Costruzione di peptidi ciclici utilizzando un centro di solfonio on-tether

Riepilogo

Questo protocollo presenta la sintesi di peptidi ciclici tramite bisalchilazione tra cisteina e metionina e la facile reazione tiolo-yne innescata dal centro del propargil sulfinfo.

Abstract

Negli ultimi anni, i peptidi ciclici hanno attirato una crescente attenzione nel campo della scoperta di farmaci grazie alle loro eccellenti attività biologiche e, di conseguenza, sono ora utilizzati clinicamente. È quindi fondamentale cercare strategie efficaci per sintetizzare peptidi ciclici per promuovere la loro applicazione nel campo della scoperta di farmaci. Questo articolo riporta un protocollo dettagliato per la sintesi efficiente di peptidi ciclici utilizzando bisalchilazione on-resina o intramolecolare (intermolecolare). Utilizzando questo protocollo, i peptidi lineari sono stati sintetizzati sfruttando la sintesi di peptidi in fase solida con cisteina (Cys) e metionina (Met) accoppiati simultaneamente sulla resina. Inoltre, i peptidi ciclici sono stati sintetizzati tramite bisalchilazione tra Met e Cys utilizzando un cavo sintonizzabile e un centro di solfonio on-tether. L'intero percorso sintetico può essere suddiviso in tre processi principali: la deprotezione di Cys sulla resina, l'accoppiamento del linker e la ciclizzazione tra Cys e Met in una soluzione di scissione dell'acido trifluoroacetico (TFA). Inoltre, ispirato dalla reattività del centro del sulfonio, un gruppo propargilico è stato attaccato al Met per innescare l'aggiunta di tiolo-yne e formare un peptide ciclico. Successivamente, i peptidi grezzi sono stati essiccati e sciolti in acetonitrile, separati e quindi purificati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Il peso molecolare del peptide ciclico è stato confermato dalla cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) e la stabilità della combinazione di peptidi ciclici con il riducente è stata ulteriormente confermata utilizzando HPLC. Inoltre, lo spostamento chimico nel peptide ciclico è stato analizzato da spettri di risonanza magnetica ^nucleare1 H (¹H NMR). Nel complesso, questo protocollo mirava a stabilire una strategia efficace per sintetizzare peptidi ciclici.

Introduzione

Le interazioni proteina-proteina (PPI)¹ svolgono un ruolo fondamentale nella ricerca e nello sviluppo di farmaci. La costruzione di peptidi stabilizzati con una conformazione fissa con mezzi chimici è uno dei metodi più importanti per lo sviluppo di motivi mimetici di PPI². Ad oggi, diversi peptidi ciclici che prendono di mira i PPI sono stati sviluppati per uso clinico³. La maggior parte dei peptidi sono vincolati a una conformazione a α-elica per diminuire l'entropia conformazionale e migliorare la stabilità metabolica, l'affinità di legame del bersaglio e la permeabilità cellulare ^4,5. Negli ultimi 2 decenni, le catene laterali di Cys ^6,7, lisina^8,9, triptofano 10, arginina 11 e Met^12,13 sono state inserite in amminoacidi innaturali per fissare il peptide in una conformazione ciclica. Tali peptidi ciclici possono colpire uno spazio chimico unico o siti speciali, innescando così una reazione covalente per formare un legame covalente proteina-peptide^14,15,16,17. In un recente rapporto di Yu et al., una cloroacetammide è stata ancorata al dominio dei ligandi peptidici, garantendo una reazione di coniugazione covalente con un'eccellente specificità proteica¹⁸. Inoltre, testate elettrofile, come l'acrilammide e il fluoruro di arilsulfonile (ArSO₂F), sono state ulteriormente incorporate nei peptidi da Walensky et ^al.19 per formare inibitori covalenti peptidici stabilizzati e migliorare l'effetto antitumorale degli inibitori peptidici. Pertanto, è molto importante introdurre un ulteriore gruppo funzionale per modificare covalentemente i ligandi proteina-peptide²⁰. Questi gruppi non solo reagiscono con le proteine sulla catena laterale, ma stabilizzano anche la struttura secondaria del peptide²¹. Tuttavia, l'applicazione di proteine modificate covalentemente indotta da ligandi peptidici è limitata a causa della complicata via sintetica e del legame non specifico dei gruppi chimici^22,23. Sono quindi urgentemente necessarie strategie efficaci per la sintesi di peptidi ciclici.

Ispirato alle molteplici strategie dei peptidi ciclici 2,24,25,26^, questo protocollo tenta di sviluppare un metodo semplice ed efficace per stabilizzare i peptidi. Inoltre, abbiamo notato che il gruppo della catena laterale di un peptide stabile potrebbe reagire covalentemente con una proteina bersaglio quando era spazialmente vicino ai ligandi peptidici. La mancanza di Met chimicamente modificato è stata colmata dal gruppo Deming nel 2013 sviluppando un nuovo metodo per produrre metionina²⁷ peptidica selettivamente modificata. Sulla base di questo background, Shi et al. si sono concentrati sullo sviluppo della chiusura ad anello delle catene laterali per formare un centro di sali di sulfone. Quando il ligando peptidico si combina con la proteina bersaglio, il gruppo salino solfonico reagisce covalentemente con la proteina Cys spazialmente vicina. Negli ultimi anni, Shi et al. hanno progettato un nuovo metodo per stabilizzare il peptide ciclico²⁸. Il sale di solfonio sul peptide ciclico è stato ridotto da un agente riducente con un gruppo sulfidrilico che è stato ridotto reversibilmente a Met. Tuttavia, la reazione ha avuto una bassa efficienza, che è stata dannosa per i successivi studi di applicazione biologica. Nel presente studio, è stata progettata una reazione di chiusura dell'anello Met-Cys e propargyl bromuro-Cys, con un singolo sale di solfonio che rimane sulla catena laterale del peptide ciclico. Il sale di solfonio agiva come una nuova testata che reagiva covalentemente con la proteina Cys nelle vicinanze spaziali. In breve, un peptide mutato Cys e Met è stato ciclizzato mediante alchilazione intramolecolare, con conseguente generazione di un centro di solfonio on-tether. In questo processo, la formazione di un ponte a catena laterale era fondamentale per i peptidi ciclici. Nel complesso, questo protocollo descrive una ciclizzazione dettagliata del peptide a base di solfonio che si ottiene utilizzando semplici condizioni e operazioni di reazione. L'obiettivo è quello di sviluppare un metodo potenziale per ulteriori applicazioni biologiche di ampia portata.

Protocollo

1. Preparazione dell'attrezzatura

ATTENZIONE: Morfolina, N, N-dimetilformammide (DMF), diclorometano (DCM), N, N-diisopropiletilammina (DIPEA), TFA, morfolina, piperidina, etere etilico e metanolo sono tossici, volatili e corrosivi. Questi reagenti possono danneggiare il corpo umano attraverso l'inalazione, l'ingestione o il contatto con la pelle. Per tutti gli esperimenti chimici, utilizzare dispositivi di protezione, inclusi guanti monouso, cappotti sperimentali e occhiali protettivi.

1. Costruire tutti i substrati peptidici sulla resina Rink-amide 4-metilbenzidrilammina (MBHA) mediante sintesi peptidica in fase solida (SPPS)²⁹ manuale standard, come mostrato nella Figura 1.
2. Utilizzare una delle due opzioni per la costruzione di peptidi lineari: uno, sintetizzare il peptide utilizzando l'agente condensante 2-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N, N',N'-tetrametiluronio esafluorofosfato (HATU) e un reagente di DIPEA; o due, sintetizzare utilizzando 1-idrossibenzotriazolo (HOBT) e N,N'-diisopropilcarbodiimide (DIC) come reagente di condensazione ammidica. Selezionare un protocollo appropriato per la sintesi del peptide in base alla sequenza del peptide.
3. Per stabilire un dispositivo manuale di sintesi peptidica, installare un'apparecchiatura di estrazione in fase solida sottovuoto modificata in una cappa aspirante e collegarla con un rubinetto a tre vie. Quindi, posizionare una cartuccia filtrante in polipropilene o un reattore di vetro sull'apparecchiatura mentre è collegata al gas di azoto (N₂).
   NOTA: Per modificare l'apparecchiatura di estrazione in fase solida sotto vuoto, rimuovere il tubo di estrazione e mantenere il sistema sigillato sottovuoto.
4. Caricare la resina MBHA nelle colonne riempite di resina e scioglierla in DMF. Regolare l'interruttore dei rubinetti di arresto a tre vie per il gorgogliamento di N₂ , quindi rimuovere il solvente nella colonna utilizzando una pompa funzionante collegata a un sistema di vuoto. Calcolare la quantità di aminoacido o agente condensante necessaria utilizzando la seguente formula:
   Amminoacido (g) e agente condensante (g) = scaglie di resina (g) × capacità di carico della resina (mM/g) × equivalente (5 eq) × peso molecolare (g/M)
   NOTA: Scegliere la quantità di resina caricata in base alla lunghezza del peptide di accoppiamento. Più equivalenti (eq) di amminoacidi sono usati per reagire più pienamente. I solventi liquidi devono essere convertiti in volume in base alla densità. Il 5 eq mostra che la quantità di input del composto calcolato è amplificata di un fattore cinque.

2. Preparazione della resina

NOTA: Scegliere la quantità di resina caricata in base alla lunghezza del peptide di accoppiamento.

1. Pesare 302 mg di resina MBHA Rink-ammide (0,331 mM/g caricati) in una colonna (serbatoio da 20 ml). Aggiungere 5-10 ml di DCM o DMF nella colonna per gonfiare la resina sotto N₂ gorgogliando per 30 minuti.
2. Quindi, chiudere l'interruttore N₂ , quindi accendere l'interruttore di aspirazione della pompa per vuoto per rimuovere il solvente. Quindi, lavare le resine in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.

3. Deprotezione Fmoc N-terminale

NOTA: La deprotezione con morfolina richiede 30 minuti e la deprotezione con piperidina richiede 5 minuti.

1. Preparare la soluzione di deprotezione N-terminale 9-fluorenilmetilossicarbonile (Fmoc): preparare un volume sufficiente (500 ml) di piperidina al 20% (v/v) o al 50% (v/v) di morfolina in DMF in un contenitore di vetro per la deprotezione del gruppo Fmoc.
2. Aggiungere 10 ml della soluzione di deprotezione alla colonna, bolla N₂ nella soluzione per 30 minuti o 5 minuti 2x e ripetere le procedure di deprotezione 2x.
3. Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.
4. Rilevare la resina come soluzione di colore giallo scuro al 5% di ninidrina (test Kaiser) dopo ogni deprotezione per confermare l'assenza del gruppo Fmoc prima della fase di accoppiamento. In dettaglio, aggiungere 1 mL di DMF a una piccola quantità di resina e aggiungere 200 μL di ninidrina al 5% in un tubo di vetro riscaldato a 130 °C per 3 minuti per valutare le variazioni del colore della resina.
5. Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.

4. Accoppiamento del peptide lineare (Figura 2)

NOTA: Quando le sequenze peptidiche sintetiche contengono due o più unità ripetute, la procedura di accoppiamento può essere eseguita direttamente selezionando il tipo di amminoacido, come Fmoc-AA-OH o Fmoc-AAA-OH e così via. Alcuni amminoacidi speciali con impedimento sterico e peptidi con sequenze aminoacidiche più lunghe sono necessari per estendere correttamente il tempo di reazione per l'accoppiamento.

1. Per una singola fase di accoppiamento, prendere come esempio l'accoppiamento del residuo di Cys (sintetizzare scaglie di resina da 300 mg). Preparare una soluzione di miscela comprendente Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) e HATU (5 eq, 206 mg) o Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) e HOBT (5 eq, 106 mg) in un tubo di polipropilene e scioglierla in 3 mL di DMF.
2. Aggiungere 173 μL di DIPEA (10 eq) o 154 μL di DIC (10 eq) alla soluzione di Cys per attivare l'amminoacido. Lasciare che la miscela si pre-attivi per 1 minuto. Aggiungere la miscela alla colonna con resina e bollire con N 2 per₂ ore.
   NOTA: Il tempo di reazione specifico richiesto deve essere standardizzato per rilevare il 5% di ninidrina.
3. Dopo l'accoppiamento, aggiungere 1 mL di DMF a una piccola quantità di resina e aggiungere 200 μL di ninidrina al 5% in un tubo di vetro riscaldato a 130 °C per 3 minuti. Osservare la resina cambiare in incolore per confermare l'assenza di un gruppo amminico libero prima della fase di deprotezione.
4. Scolare la soluzione utilizzando una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.
5. Aggiungere 10 ml della soluzione di deprotezione alla colonna, bollire con N₂ per 30 minuti o 5 minuti 2x, aggiungere soluzione fresca e ripetere le procedure di deprotezione 2x.
6. Ripetere i seguenti passaggi: deprotezione del gruppo Fmoc; rilevare la deprotezione della resina; lavare la resina; accoppiamento dell'amminoacido; rilevare la reazione di accoppiamento. Ripetere la fase di accoppiamento fino a quando tutti i peptidi sono sintetizzati.
   NOTA: Utilizzare il test Kaiser per monitorare se ogni fase della deprotezione è completa o se ogni fase dell'accoppiamento degli amminoacidi è completa. In alternativa, una piccola quantità di peptide può essere scissa dalla resina e controllata da LC-MS per un accoppiamento di successo.

5. Bisalchilazione tra Met e Cys (Figura 3)

1. Costruire un peptide lineare con Met e Cys ripetendo i passaggi 4.1-4.6. Aggiungere 10 ml di metanolo anidro alla colonna con resina per disidratare e asciugare con N₂ per l'uso successivo (ripetere 2x) dopo l'accoppiamento peptidico lineare.
2. Pesare 100 mg della resina ottenuta nella fase precedente in una colonna (serbatoio da 20 ml) e lavare la resina con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) prima della fase di accoppiamento.
3. Preparare una soluzione per rimuovere il gruppo protezione Cys trt(tritile). Preparare un volume sufficiente (100 ml) di miscela TFA/TIS/DCM (3:5:92) in un contenitore di vetro per rimuovere il gruppo protectiove.
4. Aggiungere 5-10 mL della soluzione di TFA/TIS/DCM (3:5:92) alla colonna per rimuovere il gruppo di protezione per 10 minuti. Ripeti sei volte con N₂ gorgogliando fino a quando il colore giallo scompare completamente.
5. Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.
6. Preparare una soluzione per reagire con Cys non protetto. Preparare un volume sufficiente (50 ml) di soluzione di miscela (DMF) compreso il linker dialogenato (2 eq) e DIPEA (4 eq) per reagire con Cys deprotetto.
7. Aggiungere 5-10 mL della soluzione di reazione alla colonna per reagire con Cys deprotetto per almeno 3 ore con gorgogliamento di N₂ . Disidratare con metanolo anidro e asciugare con N₂ per l'uso successivo.
8. Scaricare la soluzione con una pompa per vuoto e lavare la resina in sequenza con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) 5x.
9. Preparare una soluzione per la ciclizzazione dei peptidi: preparare un volume sufficiente (20 ml) di miscela TFA (TFA:TIS:H 2 O = 95:2.5:_2.5) in un contenitore di vetro nella cappa aspirante per la ciclizzazione dei peptidi.
10. Aggiungere 5-10 ml della soluzione di miscela TFA al tubo di polipropilene e tagliare la resina sotto il cocktail TFA per 3 ore.
    ATTENZIONE: il TFA è altamente corrosivo e irritante; Il processo di scissione del peptide deve essere eseguito in una cappa aspirante.
11. Eseguire i passaggi 7.1-7.5 per ottenere una soluzione peptidica lineare mediante purificazione in fase liquida in fase inversa (HPLC). Liofilizzare la soluzione per il prossimo utilizzo.

6. Ciclizzazione del sale di propargil solfonio (Figura 4)

1. Costruire un peptide lineare con Met e Cys ripetendo i passaggi 4.1-4.6. Aggiungere 10 ml di metanolo anidro alla colonna con la resina per disidratare e asciugare con N₂ per l'uso successivo (ripetere due volte) dopo l'accoppiamento peptidico lineare.
2. Pesare 100 mg della resina ottenuta nella fase precedente in una colonna (serbatoio da 20 ml) e lavare la resina con DCM (5-10 ml) e DMF (5-10 ml) prima della fase di accoppiamento.
3. Eseguire i passaggi 7.1-7.5 per ottenere una soluzione peptidica lineare mediante HPLC e liofilizzare il campione, come detto, per il prossimo utilizzo.
4. Preparare una soluzione acquosa HCOOH all'1% (in volume) e 1,0 mM di bromuro di propargile (5 eq) e aggiungere alla soluzione peptidica Met (0,2 mM, 1 eq; 0,2 mL di MeCN/H₂O [1:1, v/v]).
5. Quindi, agitare la reazione di accoppiamento di Met e propargil bromuro a temperatura ambiente per 12 ore.
6. Dopo la reazione, sciogliere il prodotto in un tubo di polipropilene in acetonitrile e filtrarlo attraverso una membrana filtrante da 0,22 μm. Quindi, purificare immediatamente la soluzione mediante HPLC in fase inversa e liofilizzarla in polvere per l'uso successivo.
7. Nell'ultima fase, aggiungere il peptide con bromuro di propargil in un tubo di polipropilene, mantenere il pH della soluzione di reazione a 8,0 aggiungendo la soluzione di (NH₄)₂CO₃ e agitare la miscela di reazione a 37 °C per 12 ore. Questo passaggio ottiene il peptide ciclico del sale propargil sulfinfo.
8. Raccogliere l'ultima miscela di reazione: scioglierla in un tubo di polipropilene in acetonitrile e filtrarla attraverso una membrana filtrante da 0,22 μm. Quindi, purificare immediatamente la soluzione mediante HPLC in fase inversa e liofilizzarla in polvere per l'uso successivo.

7. Purificazione dei peptidi ciclici

1. Costruire substrati peptidici lineari su resina MBHA Rink-ammide ripetendo i passaggi 4.1-4.6. Aggiungere 10 ml di metanolo anidro alla colonna con resina per disidratare e asciugare con N₂ per l'uso successivo (ripetere due volte) dopo l'accoppiamento peptidico lineare.
2. Preparare un volume sufficiente di cocktail di scissione (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:_2.5) nella cappa aspirante. Aggiungere 1-5 ml di soluzione di miscela TFA al tubo di polipropilene e tagliare la resina sotto il cocktail TFA per 3 ore.
3. Quindi, asciugare sequenzialmente la resina sotto un vapore di N₂ nella colonna. In alternativa, utilizzare un dispositivo filtrante per filtrare la resina e raccogliere la soluzione peptidica. Quindi, aggiungere 20 ml di etere alla soluzione peptidica per precipitare il peptide, centrifugare a 3.500 x g per 5 minuti e ripetere due volte. Raccogliere il precipitato peptidico grezzo e asciugarlo sotto un flusso di N₂ per il passaggio successivo.
4. Sciogliere 200 mg di peptide grezzo in un tubo di polipropilene in 4 ml di soluzione acetonitrile-acqua e filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 μm. Trasferire il peptide in un inserto di flaconcino HPLC. Inserire l'inserto nell'autocampionatore di un sistema HPLC semi-preparativo a fase inversa dotato di una colonna C18 da 5 μm, 4,6 mm x 250 mm e un circuito di iniezione da 1 ml.
5. Purificare e isolare il peptide utilizzando un programma gradiente del 5% -95% di acetonitrile in acqua con 0,1% di TFA per 30 minuti mentre si monitorano gli spettri HPLC utilizzando UV a 254 nm. Confermare il peso molecolare del peptide mediante LC-MS, raccogliere la soluzione del peptide e liofilizzarla in polvere per l'uso successivo.

Risultati

Tutti i peptidi lineari sono stati sintetizzati su resina Rink-amide MBHA mediante sintesi manuale standard Fmoc in fase solida. Un esapeptide ciclico modello (Ac (ciclo-I)-WMAAAC-NH₂) è stato costruito come descritto nella Figura 5A. In particolare, un nuovo centro chirale on-tether è stato generato dall'alchilazione di Met, con i due epimeri del peptide ciclico (Ia, Ib) confermati dall'HPLC in fase inversa. Inoltre, la conversione e il rapporto degli epimeri sono stati determi...

Discussione

L'approccio sintetico descritto in questo articolo fornisce un metodo per sintetizzare peptidi ciclici utilizzando Cys e Met nella sequenza peptidica, in cui i peptidi lineari di base sono costruiti con tecniche comuni di sintesi peptidica in fase solida. Per la bisalchilazione di peptidi ciclici tra Cys e Met, l'intera via sintetica può essere suddivisa in tre processi principali: la deprotezione di Cys sulla resina, l'accoppiamento del linker e la ciclizzazione tra Cys e Met in una soluzione di scissione dell'acido tr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen	Energy	D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid	Energy	A46873
1H NMR and HSQC	Bruker	AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate	Energy	E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)	Energy	A1797
2-mercaptopyridine	Energy	Y31130
6-Aminocaproic acid	Energy	A010678
Acetic anhydride	Energy	A01021454
Acetonitrile	Aldrich	9758
Ammonium carbonate	Energy	12980
Dichloromethane (DCM)	Energy	W330229
Digital Heating Cooling Drybath	Thermo Scientific	88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA)	Energy	W320014
Dimethyl formamide (DMF)	Energy	B020051
Dithiothreitol	Energy	A10027
Electrospray Ionization Mass	SHIMADZU2020	LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30701
Fmoc-His(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30902
Fmoc-Ile-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31201
Fmoc-Met-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31301
Fmoc-Pro-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31901
Fmoc-Val-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R32001
Formic acid	Energy	W810042
High Performance Liquid Chromatography	SHIMADZU	LC-2030
Methanol	Aldrich	9758
Morpholine	Aldrich	M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Energy	B010023
Ninhydrin Reagent	Energy	N7285
Propargyl bromide	Energy	W320293
Rink Amide MBHA resin	Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates	Thermo Scientific	60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium	Energy	T1350
Three-way stopcocks	Bio-Rad	7328107
Triethylamine	Energy	B010737
Trifluoroacetic acid (TFA)	J&K	101398
Triisopropylsilane (TIS)	Energy	T1533