Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البروتوكول تخليق الببتيدات الحلقية عن طريق البيسالكيل بين السيستين والميثيونين وتفاعل ثيول ين السهل الناجم عن مركز بروبارجيل السلفونيوم.

Abstract

في السنوات الأخيرة ، جذبت الببتيدات الدورية اهتماما متزايدا في مجال اكتشاف الأدوية بسبب أنشطتها البيولوجية الممتازة ، ونتيجة لذلك ، يتم استخدامها الآن سريريا. لذلك ، من الأهمية بمكان البحث عن استراتيجيات فعالة لتوليف الببتيدات الحلقية لتعزيز تطبيقها في مجال اكتشاف الأدوية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للتوليف الفعال للببتيدات الحلقية باستخدام ثنائي الألكلة على الراتنج أو داخل الجزيئات (بين الجزيئات). باستخدام هذا البروتوكول ، تم تصنيع الببتيدات الخطية من خلال الاستفادة من تخليق الببتيد في المرحلة الصلبة مع السيستين (Cys) والميثيونين (Met) المقترن في وقت واحد على الراتنج. علاوة على ذلك ، تم تصنيع الببتيدات الحلقية عن طريق البيسالكيل بين Met و Cys باستخدام حبل قابل للضبط ومركز سلفونيوم على الحبل. يمكن تقسيم المسار الاصطناعي بأكمله إلى ثلاث عمليات رئيسية: إزالة الحماية من Cys على الراتنج ، واقتران الرابط ، والدوران بين Cys و Met في محلول انقسام حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA). علاوة على ذلك ، مستوحاة من تفاعل مركز السلفونيوم ، تم إرفاق مجموعة بروبارجيل ب Met لتحفيز إضافة ثيول ين وتشكيل ببتيد دوري. بعد ذلك ، تم تجفيف الببتيدات الخام وإذابتها في الأسيتونيتريل ، وفصلها ، ثم تنقيتها بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC). تم تأكيد الوزن الجزيئي للببتيد الدوري بواسطة قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS) ، وتم تأكيد استقرار تركيبة الببتيد الدوري مع المختزل باستخدام HPLC. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل التحول الكيميائي في الببتيد الدوري بواسطة أطياف الرنين المغناطيسي النووي 1H (1H NMR). بشكل عام ، يهدف هذا البروتوكول إلى وضع استراتيجية فعالة لتوليف الببتيدات الدورية.

Introduction

تلعب تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs)1 دورا محوريا في البحث والتطوير في مجال الأدوية. يعد بناء الببتيدات المستقرة ذات التشكل الثابت بالوسائل الكيميائية أحد أهم الطرق لتطوير أشكال محاكاة ل PPIs2. حتى الآن ، تم تطوير العديد من الببتيدات الحلقية التي تستهدف مثبطات مضخة البروتون للاستخدام السريري3. معظم الببتيدات مقيدة بتشكيل حلزوني α لتقليل الإنتروبيا التوافقية وتحسين الاستقرار الأيضي ، وتقارب ربط الهدف ، ونفاذية الخلية 4,5. في العقدين الماضيين ، تم إدخال السلاسل الجانبية ل Cys 6,7 و lysine8,9 و tryptophan 10 و arginine 11 و Met12,13 في الأحماض الأمينية غير الطبيعية لإصلاح الببتيد في شكل دوري. يمكن أن تستهدف هذه الببتيدات الحلقية مساحة كيميائية فريدة أو مواقع خاصة ، مما يؤدي إلى تفاعل تساهمي لتشكيل ارتباط تساهمي بالبروتينالببتيد 14،15،16،17. في تقرير حديث صادر عن Yu et al. ، تم تثبيت كلوروأسيتاميد في مجال روابط الببتيد ، مما يضمن تفاعل اقتران تساهمي مع خصوصية بروتين ممتازة18. علاوة على ذلك ، تم دمج الرؤوس الحربية المحبة للكهرباء ، مثل الأكريلاميد وفلوريد السلفونيل الأريل (ArSO2F) ، في الببتيدات بواسطة Walensky et al.19 لتشكيل مثبطات تساهمية ببتيدية مستقرة وتحسين التأثير المضاد للورم لمثبطات الببتيد. لذلك ، من المهم جدا إدخال مجموعة وظيفية إضافية من أجل تعديل روابط البروتين الببتيد20 تساهميا. لا تتفاعل هذه المجموعات مع البروتينات الموجودة على السلسلة الجانبية فحسب ، بل تعمل أيضا على استقرار التركيب الثانوي للببتيد21. ومع ذلك ، فإن تطبيق البروتينات المعدلة تساهميا التي تسببها روابط الببتيد محدود بسبب المسار الاصطناعي المعقد والارتباط غير المحدد للمجموعات الكيميائية22,23. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات فعالة لتوليف الببتيدات الحلقية.

مستوحى من الاستراتيجيات المتنوعة للببتيدات الحلقية2،24،25،26 ، يحاول هذا البروتوكول تطوير طريقة بسيطة وفعالة لتثبيت الببتيدات. بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أن مجموعة السلسلة الجانبية للببتيد المستقر يمكن أن تتفاعل تساهميا مع البروتين المستهدف عندما تكون قريبة مكانيا من روابط الببتيد. تم سد نقص Met المعدل كيميائيا من قبل مجموعة Deming في عام 2013 من خلال تطوير طريقة جديدة لإنتاج ميثيونين الببتيد المعدل بشكل انتقائي27. بناء على هذه الخلفية ، ركز Shi et al. على تطوير الإغلاق الحلقي للسلاسل الجانبية لتشكيل مركز ملح السلفونيوم. عندما يتحد ليجند الببتيد مع البروتين المستهدف ، تتفاعل مجموعة ملح السلفونيوم تساهميا مع بروتين Cys القريب مكانيا. في السنوات الأخيرة ، صمم Shi et al. طريقة جديدة لتثبيت الببتيد الدوري28. تم تقليل ملح السلفونيوم على الببتيد الدوري بواسطة عامل اختزال مع مجموعة سلفهيدريل التي تم اختزالها عكسيا إلى Met. ومع ذلك ، كان للتفاعل كفاءة منخفضة ، مما كان ضارا بدراسات التطبيق البيولوجي اللاحقة. في الدراسة الحالية ، تم تصميم تفاعل إغلاق حلقة Met-Cys وبروبارجيل بروميد-Cys ، مع بقاء ملح سلفونيوم واحد على السلسلة الجانبية للببتيد الدوري. كان ملح السلفونيوم بمثابة رأس حربي جديد يتفاعل تساهميا مع بروتين Cys تحت القرب المكاني. باختصار ، تم تدوير الببتيد المتحور Cys and Met عن طريق الألكلة داخل الجزيئات ، مما أدى إلى توليد مركز سلفونيوم على الحبل. في هذه العملية ، كان تشكيل جسر سلسلة جانبية أمرا بالغ الأهمية للببتيدات الدورية. بشكل عام ، يصف هذا البروتوكول دورة الببتيد التفصيلية القائمة على السلفونيوم والتي يتم تحقيقها باستخدام ظروف وعمليات تفاعل بسيطة. والهدف من ذلك هو تطوير طريقة محتملة لمزيد من التطبيقات البيولوجية الواسعة.

Protocol

1. إعداد المعدات

تنبيه: مورفولين ، N ، N- ثنائي ميثيل فورماميد (DMF) ، ثنائي كلورو الميثان (DCM) ، N ، N- ثنائي أيزوبروبيل إيثيل أمين (DIPEA) ، TFA ، مورفولين ، بيبيريدين ، ثنائي إيثيل الأثير ، والميثانول سامة ومتقلبة ومسببة للتآكل. يمكن أن تضر هذه الكواشف بجسم الإنسان من خلال الاستنشاق أو الابتلاع أو ملامسة الجلد. لجميع التجارب الكيميائية ، استخدم معدات الحماية ، بما في ذلك القفازات التي تستخدم لمرة واحدة والمعاطف التجريبية والنظارات الواقية.

  1. قم ببناء جميع ركائز الببتيد على راتنج Rink-amide 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) بواسطة تخليق الببتيد ذو الطور الصلب القائم على Fmoc (SPPS)29 ، كما هو موضح في الشكل 1.
  2. استخدام أي من الخيارين لبناء الببتيدات الخطية: الأول ، توليف الببتيد باستخدام عامل التكثيف 2- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N ، N ، N '، N'-رباعي ميثيل أورونيوم سداسي فلورو فوسفات (HATU) وكاشف DIPEA ؛ أو اثنين ، توليف باستخدام 1-هيدروكسي بنزوتريازول (HOBT) و N ، N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) ككاشف تكثيف أميد. حدد بروتوكولا مناسبا لتخليق الببتيد وفقا لتسلسل الببتيد.
  3. لإنشاء جهاز تخليق الببتيد اليدوي ، قم بإعداد معدات استخراج الطور الصلب الفراغي المعدلة في غطاء دخان وقم بتوصيله بمحبس ثلاثي الاتجاهات. بعد ذلك ، ضع خرطوشة مرشح البولي بروبلين أو مفاعل زجاجي على الجهاز أثناء توصيله بغاز النيتروجين (N2).
    ملاحظة: لتعديل معدات استخراج الطور الصلب الفراغي ، قم بإزالة أنبوب الاستخراج واحتفظ بنظام التفريغ المختوم.
  4. قم بتحميل راتنج MBHA في الأعمدة المملوءة بالراتنج وحلها في DMF. اضبط مفتاح المحبس ثلاثي الاتجاهات لفقاعات N2 ، ثم قم بإزالة المذيب في العمود باستخدام مضخة عاملة متصلة بنظام تفريغ. احسب كمية الأحماض الأمينية أو عامل التكثيف المطلوب باستخدام الصيغة التالية:
    الأحماض الأمينية (جم) وعامل التكثيف (جم) = مقياس الراتنج (جم) × قدرة تحميل الراتنج (mM / g) × مكافئ (5 مكافئ) × الوزن الجزيئي (جم / م)
    ملاحظة: اختر كمية الراتنج المحمل وفقا لطول ببتيد التوصيل. تستخدم مكافئات متعددة (مكافئ) للأحماض الأمينية للتفاعل بشكل كامل. يجب تحويل المذيبات السائلة إلى حجم حسب الكثافة. يوضح مكافئ 5 أن مقدار إدخال المركب المحسوب يتم تضخيمه بعامل خمسة.

2. إعداد الراتنج

ملاحظة: اختر كمية الراتنج المحمل وفقا لطول ببتيد التوصيل.

  1. وزن 302 ملغ من راتنج Rink-amide MBHA (0.331 mM / g محملة) في عمود (خزان 20 مل). أضف 5-10 مل من DCM أو DMF إلى العمود لتضخيم الراتنج تحت فقاعات N2 لمدة 30 دقيقة.
  2. بعد ذلك ، أغلق مفتاح N2 ، ثم قم بتشغيل مفتاح شفط مضخة التفريغ لإزالة المذيب. بعد ذلك ، اغسل الراتنجات بالتتابع باستخدام DCM (5-10 مل) و DMF (5-10 مل) 5x.

3. N- محطة Fmoc إزالة الحماية

ملاحظة: يتطلب إزالة الحماية بواسطة المورفولين 30 دقيقة ، ويستغرق إزالة الحماية بواسطة البيبيريدين 5 دقائق.

  1. تحضير محلول إزالة الحماية N-terminal 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc): قم بإعداد حجم كاف (500 مل) من 20٪ (v / v) بيبيريدين أو 50٪ (v / v) مورفولين في DMF في وعاء زجاجي لإزالة الحماية من مجموعة Fmoc.
  2. أضف 10 مل من محلول إزالة الحماية إلى العمود ، والفقاعة N2 في المحلول لمدة 30 دقيقة أو 5 دقائق 2x ، وكرر إجراءات إزالة الحماية 2x.
  3. قم بتصريف المحلول بواسطة مضخة تفريغ واغسل الراتنج بالتتابع باستخدام DCM (5-10 مل) و DMF (5-10 مل) 5x.
  4. اكتشف الراتنج كمحلول أصفر داكن اللون بنسبة 5٪ نينهيدرين (اختبار كايزر) بعد كل إزالة حماية لتأكيد عدم وجود مجموعة Fmoc قبل خطوة التوصيل. بالتفصيل ، أضف 1 مل من DMF إلى كمية صغيرة من الراتنج وأضف 200 ميكرولتر من 5٪ نينهيدرين إلى أنبوب زجاجي يتم تسخينه عند 130 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لتقييم التغيرات في لون الراتنج.
  5. قم بتصريف المحلول بواسطة مضخة تفريغ واغسل الراتنج بالتتابع باستخدام DCM (5-10 مل) و DMF (5-10 مل) 5x.

4. اقتران الببتيد الخطي (الشكل 2)

ملاحظة: عندما تحتوي تسلسلات الببتيد الاصطناعية على وحدتين متكررتين أو أكثر ، يمكن إجراء إجراء التوصيل مباشرة عن طريق تحديد نوع الأحماض الأمينية ، مثل Fmoc-AA-OH أو Fmoc-AAA-OH ، وما إلى ذلك. بعض الأحماض الأمينية الخاصة ذات العائق الستيريك والببتيدات ذات تسلسلات الأحماض الأمينية الأطول مطلوبة لتمديد وقت رد الفعل للاقتران بشكل صحيح.

  1. لخطوة اقتران واحدة ، خذ اقتران بقايا Cys كمثال (توليف 300 ملغ من موازين الراتنج). تحضير محلول خليط بما في ذلك Fmoc-Cys (Trt) -OH (5 مكافئ ، 292 مجم) و HATU (5 مكافئ ، 206 مجم) أو Fmoc-Cys (Trt) -OH (5 مكافئ ، 292 مجم) و HOBT (5 مكافئ ، 106 مجم) في أنبوب بولي بروبلين وإذابته في 3 مل من DMF.
  2. أضف 173 ميكرولتر من DIPEA (10 مكافئ) أو 154 ميكرولتر من DIC (10 مكافئ) إلى محلول Cys لتنشيط الحمض الأميني. دع الخليط ينشط مسبقا لمدة 1 دقيقة. أضف الخليط إلى العمود بالراتنج ، وقم بفقاعته ب N 2 لمدة2 ساعة.
    ملاحظة: يجب توحيد وقت التفاعل المحدد المطلوب للكشف عن 5٪ نينهيدرين.
  3. بعد الاقتران ، أضف 1 مل من DMF إلى كمية صغيرة من الراتنج وأضف 200 ميكرولتر من 5٪ نينهيدرين إلى أنبوب زجاجي يتم تسخينه عند 130 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. لاحظ تغيير الراتنج إلى عديم اللون لتأكيد عدم وجود مجموعة أمينية حرة قبل خطوة إزالة الحماية.
  4. قم بتصريف المحلول باستخدام مضخة تفريغ واغسل الراتنج بالتتابع باستخدام DCM (5-10 مل) و DMF (5-10 مل) 5x.
  5. أضف 10 مل من محلول إزالة الحماية إلى العمود ، وفقاعة مع N2 لمدة 30 دقيقة أو 5 دقائق 2x ، وأضف محلولا جديدا ، وكرر إجراءات إزالة الحماية 2x.
  6. كرر الخطوات التالية: إلغاء حماية مجموعة Fmoc ؛ الكشف عن إزالة الحماية من الراتنج ؛ غسل الراتنج اقتران الأحماض الأمينية. الكشف عن تفاعل اقتران. كرر خطوة اقتران حتى يتم تصنيع جميع الببتيدات.
    ملاحظة: استخدم اختبار Kaiser لمراقبة ما إذا كانت كل خطوة من خطوات إزالة الحماية كاملة أو ما إذا كانت كل خطوة من خطوات اقتران الأحماض الأمينية شاملة. بدلا من ذلك ، يمكن شق كمية صغيرة من الببتيد من الراتنج وفحصها بواسطة LC-MS للاقتران الناجح.

5. Bisalkylation بين Met و Cys (الشكل 3)

  1. قم ببناء ببتيد خطي باستخدام Met و Cys عن طريق تكرار الخطوات 4.1-4.6. أضف 10 مل من الميثانول اللامائي إلى العمود مع الراتنج للتجفيف وجفف باستخدام N2 للاستخدام التالي (كرر 2x) بعد اقتران الببتيد الخطي.
  2. قم بوزن 100 مجم من الراتنج الذي تم الحصول عليه في الخطوة السابقة في عمود (خزان 20 مل) واغسل الراتنج باستخدام DCM (5-10 مل) و DMF (5-10 مل) قبل خطوة التوصيل.
  3. قم بإعداد حل لإزالة مجموعة حماية Cys trt (trityl). قم بإعداد كمية كافية (100 مل) من خليط TFA / TIS / DCM (3: 5: 92) في وعاء زجاجي لإزالة مجموعة الحماية.
  4. أضف 5-10 مل من محلول TFA / TIS / DCM (3: 5: 92) إلى العمود لإزالة مجموعة الحماية لمدة 10 دقائق. كرر ست مرات مع فقاعات N2 حتى يختفي اللون الأصفر تماما.
  5. قم بتصريف المحلول بواسطة مضخة تفريغ واغسل الراتنج بالتتابع باستخدام DCM (5-10 مل) و DMF (5-10 مل) 5x.
  6. قم بإعداد حل للتفاعل مع Cys غير المحمي. تحضير كمية كافية (50 مل) من محلول الخليط (DMF) بما في ذلك الرابط ثنائي الهلجنة (2 مكافئ) و DIPEA (4 مكافئ) للتفاعل مع Cys غير المحمي.
  7. أضف 5-10 مل من محلول التفاعل إلى العمود للتفاعل مع Cys غير المحمي لمدة 3 ساعات على الأقل مع فقاعات N2 . يجفف بالميثانول اللامائي ويجفف باستخدام N2 للاستخدام التالي.
  8. قم بتصريف المحلول بواسطة مضخة تفريغ واغسل الراتنج بالتتابع باستخدام DCM (5-10 مل) و DMF (5-10 مل) 5x.
  9. تحضير محلول لتدوير الببتيد: تحضير حجم كاف (20 مل) من خليط TFA (TFA: TIS: H 2 O = 95: 2.5:2.5) في وعاء زجاجي في غطاء الدخان لتدوير الببتيد.
  10. أضف 5-10 مل من محلول خليط TFA إلى أنبوب البولي بروبلين وشق الراتنج تحت كوكتيل TFA لمدة 3 ساعات.
    تنبيه: TFA شديد التآكل ومزعج ؛ يجب إجراء عملية انقسام الببتيد في غطاء الدخان.
  11. قم بتنفيذ الخطوات 7.1-7.5 للحصول على محلول ببتيد خطي عن طريق تنقية الطور السائل العكسي (HPLC). قم بتجميد المحلول للاستخدام التالي.

6. بروبارجيل سلفونيوم الملح cyclization (الشكل 4)

  1. قم ببناء ببتيد خطي باستخدام Met و Cys عن طريق تكرار الخطوات 4.1-4.6. أضف 10 مل من الميثانول اللامائي إلى العمود مع الراتنج للتجفيف وجفف باستخدام N2 للاستخدام التالي (كرر مرتين) بعد اقتران الببتيد الخطي.
  2. قم بوزن 100 مجم من الراتنج الذي تم الحصول عليه في الخطوة السابقة في عمود (خزان 20 مل) واغسل الراتنج باستخدام DCM (5-10 مل) و DMF (5-10 مل) قبل خطوة التوصيل.
  3. قم بتنفيذ الخطوات 7.1-7.5 للحصول على محلول ببتيد خطي بواسطة HPLC ، وتجفيف العينة بالتجميد ، كما ذكرنا ، للاستخدام التالي.
  4. قم بإعداد محلول مائي HCOOH 1٪ (في الحجم) و 1.0 mM بروبارجيل بروميد (5 مكافئ) وأضفه إلى محلول الببتيد Met (0.2 mM ، 1 مكافئ ؛ 0.2 مل من MeCN / H2O [1: 1 ، v / v]).
  5. بعد ذلك ، هز تفاعل اقتران Met وبروبارجيل بروميد في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.
  6. بعد التفاعل ، قم بإذابة المنتج في أنبوب بولي بروبيلين في الأسيتونيتريل وقم بترشيحه من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بتنقية المحلول عن طريق عكس HPLC على الفور وتجفيفه بالتجميد إلى مسحوق للاستخدام التالي.
  7. في الخطوة الأخيرة ، أضف الببتيد مع بروميد البروبارجيل إلى أنبوب البولي بروبلين ، وحافظ على درجة حموضة محلول التفاعل عند 8.0 بإضافة محلول (NH4) 2CO3 ، ورج خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. تحصل هذه الخطوة على الببتيد الدوري لملح بروبارجيل السلفونيوم.
  8. اجمع خليط التفاعل الأخير: قم بحله في أنبوب بولي بروبيلين في الأسيتونيتريل وقم بترشيحه من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بتنقية المحلول عن طريق عكس HPLC على الفور وتجفيفه بالتجميد إلى مسحوق للاستخدام التالي.

7. تنقية الببتيدات الحلقية

  1. قم ببناء ركائز الببتيد الخطية على راتنج Rink-amide MBHA عن طريق تكرار الخطوات 4.1-4.6. أضف 10 مل من الميثانول اللامائي إلى العمود مع الراتنج للتجفيف وجفف مع N2 للاستخدام التالي (كرر مرتين) بعد اقتران الببتيد الخطي.
  2. قم بإعداد كمية كافية من كوكتيل الانقسام (TFA / H 2 O / TIS ، v / v / v ، 95: 2.5:2.5) في غطاء الدخان. أضف 1-5 مل من محلول خليط TFA إلى أنبوب البولي بروبلين وشق الراتنج تحت كوكتيل TFA لمدة 3 ساعات.
  3. بعد ذلك ، قم بتجفيف الراتنج بالتتابع تحت بخار N2 في العمود. بدلا من ذلك ، استخدم جهاز مرشح لتصفية الراتنج وجمع محلول الببتيد. ثم أضف 20 مل من الأثير إلى محلول الببتيد لترسيب الببتيد ، وأجهزة الطرد المركزي عند 3500 × جم لمدة 5 دقائق ، وكرر مرتين. اجمع راسب الببتيد الخام وجففه تحت تيار N2 للخطوة التالية.
  4. قم بإذابة 200 مجم من الببتيد الخام في أنبوب بولي بروبيلين في 4 مل من محلول ماء الأسيتونيتريل وقم بترشيحه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. نقل الببتيد إلى إدراج قارورة HPLC. ضع الإدخال في أخذ العينات الأوتوماتيكي لنظام HPLC شبه التحضيري للمرحلة العكسية المجهز بعمود C18 5 ميكرومتر و 4.6 مم × 250 مم وحلقة حقن 1 مل.
  5. تنقية وعزل الببتيد باستخدام برنامج التدرج من 5٪ -95٪ أسيتونيتريل في الماء مع 0.1٪ TFA على مدى 30 دقيقة أثناء مراقبة أطياف HPLC باستخدام الأشعة فوق البنفسجية عند 254 نانومتر. قم بتأكيد الوزن الجزيئي للببتيد بواسطة LC-MS ، وجمع محلول الببتيد ، وقم بتجميده وتجفيفه إلى مسحوق للاستخدام التالي.

النتائج

تم تصنيع جميع الببتيدات الخطية على راتنج Rink-amide MBHA بواسطة توليف المرحلة الصلبة Fmoc اليدوي القياسي. تم بناء نموذج سداسي الببتيد الدوري (Ac (cyclo-I) -WMAAAC-NH2) كما هو موضح في الشكل 5A. والجدير بالذكر أنه تم إنشاء مركز شيرال جديد على الحبل بواسطة ألكلة الأرصاد الجوية ، مع تأكيد اثن?...

Discussion

يوفر النهج التركيبي الموصوف في هذه الورقة طريقة لتوليف الببتيدات الحلقية باستخدام Cys و Met في تسلسل الببتيد ، حيث يتم إنشاء الببتيدات الخطية الأساسية بواسطة تقنيات تخليق الببتيد ذات الطور الصلب الشائعة. بالنسبة لثنائي ألكلة الببتيدات الحلقية بين Cys و Met ، يمكن تقسيم المسار الاصطناعي بأكمله...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نقر بالدعم المالي من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2021YFC2103900) ؛ منح مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية (21778009 و 21977010) ؛ مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة قوانغدونغ (2022A1515010996 و 2020A1515010521): لجنة الابتكار في العلوم والتكنولوجيا في شنتشن ، (RCJC20200714114433053 ، JCYJ201805081522131455 ، و JCYJ20200109140406047) ؛ ومنحة معهد شنتشن-هونغ كونغ لعلوم الدماغ - مؤسسات البحوث الأساسية في شنتشن (2019SHIBS0004). يقر المؤلفون بدعم المجلة من العلوم الكيميائية ، والجمعية الملكية للكيمياء كمرجع 30 ومجلة الكيمياء العضوية ، الجمعية الكيميائية الأمريكية ، كمرجع 31.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,3-bis(bromomethyl)-benzenEnergyD0215
1,3-Dimethylbarbituric acidEnergyA46873
1H NMR and HSQCBruker AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrateEnergyE020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)EnergyA1797
2-mercaptopyridineEnergyY31130
6-Aminocaproic acidEnergyA010678
Acetic anhydrideEnergyA01021454
AcetonitrileAldrich9758
Ammonium carbonateEnergy12980
Dichloromethane (DCM)EnergyW330229
Digital Heating Cooling Drybath Thermo Scientific88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA)EnergyW320014
Dimethyl formamide (DMF)EnergyB020051
DithiothreitolEnergyA10027
Electrospray Ionization MassSHIMADZU2020 LC-MS2020
Fmoc-Ala-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30201
Fmoc-Cys(Trt)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30501
Fmoc-Gln(Trt)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30701
Fmoc-His(Boc)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30902
Fmoc-Ile-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31001
Fmoc-Lys(Boc)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31201
Fmoc-Met-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31301
Fmoc-Pro-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31501
Fmoc-Ser(tBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31601
Fmoc-Thr(tBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31701
Fmoc-Trp(Boc)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31901
Fmoc-Val-OHNanjing Peptide Biotech LtdR32001
Formic acidEnergyW810042
High Performance Liquid
Chromatography		SHIMADZULC-2030
MethanolAldrich9758
MorpholineAldrichM109062
N,N'-DiisopropylcarbodiimideEnergyB010023
Ninhydrin ReagentEnergyN7285
Propargyl bromideEnergyW320293
Rink Amide MBHA resinNanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates Thermo Scientific60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladiumEnergyT1350
Three-way stopcocksBio-Rad7328107
TriethylamineEnergyB010737
Trifluoroacetic acid (TFA)J&K101398
Triisopropylsilane (TIS)EnergyT1533

References

  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved