakterisierung der Bindung zwischen einem Aptamer und kleinen Targets verwendet werden.

Nach der Auswahl durch die Gu-Gruppe wurde dieses Aptamer in verschiedene Plattformen integriert, darunter elektrochemische Aptamer-basierte Biosensoren, ein kompetitiver enzymgebundener Aptamer-Assay und eine Mikrotiterplatte, die einen Hochdurchsatznachweis von Tetracyclin ^8,9,10 erreichen kann. Seine Bindungseigenschaften sind jedoch nicht gut genug aufgeklärt, um die richtige Plattform⁸ zu wählen; Es lohnt sich, die Bindung des Aptamers an das Tetracyclin mittels ITC zu charakterisieren.

Protokoll

HINWEIS: Abbildung 2 zeigt die Hauptschritte des ITC-Experiments zur Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins.

1. Vorbereitung der Proben

HINWEIS: Proben für ITC müssen im selben Puffer für Aptamer und Ligand vorbereitet werden, um eine Wärmefreisetzung durch das Mischen verschiedener Puffer aus der Probenzelle und der Spritze zu vermeiden. Dies wird typischerweise durch Dialyse aller Materialien in denselben Puffer erreicht. Der Puffer wird unter Verwendung eines Protokolls ausgetauscht, das vom Protokoll eines 3 kDa Molekulargewichts-Cutoff-Konzentrators (MWC) mit einigen Modifikationen angepasst ist, wie folgt:

1. Aktivieren Sie die Membran der Dialysersäule (3 kDa MWC) mit 1x PBS, pH 7,4, vom Hersteller gekauft, wie folgt: mit 1x Puffer (PBS) füllen, 10 min bei RT ausgleichen und bei 5.000 x g 15 min zentrifugieren.
2. Entfernen Sie den Puffer und laden Sie 500 μL Aptamerproben in die Säule, zentrifugieren Sie bei 5.000 x g und wiederholen Sie es 4x, um den ursprünglichen Puffer gegen 1x PBS auszutauschen. Wenn der Puffer durch die Membran geht, gehen alle Moleküle mit einer Masse von weniger als 3 kDa durch die Membran, und das Aptamer bleibt auf der Oberseite der Membran.
3. Sammeln Sie das dialysierte DNA-Aptamer mit einer Pipette und übertragen Sie es in die neuen 1,5-ml-Röhrchen.
4. Sammeln Sie den letzten Durchflusspuffer, um Tetracyclin aufzulösen. Tetracyclinpulver ist rein und klein, so dass keine Dialyse erforderlich ist. Verwenden Sie jedoch den vorherigen dialysierten DNA-Puffer für das Ziel, um sicherzustellen, dass der Puffer für das Experiment in der Spritze mit dem Puffer in der Referenzzelle übereinstimmt.
5. Bestimmen Sie die Aptamerkonzentration erneut mit einem UV-sichtbaren Spektrometer. Verwenden Sie den letzten Austauschpuffer, um die Konzentration auf 40 μM Tetracyclin und 2 μM Aptamer einzustellen.
6. Falten Sie das DNA-Aptamer, indem Sie es 10 min lang bei 90 °C erhitzen, 10 min bei 4 °C abkühlen und dann für 20 min auf RT zurückkehren.
7. Entgasen Sie das gefaltete Aptamer und das dialysierte Tetracyclin mit einer Entgasungsstation oder Vakuumpumpe, die auf 600 mmHg bei 25 °C eingestellt ist, für 25 Minuten, um gelöste Gase zu entfernen.

2. Waschen des Geräts und Ausführen des Testkits

1. Reinigen Sie die Lösungsmittelkanäle, um sicherzustellen, dass der gesamte Probenweg frei ist. Reinigen Sie, indem Sie die Abfalllösung entsorgen und mit reinem Methanol, Wasser und Puffer beladen. Jeder Port enthält mehr als 250 ml, um genügend Reinigungslösung zu gewährleisten.
   HINWEIS: Der Reinigungsprozess wird automatisch durch eine vom Benutzer programmierbare ITC-Steuerungssoftware abgeschlossen.
2. Testen Sie die Sauberkeit der Maschine, indem Sie ITC mit buffer in einen Puffer ausführen (dh 1x PBS in 1x PBS).
   HINWEIS: Eine normale Rauschgrundlinie ist zwischen dem winzigen Puffer in Pufferinjektionsspitzen sichtbar. Wenn die Titrationsspritze und die Kanülen ausreichend gereinigt und vollständig trocken sind, ist die Grundlinie stabil; Eine Zunahme oder Abnahme der Baseline spiegelt verschmutzte Instrumente oder Blasen im Inneren des Instruments wider, die korrigiert werden müssen, bevor die eigentlichen Proben ausgeführt werden können.
3. Testen Sie die Genauigkeit des Geräts mit einem Standardkit, das EDTA und CaCl₂ enthält (Abbildung 3), verwenden Sie das Standardprogramm und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.

3. Ausführen der Probe zur Bestimmung der Bindung zwischen Aptamer und Tetracyclin

1. Stellen Sie die Laufparameter ein: eine Rührrate von 200 U/min bei 25 °C, 2 μM Aptamer und 40 μM Tetracyclin, 30 Injektionen à 2,0 μL, eine Verzögerungszeit von 180 s.
2. Überprüfen Sie die benötigten Volumes mit einem laufenden Programmrechner. Mit diesem Laufparameter führen Sie eine ITC-Messung mit 230 μL 40 μM Tetracyclin in der ITC-Spritze und 485 μL 2 μM Aptamer in der ITC-Probenzelle unter Verwendung der ITC durch.
3. Laden Sie die dialysierten Tetracyclin-Spritzenplatten und das gefaltete Aptamer mit einer Pipette unter Vermeidung von Blasen in die Probenzelle.
4. Starten Sie den Betrieb des ITC-Geräts, indem Sie auf die Schaltfläche Start in der Software klicken.
   HINWEIS: Der laufende Prozess des ITC-Instruments ist nach dem manuellen Befüllen der Referenzzelle und der Titriermittelprobenplatten vollständig automatisiert.

4. Datenanalyse mit Software

1. Öffnen Sie die Datenanalysesoftware durch Doppelklick, um mit der Analyse der Daten zu beginnen.
2. Öffnen Sie den Pfad der gespeicherten Rohdaten, um die Tendenz der Bindung zu erfahren.
3. Öffnen Sie die Registerkarte Modellierung, und verwenden Sie verschiedene Bindungsmodelle, um die beste Anpassung für die Datenkurve zu finden. Anschließend berechnet die Software automatisch das ITC-Thermogramm und verschiedene thermodynamische Parameter, einschließlich Enthalpie (ΔH), Entropie (ΔS), freie Energie (ΔG), Gleichgewichtsbindungskonstante (Ka) und Stöchiometrie.
4. Sammeln Sie die thermodynamischen Parameter, die aus den Daten und Anpassungsmodellinformationen ermittelt werden.
5. Erstellen Sie einen Bericht, der Bilder des ITC-Thermogramms und verschiedener thermodynamischer Parameter enthält, wie in Abbildung 4 und Tabelle 1 dargestellt.

Ergebnisse

ITC liefert eine genaue Dissoziationskonstante (K_d), die Bindungsstöchiometrie und die thermodynamischen Parameter von Zwei-Molekül-Wechselwirkungen⁶. In diesem Beispiel bindet das von Kim et al.9,11 ausgewählte Aptamer an Tetracyclin mit Bindungsaffinitäten von K d 1 = ¹³ μM^, K_d 2 = 53 nM. Interessanterweise wurde diese Bindung mit der Gleichgewichtsfiltrationsmethode und ei...

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode wurde gemäß den Anweisungen von TA Instruments modifiziert und reicht aus, um die Bindungsaffinität und Thermodynamik vieler ausgewählter Aptamere und Targets in unserem Zentrum zu bestimmen. Zu den entscheidenden Schritten dieses Verfahrens gehören der Austausch des Puffers, um ein Ziel zu haben, das dem Liganden entspricht, das Ausführen von Proben mit geeigneten Parametern und das Finden des geeigneten Bindungsanpassungsmodells zur Analyse der Daten. Die kontinuierliche Aufzeichnung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'	Integrated DNA Technologies, Inc		The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells	TA Instruments	61000.901	Isothermal titration calorimetry system
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile
Centrifuge	Eppendorf	5417R	The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g.
Complete Degassing Station (110/230V)	TA Instruments	6326	This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation.
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis Spectrophotometer
Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices	Pall Laboratory	OD030C34	3 kDa molecular weight cutoff concentrator
PBS pH 7.4	IBI Scientific	IB70165	Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min.
Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes	labForce (a Thomas Scientific Brand)	1149K01
Tetracycline, Hydrochoride	EMD Millipore Corperation	CAS64-75-5