Construction de peptides cycliques à l’aide d’un centre de sulfonium sur attache

Résumé

Ce protocole présente la synthèse de peptides cycliques via la bisalkylation entre la cystéine et la méthionine et la réaction thiol-yne facile déclenchée par le centre propargylsulfonium.

Résumé

Ces dernières années, les peptides cycliques ont attiré une attention croissante dans le domaine de la découverte de médicaments en raison de leurs excellentes activités biologiques et, par conséquent, ils sont maintenant utilisés cliniquement. Il est donc essentiel de rechercher des stratégies efficaces pour synthétiser des peptides cycliques afin de promouvoir leur application dans le domaine de la découverte de médicaments. Cet article rapporte un protocole détaillé pour la synthèse efficace de peptides cycliques en utilisant la résine ou la bisalkylation intramoléculaire (intermoléculaire). En utilisant ce protocole, des peptides linéaires ont été synthétisés en tirant parti de la synthèse peptidique en phase solide avec cystéine (Cys) et méthionine (Met) couplées simultanément sur la résine. De plus, des peptides cycliques ont été synthétisés par bisalkylation entre Met et Cys à l’aide d’une attache accordable et d’un centre de sulfonium sur l’attache. L’ensemble de la voie synthétique peut être divisé en trois processus principaux: la déprotection de Cys sur la résine, le couplage de l’agent de liaison et la cyclisation entre Cys et Met dans une solution de clivage d’acide trifluoroacétique (TFA). De plus, inspiré par la réactivité du centre sulfonium, un groupe propargyle a été attaché au Met pour déclencher l’addition de thiol-yne et former un peptide cyclique. Après cela, les peptides bruts ont été séchés et dissous dans de l’acétonitrile, séparés, puis purifiés par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Le poids moléculaire du peptide cyclique a été confirmé par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS), et la stabilité de la combinaison peptidique cyclique avec le réducteur a été confirmée par HPLC. De plus, le décalage chimique dans le peptide cyclique a été analysé par des spectres de résonance magnétique nucléaire de ¹H (^{RMN de 1}H). Dans l’ensemble, ce protocole visait à établir une stratégie efficace de synthèse des peptides cycliques.

Introduction

Les interactions protéine-protéine (IPP)¹ jouent un rôle central dans la recherche et le développement de médicaments. La construction de peptides stabilisés avec une conformation fixe par des moyens chimiques est l’une des méthodes les plus importantes pour développer des motifs mimétiques des IPP². À ce jour, plusieurs peptides cycliques ciblant les IPP ont été développés pour un usage clinique³. La plupart des peptides sont contraints à une conformation en α-hélice pour diminuer l’entropie conformationnelle et améliorer la stabilité métabolique, l’affinité de liaison à la cible et la perméabilité cellulaire ^4,5. Au cours des 2 dernières décennies, les chaînes latérales de Cys^6,7, lysine^8,9, tryptophane 10, arginine 11 et Met^12,13 ont été insérées dans des acides aminés non naturels pour fixer le peptide dans une conformation cyclique. De tels peptides cycliques peuvent cibler un espace chimique unique ou des sites spéciaux, déclenchant ainsi une réaction covalente pour former une liaison covalente protéine-peptide^14,15,16,17. Dans un rapport récent de Yu et al., un chloroacétamide a été ancré sur le domaine des ligands peptidiques, assurant une réaction de conjugaison covalente avec une excellente spécificité protéique¹⁸. De plus, des ogives électrophiles, telles que l’acrylamide et le fluorure d’arylsulfonyle (ArSO₂F), ont été incorporées dans des peptides par Walensky et ^al.19 pour former des inhibiteurs covalents peptidiques stabilisés et améliorer l’effet antitumoral des inhibiteurs peptidiques. Par conséquent, il est très important d’introduire un groupe fonctionnel supplémentaire afin de modifier de manière covalente les ligands protéine-peptide²⁰. Ces groupes réagissent non seulement avec les protéines de la chaîne latérale, mais stabilisent également la structure secondaire du peptide²¹. Cependant, l’application de protéines modifiées par covalence induites par des ligands peptidiques est limitée en raison de la voie synthétique compliquée et de la liaison non spécifique des groupes chimiques^22,23. Des stratégies efficaces pour la synthèse de peptides cycliques sont donc nécessaires de toute urgence.

Inspiré par les multiples stratégies des peptides cycliques 2,24,25,26^, ce protocole tente de développer une méthode simple et efficace pour stabiliser les peptides. De plus, nous avons noté que le groupe de chaînes latérales d’un peptide stable pouvait réagir de manière covalente avec une protéine cible lorsqu’elle était spatialement proche des ligands peptidiques. Le manque de Met chimiquement modifié a été comblé par le groupe Deming en 2013 en développant une nouvelle méthode de production de méthionine^{peptidique 27} sélectivement modifiée. Sur la base de ce contexte, Shi et al. se sont concentrés sur le développement de la fermeture en anneau des chaînes latérales pour former un centre de sel de sulfonium. Lorsque le ligand peptidique se combine avec la protéine cible, le groupe sel de sulfonium réagit de manière covalente avec la protéine Cys spatialement proche. Ces dernières années, Shi et al. ont conçu une nouvelle méthode pour stabiliser le peptide cyclique²⁸. Le sel de sulfonium sur le peptide cyclique a été réduit par un agent réducteur avec un groupe sulfhydryle qui a été réduit de manière réversible à Met. Cependant, la réaction avait une faible efficacité, ce qui était nocif pour les études d’application biologique ultérieures. Dans la présente étude, une réaction de fermeture de cycle Met-Cys et bromure de propargyle-Cys a été conçue, avec un seul sel de sulfonium restant sur la chaîne latérale du peptide cyclique. Le sel de sulfonium a agi comme une nouvelle ogive qui a réagi de manière covalente avec la protéine Cys à proximité spatiale. En bref, un peptide muté par Cys et Met a été cyclisé par alkylation intramoléculaire, ce qui a entraîné la génération d’un centre de sulfonium sur l’attache. Dans ce processus, la formation d’un pont de chaîne latérale était essentielle pour les peptides cycliques. Dans l’ensemble, ce protocole décrit une cyclisation détaillée des peptides à base de sulfonium qui est réalisée en utilisant des conditions de réaction et des opérations simples. L’objectif est de développer une méthode potentielle pour d’autres applications biologiques à grande échelle.

Protocole

1. Préparation de l’équipement

ATTENTION : La morpholine, le N,N-diméthylformamide (DMF), le dichlorométhane (DCM), la N,N-diisopropyléthylamine (DIPEA), le TFA, la morpholine, la pipéridine, l’éther diéthylique et le méthanol sont toxiques, volatils et corrosifs. Ces réactifs peuvent nuire au corps humain par inhalation, ingestion ou contact cutané. Pour toutes les expériences chimiques, utilisez un équipement de protection, y compris des gants jetables, des manteaux expérimentaux et des lunettes de protection.

1. Construire tous les substrats peptidiques sur la résine Rink-amide 4-méthylbenzhydrylamine (MBHA) par synthèse peptidique en phase solide (SPPS)²⁹ manuelle standard, comme illustré à la figure 1.
2. Utiliser l’une ou l’autre des deux options pour construire des peptides linéaires : premièrement, synthétiser le peptide en utilisant l’agent de condensation 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N, N',N'-tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HATU) et un réactif de DIPEA; ou deux, synthétiser en utilisant le 1-hydroxybenzotriazole (HOBT) et le N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) comme réactif de condensation amide. Sélectionnez un protocole approprié pour la synthèse peptidique en fonction de la séquence du peptide.
3. Pour établir un dispositif manuel de synthèse peptidique, installez un équipement d’extraction en phase solide sous vide modifié dans une hotte et connectez-le à un robinet d’arrêt à trois voies. Ensuite, placez une cartouche filtrante en polypropylène ou un réacteur en verre sur l’équipement lorsqu’il est connecté à l’azote (N₂) gazeux.
   REMARQUE: Pour modifier l’équipement d’extraction sous vide en phase solide, retirez le tube d’extraction et conservez le système scellé sous vide.
4. Chargez la résine MBHA dans les colonnes remplies de résine et dissolvez-la dans du DMF. Régler l’interrupteur des robinets d’arrêt à trois voies pour le bouillonnement de N₂ , puis retirer le solvant dans la colonne à l’aide d’une pompe de travail connectée à un système de vide. Calculez la quantité d’acide aminé ou d’agent de condensation requise à l’aide de la formule suivante:
   Acide aminé (g) et agent de condensation (g) = échelle de résine (g) × capacité de charge de résine (mM/g) × équivalent (5 eq) × masse moléculaire (g/M)
   REMARQUE: Choisissez la quantité de résine chargée en fonction de la longueur du peptide de couplage. Plusieurs équivalents (eq) d’acides aminés sont utilisés pour réagir plus complètement. Les solvants liquides doivent être convertis en volume par densité. L’égaliseur 5 montre que la quantité d’entrée du composé calculé est amplifiée par un facteur de cinq.

2. Préparation de la résine

REMARQUE: Choisissez la quantité de résine chargée en fonction de la longueur du peptide de couplage.

1. Peser 302 mg de résine Rink-amide MBHA (0,331 mM/g chargé) dans une colonne (réservoir de 20 mL). Ajouter 5-10 mL de DCM ou de DMF dans la colonne pour faire gonfler la résine sous N₂ bouillonnant pendant 30 min.
2. Ensuite, fermez l’interrupteur N₂ , puis allumez l’interrupteur d’aspiration de la pompe à vide pour retirer le solvant. Ensuite, lavez les résines séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.

3. Déprotection FMOC N-terminal

REMARQUE: La déprotection par morpholine nécessite 30 min, et la déprotection par pipéridine prend 5 min.

1. Préparer la solution de déprotection N-terminale de 9-fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc) : préparer un volume suffisant (500 mL) de pipéridine à 20 % (v/v) ou de morpholine à 50 % (v/v) dans du DMF dans un récipient en verre pour la déprotection du groupe Fmoc.
2. Ajouter 10 mL de la solution de déprotection dans la colonne, introduire la bulle_N2 dans la solution pendant 30 min ou 5 min 2x et répéter les procédures de déprotection 2x.
3. Vidangez la solution à l’aide d’une pompe à vide et lavez la résine séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.
4. Détecter la résine sous forme de solution de couleur jaune foncé par 5% de ninhydrine (test Kaiser) après chaque déprotection pour confirmer l’absence du groupe Fmoc avant l’étape de couplage. En détail, ajoutez 1 mL de DMF à une petite quantité de résine et ajoutez 200 μL de ninhydrine à 5% dans un tube de verre chauffé à 130 °C pendant 3 minutes pour évaluer les changements de couleur de la résine.
5. Vidangez la solution à l’aide d’une pompe à vide et lavez la résine séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.

4. Couplage du peptide linéaire (Figure 2)

REMARQUE: Lorsque les séquences peptidiques synthétiques contiennent deux unités répétitives ou plus, la procédure de couplage peut être effectuée directement en sélectionnant le type d’acide aminé, tel que Fmoc-AA-OH ou Fmoc-AAA-OH, etc. Certains acides aminés spéciaux avec une entrave stérique et des peptides avec des séquences d’acides aminés plus longues sont nécessaires pour prolonger correctement le temps de réaction pour le couplage.

1. Pour une seule étape de couplage, prenons l’exemple du couplage du résidu Cys (synthétiser des échelles de résine de 300 mg). Préparer une solution de mélange comprenant du Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) et HATU (5 eq, 206 mg) ou du Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) et du HOBT (5 eq, 106 mg) dans un tube en polypropylène et la dissoudre dans 3 mL de DMF.
2. Ajouter 173 μL de DIPEA (10 eq) ou 154 μL de DIC (10 eq) à la solution de Cys pour activer l’acide aminé. Laisser le mélange pré-activer pendant 1 min. Ajouter le mélange à la colonne avec de la résine et le buller avec N 2 pendant₂ h.
   REMARQUE : Le temps de réaction spécifique requis doit être normalisé pour détecter la ninhydrine à 5 %.
3. Après le couplage, ajouter 1 mL de DMF à une petite quantité de résine et ajouter 200 μL de ninhydrine à 5 % dans un tube de verre chauffé à 130 °C pendant 3 min. Observez le changement de résine en incolore pour confirmer l’absence d’un groupe amino libre avant l’étape de déprotection.
4. Vidangez la solution à l’aide d’une pompe à vide et lavez la résine séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.
5. Ajouter 10 mL de la solution de déprotection dans la colonne, faire des bulles avec N₂ pendant 30 min ou 5 min 2x, ajouter une solution fraîche et répéter les procédures de déprotection 2x.
6. Répétez les étapes suivantes : déprotection du groupe Fmoc ; détection de la déprotection de la résine; laver la résine; couplage de l’acide aminé; détection de la réaction de couplage. Répétez l’étape de couplage jusqu’à ce que tous les peptides soient synthétisés.
   REMARQUE: Utilisez le test de Kaiser pour vérifier si chaque étape de la déprotection est terminée ou si chaque étape du couplage d’acides aminés est approfondie. Alternativement, une petite quantité de peptide peut être clivée de la résine et vérifiée par LC-MS pour un couplage réussi.

5. Bisalkylation entre Met et Cys (Figure 3)

1. Construire un peptide linéaire avec Met et Cys en répétant les étapes 4.1-4.6. Ajouter 10 mL de méthanol anhydre à la colonne avec de la résine pour déshydrater et sécher avec N₂ pour la prochaine utilisation (répéter 2x) après couplage peptidique linéaire.
2. Peser 100 mg de la résine obtenue à l’étape précédente dans une colonne (réservoir de 20 mL) et laver la résine avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) avant l’étape de couplage.
3. Préparez une solution pour supprimer le groupe de protection Cys trt(trityl). Préparer un volume suffisant (100 mL) de mélange TFA/TIS/DCM (3:5:92) dans un récipient en verre pour enlever le groupe protectiove.
4. Ajouter 5 à 10 mL de la solution de TFA/TIS/DCM (3:5:92) dans la colonne pour retirer le groupe de protection pendant 10 min. Répétez six fois avec N₂ bouillonnant jusqu’à ce que la couleur jaune disparaisse complètement.
5. Vidangez la solution à l’aide d’une pompe à vide et lavez la résine séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.
6. Préparez une solution pour réagir avec des Cys déprotégés. Préparer un volume suffisant (50 mL) de solution de mélange (DMF) comprenant un agent de liaison dihalogéné (2 eq) et du DIPEA (4 eq) pour réagir avec des Cys déprotégés.
7. Ajouter 5 à 10 mL de la solution réactionnelle à la colonne pour réagir avec les Cys déprotégés pendant au moins 3 h avec des bulles de N₂ . Déshydrater avec du méthanol anhydre et sécher avec du_N2 pour la prochaine utilisation.
8. Vidangez la solution à l’aide d’une pompe à vide et lavez la résine séquentiellement avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) 5x.
9. Préparer une solution pour la cyclisation peptidique : préparer un volume suffisant (20 mL) de mélange TFA (TFA:TIS:H 2 O = 95:2.5:_2.5) dans un récipient en verre dans la hotte pour la cyclisation peptidique.
10. Ajouter 5 à 10 mL de la solution de mélange TFA dans le tube en polypropylène et fendre la résine sous le cocktail TFA pendant 3 h.
    ATTENTION : L’AGT est très corrosif et irritant; Le processus de clivage peptidique doit être effectué dans une hotte.
11. Effectuer les étapes 7.1-7.5 pour obtenir une solution peptidique linéaire par purification en phase liquide en phase inverse (HPLC). Lyophiliser la solution pour la prochaine utilisation.

6. cyclisation du sel de propargylsulfonium (figure 4)

1. Construire un peptide linéaire avec Met et Cys en répétant les étapes 4.1-4.6. Ajouter 10 mL de méthanol anhydre à la colonne avec la résine pour déshydratation et sécher avec N₂ pour la prochaine utilisation (répéter deux fois) après couplage peptidique linéaire.
2. Peser 100 mg de la résine obtenue à l’étape précédente dans une colonne (réservoir de 20 mL) et laver la résine avec du DCM (5-10 mL) et du DMF (5-10 mL) avant l’étape de couplage.
3. Effectuer les étapes 7.1-7.5 pour obtenir une solution peptidique linéaire par CLHP, et lyophiliser l’échantillon, comme mentionné, pour la prochaine utilisation.
4. Préparer une solution aqueuse HCOOH à 1 % (en volume) et du bromure de propargyle à 1,0 mM (5 eq) et ajouter à la solution peptidique Met (0,2 mM, 1 éq; 0,2 mL de MeCN/_H2O[1:1, v/v]).
5. Ensuite, agiter la réaction de couplage du Met et du bromure de propargyle à température ambiante pendant 12 h.
6. Après la réaction, dissoudre le produit dans un tube en polypropylène dans de l’acétonitrile et le filtrer à travers une membrane de filtre de 0,22 μm. Ensuite, purifiez immédiatement la solution par CLHP en phase inverse et lyophilisez-la en poudre pour la prochaine utilisation.
7. Dans la dernière étape, ajouter le peptide avec du bromure de propargyle dans un tube en polypropylène, maintenir le pH de la solution réactionnelle à 8,0 en ajoutant une solution de (NH₄)₂CO₃ et agiter le mélange réactionnel à 37 °C pendant 12 h. Cette étape permet d’obtenir le peptide cyclique du sel de propargylsulfonium.
8. Recueillir le dernier mélange réactionnel : le dissoudre dans un tube en polypropylène dans de l’acétonitrile et le filtrer à travers une membrane filtrante de 0,22 μm. Ensuite, purifiez immédiatement la solution par CLHP en phase inverse et lyophilisez-la en poudre pour la prochaine utilisation.

7. Purification des peptides cycliques

1. Construire des substrats peptidiques linéaires sur la résine Rink-amide MBHA en répétant les étapes 4.1-4.6. Ajouter 10 mL de méthanol anhydre à la colonne avec de la résine pour déshydratation et sécher avec N₂ pour la prochaine utilisation (répéter deux fois) après couplage peptidique linéaire.
2. Préparer un volume suffisant de cocktail de clivage (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:_2.5) dans la hotte. Ajouter 1 à 5 mL de solution de mélange TFA dans le tube en polypropylène et fendre la résine sous le cocktail TFA pendant 3 h.
3. Ensuite, sécher séquentiellement la résine sous une vapeur de_N2 dans la colonne. Alternativement, utilisez un dispositif filtrant pour filtrer la résine et recueillir la solution peptidique. Ensuite, ajoutez 20 mL d’éther à la solution peptidique pour précipiter le peptide, centrifugez à 3 500 x g pendant 5 minutes et répétez deux fois. Recueillir le précipité peptidique brut et le sécher sous un flux de_N2 pour l’étape suivante.
4. Dissoudre 200 mg de peptide brut dans un tube en polypropylène dans 4 mL de solution acétonitrile-eau et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Transférer le peptide dans un flacon de CLHP. Placer l’insert dans l’échantillonneur automatique d’un système HPLC semi-préparatif en phase inverse équipé d’une colonne C18 de 5 μm, 4,6 mm x 250 mm et d’une boucle d’injection de 1 mL.
5. Purifier et isoler le peptide en utilisant un programme de gradient de 5% à 95% d’acétonitrile dans l’eau avec 0,1% de TFA sur 30 min tout en surveillant les spectres HPLC en utilisant des UV à 254 nm. Confirmer le poids moléculaire du peptide par LC-MS, recueillir la solution du peptide et lyophiliser en poudre pour la prochaine utilisation.

Résultats

Tous les peptides linéaires ont été synthétisés sur la résine Rink-amide MBHA par synthèse manuelle standard en phase solide Fmoc. Un hexapeptide cyclique modèle (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH₂) a été construit comme décrit à la figure 5A. Notamment, un nouveau centre chiral sur attache a été généré par l’alkylation Met, avec les deux épimères de peptide cyclique (Ia, Ib) confirmés par HPLC en phase inverse. De plus, la conversion et le rapport des épimères ont é...

Discussion

L’approche synthétique décrite dans cet article fournit une méthode de synthèse de peptides cycliques à l’aide de Cys et Met dans la séquence peptidique, dans laquelle les peptides linéaires de base sont construits par des techniques courantes de synthèse peptidique en phase solide. Pour la bisalkylation de peptides cycliques entre Cys et Met, l’ensemble de la voie synthétique peut être divisé en trois processus majeurs : la déprotection des Cys sur la résine, le couplage de l’agent de liaison, et la...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen	Energy	D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid	Energy	A46873
1H NMR and HSQC	Bruker	AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate	Energy	E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)	Energy	A1797
2-mercaptopyridine	Energy	Y31130
6-Aminocaproic acid	Energy	A010678
Acetic anhydride	Energy	A01021454
Acetonitrile	Aldrich	9758
Ammonium carbonate	Energy	12980
Dichloromethane (DCM)	Energy	W330229
Digital Heating Cooling Drybath	Thermo Scientific	88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA)	Energy	W320014
Dimethyl formamide (DMF)	Energy	B020051
Dithiothreitol	Energy	A10027
Electrospray Ionization Mass	SHIMADZU2020	LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30701
Fmoc-His(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30902
Fmoc-Ile-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31201
Fmoc-Met-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31301
Fmoc-Pro-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31901
Fmoc-Val-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R32001
Formic acid	Energy	W810042
High Performance Liquid Chromatography	SHIMADZU	LC-2030
Methanol	Aldrich	9758
Morpholine	Aldrich	M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Energy	B010023
Ninhydrin Reagent	Energy	N7285
Propargyl bromide	Energy	W320293
Rink Amide MBHA resin	Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates	Thermo Scientific	60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium	Energy	T1350
Three-way stopcocks	Bio-Rad	7328107
Triethylamine	Energy	B010737
Trifluoroacetic acid (TFA)	J&K	101398
Triisopropylsilane (TIS)	Energy	T1533