JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג את הסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות ביסלקילציה בין ציסטאין למתיונין ואת תגובת תיול-ין המופעלת על ידי מרכז פרופרגיל סולפוניום.

Abstract

בשנים האחרונות, פפטידים מחזוריים מושכים תשומת לב גוברת בתחום גילוי התרופות בשל פעילותם הביולוגית המצוינת, וכתוצאה מכך הם משמשים כיום קלינית. לכן, חיוני לחפש אסטרטגיות יעילות לסינתזה של פפטידים מחזוריים כדי לקדם את יישומם בתחום גילוי התרופות. מאמר זה מדווח על פרוטוקול מפורט לסינתזה יעילה של פפטידים מחזוריים באמצעות ביסלקילציה תוך-מולקולרית או תוך-מולקולרית (בין-מולקולרית). באמצעות פרוטוקול זה, פפטידים ליניאריים סונתזו על ידי ניצול סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה עם ציסטאין (Cys) ומתיונין (Met) המצומדים בו זמנית על השרף. יתר על כן, פפטידים מחזוריים סונתזו באמצעות ביסלקילציה בין Met ו- Cys באמצעות קשירה הניתנת לכוונון ומרכז סולפוניום על קשירה. ניתן לחלק את כל המסלול הסינתטי לשלושה תהליכים עיקריים: הגנה על Cys על השרף, צימוד המקשר, ומחזוריות בין Cys ו- Met בתמיסת ביקוע חומצה טריפלואורואצטית (TFA). יתר על כן, בהשראת התגובה של מרכז הסולפוניום, קבוצת פרופרגיל הוצמדה למטרופוליטן כדי לגרום לתוספת תיול-ין וליצור פפטיד מחזורי. לאחר מכן, הפפטידים הגולמיים יובשו והתמוססו באצטוניטריל, הופרדו ולאחר מכן טוהרו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC). המשקל המולקולרי של הפפטיד המחזורי אושר על ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS), והיציבות של שילוב הפפטיד המחזורי עם הרדוקטנט אושרה עוד יותר באמצעות HPLC. בנוסף, השינוי הכימי בפפטיד המחזורי נותח על ידי ספקטרום תהודה מגנטית גרעינית של 1 H (1H NMR). בסך הכל, פרוטוקול זה נועד לבסס אסטרטגיה יעילה לסינתזה של פפטידים מחזוריים.

Introduction

אינטראקציות חלבון-חלבון (PPIs)1 ממלאות תפקיד מרכזי במחקר ובפיתוח תרופות. בניית פפטידים מיוצבים עם קונפורמציה קבועה באמצעים כימיים היא אחת השיטות החשובות ביותר לפיתוח מוטיבים מימטיים של PPIs2. עד כה פותחו מספר פפטידים מחזוריים המכוונים ל-PPIs לשימוש קליני3. רוב הפפטידים מוגבלים לקונפורמציה של סליל α כדי להפחית את האנטרופיה הקונפורמציונית ולשפר את היציבות המטבולית, זיקת קשירת המטרה וחדירות התאים 4,5. בשני העשורים האחרונים, השרשראות הצדדיות של Cys 6,7, ליזין 8,9, טריפטופן 10, ארגינין 11ו-Met 12,13 הוכנסו לחומצות אמינו לא טבעיות כדי לקבע את הפפטיד לקונפורמציה מחזורית. פפטידים מחזוריים כאלה יכולים לכוון למרחב כימי ייחודי או לאתרים מיוחדים, ובכך לעורר תגובה קוולנטית ליצירת קוולנטית חלבונית-פפטידית קוולנטית14,15,16,17. בדו"ח שפורסם לאחרונה על ידי Yu et al., כלורואצטמיד עוגן בתחום של ליגנדות פפטידיות, מה שמבטיח תגובת הצמדה קוולנטית עם ספציפיות מצוינת לחלבון18. יתר על כן, ראשי נפץ אלקטרופיליים, כגון אקרילאמיד ואריל סולפוניל פלואוריד (ArSO2F), שולבו עוד יותר בפפטידים על ידי Walensky et al.19 כדי ליצור מעכבי פפטיד קוולנטיים מיוצבים ולשפר את ההשפעה האנטי-סרטנית של מעכבי פפטידים. לכן, חשוב מאוד להציג קבוצה פונקציונלית נוספת על מנת לשנות באופן קוולנטי ליגנדות חלבון-פפטיד20. קבוצות אלה לא רק מגיבות עם חלבונים בשרשרת הצדדית אלא גם מייצבות את המבנה המשני של הפפטיד21. עם זאת, היישום של חלבונים שעברו שינוי קוולנטי המושרה על ידי ליגנדות פפטידיות מוגבל בשל המסלול הסינתטי המסובך והקשירה הלא ספציפית של הקבוצות הכימיות22,23. אסטרטגיות יעילות לסינתזה של פפטידים מחזוריים נדרשים, אם כן, בדחיפות.

בהשראת האסטרטגיות הרב-גוניות של פפטידים מחזוריים 2,24,25,26, פרוטוקול זה מנסה לפתח שיטה פשוטה ויעילה לייצוב פפטידים. בנוסף, ציינו כי קבוצת השרשרת הצדדית של פפטיד יציב יכולה להגיב באופן קוולנטי עם חלבון מטרה כאשר הוא היה קרוב מרחבית לליגנדות הפפטידיות. את המחסור ב-Met שעבר שינוי כימי מימשה קבוצת דמינג ב-2013 על ידי פיתוח שיטה חדשנית לייצור פפטיד מתיונין27 שעבר שינוי סלקטיבי. בהתבסס על רקע זה, Shi et al. התמקדו בפיתוח סגירת הטבעת של שרשראות צדדיות ליצירת מרכז מלח סולפוניום. כאשר הליגנד הפפטידי משתלב עם חלבון המטרה, קבוצת מלח הסולפוניום מגיבה באופן קוולנטי עם חלבון Cys הקרוב מרחבית. בשנים האחרונות עיצבו בני שי ואחרים שיטה חדשה לייצוב פפטיד מחזורי28. מלח הסולפוניום שעל הפפטיד המחזורי הופחת על ידי חומר מחזר עם קבוצת סולפהידריל שהופחתה באופן הפיך ל-Met. עם זאת, התגובה הייתה בעלת יעילות נמוכה, מה שהזיק למחקרי יישומים ביולוגיים מאוחרים יותר. במחקר הנוכחי תוכננה תגובת סגירה טבעתית של Met-Cys ופרופרגיל ברומיד-Cys, כאשר מלח סולפוניום יחיד נותר על השרשרת הצדדית של הפפטיד המחזורי. מלח הסולפוניום פעל כראש נפץ חדש שהגיב באופן קוולנטי עם החלבון Cys בסמיכות מרחבית. בקצרה, פפטיד שעבר מוטציה ב-Cys ו-Met היה מחזורי על-ידי אלקילציה תוך-מולקולרית, וכתוצאה מכך נוצר מרכז סולפוניום על-קשירה. בתהליך זה, היווצרות גשר שרשרת צדדי הייתה קריטית עבור פפטידים מחזוריים. בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר מחזוריות פפטידית מפורטת מבוססת סולפוניום המושגת באמצעות תנאי תגובה ופעולות פשוטות. המטרה היא לפתח שיטה פוטנציאלית ליישומים ביולוגיים רחבים נוספים.

Protocol

1. הכנת ציוד

אזהרה: מורפולין, N,N-דימתילפורמיד (DMF), דיכלורומתאן (DCM), N,N-דיאיזופרופילתילאמין (DIPEA), TFA, מורפולין, פיפרידין, אתר דיאתיל ומתנול הם רעילים, נדיפים וקורוזיביים. ריאגנטים אלה יכולים להזיק לגוף האדם באמצעות שאיפה, בליעה או מגע עם העור. עבור כל הניסויים הכימיים, השתמש בציוד מגן, כולל כפפות חד פעמיות, מעילים ניסיוניים ומשקפי מגן.

  1. בנה את כל מצעי הפפטידים על שרף Rink-amide 4-methylbenzhydrylamine (MBHA) על-ידי סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה (SPPS) ידנית סטנדרטית המבוססת על Fmoc29, כפי שמוצג באיור 1.
  2. השתמש באחת משתי האפשרויות לבניית פפטידים ליניאריים: האחת, לסנתז את הפפטיד תוך שימוש בחומר עיבוי 2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N, N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) ומגיב של DIPEA; או שניים, סינתזה תוך שימוש ב-1-הידרוקסיבנזוטריאזול (HOBT) ו-N,N'-diisopropylcarbodiimide (DIC) כמגיב עיבוי אמיד. בחר פרוטוקול מתאים לסינתזת פפטידים בהתאם לרצף הפפטיד.
  3. כדי להקים מכשיר סינתזת פפטידים ידני, הגדר ציוד מיצוי פאזה מוצקה בוואקום מותאם במכסה אדים וחבר אותו עם פקק תלת-כיווני. לאחר מכן, הנח מחסנית מסנן פוליפרופילן או כור זכוכית על הציוד בזמן שהוא מחובר לגז חנקן (N2).
    הערה: לשינוי ציוד מיצוי הפאזה המוצקה בוואקום, הסר את צינור החילוץ ושמור על המערכת האטומה בוואקום.
  4. טען שרף MBHA לתוך העמודות מלאות השרף והמיס אותו ב- DMF. התאם את המתג של הפקקים התלת-כיווניים עבור N2 מבעבע, ולאחר מכן הסר את הממס בעמודה באמצעות משאבת עבודה המחוברת למערכת ואקום. חשב את כמות חומצת האמינו או סוכן העיבוי הנדרשת באמצעות הנוסחה הבאה:
    חומצת אמינו (g) וחומר עיבוי (g) = סולם שרף (g) × כושר העמסת שרף (mM/g) × שווה ערך (5 eq) × משקל מולקולרי (g/M)
    הערה: בחר את כמות השרף הטעון בהתאם לאורך פפטיד הצימוד. מקבילות מרובות (eq) של חומצות אמינו משמשות לתגובה מלאה יותר. ממיסים נוזליים צריכים להיות מומרים לנפח לפי צפיפות. 5 eq מראה כי כמות הקלט של התרכובת המחושבת מוגברת על ידי גורם של חמישה.

2. הכנת שרף

הערה: בחר את כמות השרף הטעון בהתאם לאורך פפטיד הצימוד.

  1. שקלו 302 מ"ג של שרף MBHA מסוג Rink-amide (0.331 מ"מ/גרם טעון) לתוך עמודה (מאגר של 20 מ"ל). הוסף 5-10 מ"ל של DCM או DMF לתוך העמודה כדי לנפח את השרף תחת N2 מבעבע במשך 30 דקות.
  2. לאחר מכן, סגור את מתג N2 ולאחר מכן הפעל את מתג היניקה של משאבת הוואקום כדי להסיר את הממס. לאחר מכן, לשטוף את שרפים ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו DMF (5-10 מ"ל) 5x.

3. הגנת Fmoc מסוף N

הערה: הגנה על ידי מורפולין דורשת 30 דקות, והגנה על ידי פיפרידין אורכת 5 דקות.

  1. הכן את תמיסת ההגנה N-terminal 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc): הכן נפח מספיק (500 מ"ל) של 20% (v/v) פיפרידין או 50% (v/v) מורפולין ב-DMF במיכל זכוכית להגנה על קבוצת Fmoc.
  2. הוסף 10 מ"ל של תמיסת deprotection לעמודה, בועה N2 לתוך הפתרון במשך 30 דקות או 5 דקות 2x, ולחזור על הליכי deprotection 2x.
  3. מסננים את התמיסה על ידי משאבת ואקום ושוטפים את השרף ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) 5x.
  4. זהה את השרף כתמיסת צבע צהוב כהה על ידי 5% ninhydrin (בדיקת קייזר) לאחר כל deprotection כדי לאשר את היעדרה של קבוצת Fmoc לפני שלב הצימוד. בפירוט, הוסף 1 מ"ל של DMF לכמות קטנה של שרף והוסף 200 μL של 5% ninhydrin לצינור זכוכית מחומם ב 130 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כדי להעריך את השינויים בצבע שרף.
  5. מסננים את התמיסה על ידי משאבת ואקום ושוטפים את השרף ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) 5x.

4. צימוד הפפטיד הליניארי (איור 2)

הערה: כאשר רצפי הפפטידים הסינתטיים מכילים שתי יחידות חוזרות או יותר, הליך הצימוד יכול להתבצע ישירות על ידי בחירת סוג חומצת האמינו, כגון Fmoc-AA-OH או Fmoc-AAA-OH, וכן הלאה. כמה חומצות אמינו מיוחדות עם מכשול סטרי ופפטידים עם רצפי חומצות אמינו ארוכים יותר נדרשים כדי להאריך כראוי את זמן התגובה לצימוד.

  1. עבור שלב צימוד יחיד, קח את הצימוד של שאריות Cys כדוגמה (לסנתז 300 מ"ג קשקשים שרף). הכינו תמיסת תערובת הכוללת Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 מ"ג) ו-HATU (5 eq, 206 מ"ג) או Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 מ"ג) ו-HOBT (5 eq, 106 מ"ג) בצינור פוליפרופילן והמיסו ב-3 מ"ל של DMF.
  2. הוסף 173 μL של DIPEA (10 eq) או 154 μL של DIC (10 eq) לתמיסה של Cys כדי להפעיל את חומצת האמינו. נותנים לתערובת לפעול מראש למשך דקה. מוסיפים את התערובת לעמודה עם שרף, ומבעבעים אותה עם N 2 במשך2 שעות.
    הערה: יש לתקנן את זמן התגובה הספציפי הנדרש כדי לזהות 5% נינידרין.
  3. לאחר הצימוד, יש להוסיף 1 מ"ל של DMF לכמות קטנה של שרף ולהוסיף 200 μL של 5% ninhydrin לצינור זכוכית מחומם ב 130 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. שימו לב לשינוי השרף לחסר צבע כדי לאשר את היעדרה של קבוצת אמינו חופשית לפני שלב ההגנה.
  4. מסננים את התמיסה באמצעות משאבת ואקום ושוטפים את השרף ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) 5x.
  5. הוסף 10 מ"ל של תמיסת deprotection לעמודה, בועה עם N2 במשך 30 דקות או 5 דקות 2x, להוסיף תמיסה טרייה, ולחזור על הליכי deprotection 2x.
  6. חזור על השלבים הבאים: הגנה על קבוצת Fmoc; גילוי הגנה על שרף; שטיפת שרף; צימוד חומצת האמינו; זיהוי תגובת הצימוד. חזור על שלב הצימוד עד שכל הפפטידים מסונתזים.
    הערה: השתמש במבחן קייזר כדי לפקח אם כל שלב של הגנה הושלם או אם כל שלב של צימוד חומצות האמינו הוא יסודי. לחלופין, ניתן לבקע כמות קטנה של פפטיד מהשרף ולבדוק על ידי LC-MS לצימוד מוצלח.

5. ביסלקילציה בין מט לסיס (איור 3)

  1. בנה פפטיד ליניארי עם Met ו- Cys על ידי חזרה על שלבים 4.1-4.6. הוסף 10 מ"ל של מתנול נטול מים לעמודה עם שרף לייבוש וייבוש עם N2 לשימוש הבא (חזור על 2x) לאחר צימוד פפטיד ליניארי.
  2. שוקלים 100 מ"ג של שרף המתקבל בשלב הקודם לתוך עמודה (20 מ"ל מאגר) ולשטוף את השרף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) לפני שלב הצימוד.
  3. הכן פתרון להסרת קבוצת ההגנה Cys trt(trityl). הכינו נפח מספיק (100 מ"ל) של תערובת TFA/TIS/DCM (3:5:92) במיכל זכוכית להסרת קבוצת המגן.
  4. הוסף 5-10 מ"ל מהפתרון של TFA/TIS/DCM (3:5:92) לעמודה כדי להסיר את קבוצת ההגנה למשך 10 דקות. חזרו על הפעולה שש פעמים עם N2 מבעבע עד שהצבע הצהוב ייעלם לחלוטין.
  5. מסננים את התמיסה על ידי משאבת ואקום ושוטפים את השרף ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) 5x.
  6. הכן פתרון לתגובה עם Cys לא מוגן. הכן נפח מספיק (50 מ"ל) של תמיסת תערובת (DMF) כולל מקשר די-הלוגני (2 eq) ו- DIPEA (4 eq) לתגובה עם Cys לא מוגן.
  7. הוסף 5-10 מ"ל של תמיסת התגובה לעמודה כדי להגיב עם Cys מוגן לפחות 3 שעות עם N2 מבעבע. יש לייבש עם מתנול נטול מים ולייבש עם N2 לשימוש הבא.
  8. מסננים את התמיסה על ידי משאבת ואקום ושוטפים את השרף ברצף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) 5x.
  9. הכינו תמיסה למחזוריות פפטידים: הכינו נפח מספיק (20 מ"ל) של תערובת TFA (TFA:TIS:H 2 O = 95:2.5:2.5) במיכל זכוכית במכסה האדים למחזוריות פפטידים.
  10. מוסיפים 5-10 מ"ל מתמיסת תערובת TFA לצינור הפוליפרופילן ומבקעים את השרף מתחת לקוקטייל TFA למשך 3 שעות.
    זהירות: TFA הוא מאוד קורוזיבי ומרגיז; תהליך המחשוף הפפטידי צריך להתבצע במכסה אדים.
  11. בצע את שלבים 7.1-7.5 כדי לקבל תמיסת פפטיד ליניארית על-ידי טיהור פאזה נוזלית בפאזה הפוכה (HPLC). יש להקפיא-לייבש את התמיסה לשימוש הבא.

6. מחזוריות מלח פרופרגיל סולפוניום (איור 4)

  1. בנה פפטיד ליניארי עם Met ו- Cys על ידי חזרה על שלבים 4.1-4.6. מוסיפים 10 מ"ל של מתנול נטול מים לעמודה עם השרף לייבוש וייבוש עם N2 לשימוש הבא (חוזרים פעמיים) לאחר צימוד פפטיד ליניארי.
  2. שוקלים 100 מ"ג של שרף המתקבל בשלב הקודם לתוך עמודה (20 מ"ל מאגר) ולשטוף את השרף עם DCM (5-10 מ"ל) ו- DMF (5-10 מ"ל) לפני שלב הצימוד.
  3. בצע את שלבים 7.1-7.5 כדי להשיג תמיסת פפטיד ליניארית על-ידי HPLC, וייבוש הדגימה בהקפאה, כאמור, לשימוש הבא.
  4. הכינו תמיסה מימית של 1% HCOOH (בנפח) ו-1.0 mM פרופרגיל ברומיד (5 eq) והוסיפו לתמיסת הפפטיד של Met (0.2 mM, 1 eq; 0.2 mL של MeCN/H2O [1:1, v/v]).
  5. לאחר מכן, נערו את תגובת הצימוד של Met ופרופרגיל ברומיד בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות.
  6. לאחר התגובה, להמיס את המוצר בצינור פוליפרופילן באצטוניטריל ולסנן אותו דרך קרום 0.22 μmfilter. לאחר מכן, טהרו את התמיסה על ידי HPLC בפאזה הפוכה באופן מיידי וייבשו אותה בהקפאה לאבקה לשימוש הבא.
  7. בשלב האחרון, הוסף את הפפטיד עם פרופרגיל ברומיד לצינור פוליפרופילן, שמור על pH תמיסת התגובה ב 8.0 על ידי הוספת (NH4)2CO3 פתרון, ולנער את תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. שלב זה משיג את הפפטיד המחזורי של מלח פרופרגיל סולפוניום.
  8. לאסוף את תערובת התגובה האחרונה: להמיס אותו בצינור פוליפרופילן ב acetonitrile ולסנן אותו דרך קרום מסנן 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, טהרו את התמיסה על ידי HPLC בפאזה הפוכה באופן מיידי וייבשו אותה בהקפאה לאבקה לשימוש הבא.

7. טיהור פפטידים מחזוריים

  1. בנה מצעים פפטידיים ליניאריים על שרף MBHA Rink-amide על ידי חזרה על שלבים 4.1-4.6. מוסיפים 10 מ"ל של מתנול נטול מים לעמודה עם שרף לייבוש וייבוש עם N2 לשימוש הבא (חוזרים פעמיים) לאחר צימוד פפטידי ליניארי.
  2. הכינו נפח מספיק של קוקטייל מחשוף (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) במכסה האדים. מוסיפים 1-5 מ"ל של תמיסת תערובת TFA לצינור הפוליפרופילן ומבקעים את השרף מתחת לקוקטייל TFA למשך 3 שעות.
  3. לאחר מכן, ברצף לייבש את השרף תחת אדים של N2 בעמודה. לחלופין, השתמש בהתקן מסנן כדי לסנן את השרף ולאסוף את תמיסת הפפטיד. לאחר מכן, הוסיפו 20 מ"ל של אתר לתמיסת הפפטידים כדי לזרז את הפפטיד, צנטריפוגה בגודל 3,500 x גרם למשך 5 דקות, וחזרו על הפעולה פעמיים. לאסוף את משקע פפטיד גולמי ולייבש אותו תחת זרם של N2 לשלב הבא.
  4. ממיסים 200 מ"ג של פפטיד גולמי בצינור פוליפרופילן ב-4 מ"ל של תמיסת מים אצטוניטריל ומסננים אותו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. העבר את הפפטיד לתוך בקבוקון HPLC להוסיף. מקם את התוספת לתוך הדגימה האוטומטית של מערכת HPLC חצי-הכנה לפאזה הפוכה המצוידת ב- C18 5 מיקרומטר, עמוד 4.6 מ"מ x 250 מ"מ ולולאת הזרקה של 1 מ"ל.
  5. לטהר ולבודד את הפפטיד באמצעות תוכנית הדרגתית של 5%-95% אצטוניטריל במים עם 0.1% TFA במשך 30 דקות תוך ניטור ספקטרום HPLC באמצעות UV ב-254 ננומטר. אשרו את המשקל המולקולרי של הפפטיד על ידי LC-MS, אספו את התמיסה של הפפטיד וייבשו אותה בהקפאה לאבקה לשימוש הבא.

תוצאות

כל הפפטידים הליניאריים סונתזו על שרף MBHA של Rink-amide על ידי סינתזה ידנית סטנדרטית של Fmoc בפאזה מוצקה. מודל הקספפטיד מחזורי (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) נבנה כמתואר באיור 5A. יש לציין כי מרכז כיראלי חדש על קשירה נוצר על ידי אלקילציה של Met, כאשר שני האפימרים של פפטיד מחזורי (Ia, Ib) אושרו על ידי ...

Discussion

הגישה הסינתטית המתוארת במאמר זה מספקת שיטה לסינתזה של פפטידים מחזוריים באמצעות Cys ו-Met ברצף הפפטידים, שבו הפפטידים הליניאריים הבסיסיים בנויים על ידי טכניקות נפוצות של סינתזת פפטידים בפאזה מוצקה. לצורך ביסלקילציה של פפטידים מחזוריים בין Cys ל-Met, ניתן לחלק את כל המסלול הסינתטי לשלושה תהליכים...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מכירים בתמיכה כספית מתוכנית המו"פ הלאומית של סין (2021YFC2103900); מענקי הקרן למדעי הטבע של סין (21778009, ו-21977010); הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2022A1515010996 ו- 2020A1515010521): ועדת החדשנות במדע וטכנולוגיה של שנזן, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455, ו- JCYJ20200109140406047); ומענק מכון שנזן-הונג קונג למדעי המוח-שנזן למוסדות מחקר בסיסיים (2019SHIBS0004). המחברים מכירים בתמיכת כתבי העת של מדעי הכימיה , החברה המלכותית לכימיה לעיון 30 וכתב העת לכימיה אורגנית, האגודה האמריקאית לכימיה, לעיון 31.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,3-bis(bromomethyl)-benzenEnergyD0215
1,3-Dimethylbarbituric acidEnergyA46873
1H NMR and HSQCBruker AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrateEnergyE020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)EnergyA1797
2-mercaptopyridineEnergyY31130
6-Aminocaproic acidEnergyA010678
Acetic anhydrideEnergyA01021454
AcetonitrileAldrich9758
Ammonium carbonateEnergy12980
Dichloromethane (DCM)EnergyW330229
Digital Heating Cooling Drybath Thermo Scientific88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA)EnergyW320014
Dimethyl formamide (DMF)EnergyB020051
DithiothreitolEnergyA10027
Electrospray Ionization MassSHIMADZU2020 LC-MS2020
Fmoc-Ala-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30201
Fmoc-Cys(Trt)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30501
Fmoc-Gln(Trt)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30701
Fmoc-His(Boc)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR30902
Fmoc-Ile-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31001
Fmoc-Lys(Boc)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31201
Fmoc-Met-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31301
Fmoc-Pro-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31501
Fmoc-Ser(tBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31601
Fmoc-Thr(tBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31701
Fmoc-Trp(Boc)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OHNanjing Peptide Biotech LtdR31901
Fmoc-Val-OHNanjing Peptide Biotech LtdR32001
Formic acidEnergyW810042
High Performance Liquid
Chromatography		SHIMADZULC-2030
MethanolAldrich9758
MorpholineAldrichM109062
N,N'-DiisopropylcarbodiimideEnergyB010023
Ninhydrin ReagentEnergyN7285
Propargyl bromideEnergyW320293
Rink Amide MBHA resinNanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates Thermo Scientific60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladiumEnergyT1350
Three-way stopcocksBio-Rad7328107
TriethylamineEnergyB010737
Trifluoroacetic acid (TFA)J&K101398
Triisopropylsilane (TIS)EnergyT1533

References

  1. Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality. Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).
  2. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  3. Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. Trends in peptide drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).
  4. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  5. Victoria, G. G., Reddy, S. R. Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care. New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).
  6. Kim, J. I., et al. Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).
  7. Waddington, M. A., et al. An organometallic strategy for cysteine borylation. Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).
  8. Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).
  9. Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  10. Li, B., et al. Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde. Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).
  11. Blaum, B. S., et al. Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).
  12. Petitdemange, R., et al. Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation. Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).
  13. Kadlcik, V., et al. Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide. Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259 (2006).
  14. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).
  15. Reddy, C. B. R., et al. Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous. Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).
  16. Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification. Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).
  17. Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications. Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).
  18. Yu, Y., et al. PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis. ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).
  19. Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors. Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).
  20. Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides. Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).
  21. Zhang, H. Y., Chen, S. Y. Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021). RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).
  22. Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization. Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).
  23. Karthikeyan, K., et al. Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous). Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).
  24. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  25. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  26. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  27. Kramer, J. R., Deming, T. J. Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides. Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).
  28. Shi, X. D., et al. Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation. Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).
  29. Merrifield, B. Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984. Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).
  30. Wang, D. Y., et al. A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity. Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).
  31. Hou, Z. F., et al. A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification. The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).
  32. Reguera, L., Rivera, D. G. Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling. Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved