Construcción de péptidos cíclicos usando un centro de sulfonio en la correa

Resumen

Este protocolo presenta la síntesis de péptidos cíclicos a través de la bisalquilación entre cisteína y metionina y la reacción fácil tiol-yne desencadenada por el centro de propargil sulfonio.

Resumen

En los últimos años, los péptidos cíclicos han atraído cada vez más atención en el campo del descubrimiento de fármacos debido a sus excelentes actividades biológicas y, como consecuencia, ahora se utilizan clínicamente. Por lo tanto, es fundamental buscar estrategias efectivas para sintetizar péptidos cíclicos para promover su aplicación en el campo del descubrimiento de fármacos. Este documento informa un protocolo detallado para la síntesis eficiente de péptidos cíclicos utilizando bisalquilación en resina o intramolecular (intermolecular). Usando este protocolo, los péptidos lineales se sintetizaron aprovechando la síntesis de péptidos en fase sólida con cisteína (Cys) y metionina (Met) acopladas simultáneamente en la resina. Además, los péptidos cíclicos se sintetizaron a través de la bisalquilación entre Met y Cys utilizando una correa sintonizable y un centro de sulfonio en la correa. Toda la ruta sintética se puede dividir en tres procesos principales: la desprotección de Cys en la resina, el acoplamiento del enlazador y la ciclación entre Cys y Met en una solución de escisión de ácido trifluoroacético (TFA). Además, inspirado por la reactividad del centro de sulfonio, se unió un grupo propargil al Met para desencadenar la adición de tiol-yne y formar un péptido cíclico. Después de eso, los péptidos crudos se secaron y disolvieron en acetonitrilo, se separaron y luego se purificaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El peso molecular del péptido cíclico se confirmó mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), y la estabilidad de la combinación de péptidos cíclicos con el reductor se confirmó aún más mediante HPLC. Además, el cambio químico en el péptido cíclico se analizó mediante espectros de resonancia magnética nuclear ¹H (RMN ^1H). En general, este protocolo tenía como objetivo establecer una estrategia efectiva para sintetizar péptidos cíclicos.

Introducción

Las interacciones proteína-proteína (IBP)¹ desempeñan un papel fundamental en la investigación y el desarrollo de fármacos. La construcción de péptidos estabilizados con una conformación fija por medios químicos es uno de los métodos más importantes para desarrollar motivos miméticos de IBP². Hasta la fecha, varios péptidos cíclicos que se dirigen a los IBP han sido desarrollados para uso clínico³. La mayoría de los péptidos están restringidos a una conformación de α hélice para disminuir la entropía conformacional y mejorar la estabilidad metabólica, la afinidad de unión al objetivo y la permeabilidad celular ^4,5. En las últimas 2 décadas, las cadenas laterales de Cys^6,7, lisina ^8,9, triptófano 10, arginina 11 y Met ^12,13 se han insertado en aminoácidos no naturales para fijar el péptido en una conformación cíclica. Tales péptidos cíclicos pueden dirigirse a un espacio químico único o sitios especiales, desencadenando así una reacción covalente para formar la unión covalente proteína-péptido^14,15,16,17. En un informe reciente de Yu et al., una cloroacetamida se ancló en el dominio de los ligandos peptídicos, asegurando una reacción de conjugación covalente con excelente especificidad proteica¹⁸. Además, Walensky et ^al.19 incorporaron ojivas electrofílicas, como la acrilamida y el fluoruro de arilo sulfonilo (_ArSO2F), a péptidos para formar inhibidores covalentes peptídicos estabilizados y mejorar el efecto antitumoral de los inhibidores peptídicos. Por lo tanto, es muy importante introducir un grupo funcional adicional para modificar covalentemente los ligandos proteína-péptido²⁰. Estos grupos no solo reaccionan con proteínas en la cadena lateral, sino que también estabilizan la estructura secundaria del péptido²¹. Sin embargo, la aplicación de proteínas modificadas covalentemente inducidas por ligandos peptídicos es limitada debido a la complicada ruta sintética y a la unión no específica de los grupos químicos^22,23. Por lo tanto, se requieren urgentemente estrategias efectivas para la síntesis de péptidos cíclicos.

Inspirado en las múltiples estrategias de péptidos cíclicos 2,24,25,26^, este protocolo intenta desarrollar un método simple y eficiente para estabilizar péptidos. Además, observamos que el grupo de cadena lateral de un péptido estable podría reaccionar covalentemente con una proteína diana cuando estaba espacialmente cerca de los ligandos peptídicos. La falta de Met modificado químicamente fue cubierta por el grupo de Deming en 2013 mediante el desarrollo de un nuevo método para producir metionina²⁷ peptídica modificada selectivamente. Basándose en estos antecedentes, Shi et al. se centraron en el desarrollo del cierre de anillo de cadenas laterales para formar un centro de sal de sulfonio. Cuando el ligando peptídico se combina con la proteína diana, el grupo de la sal de sulfonio reacciona covalentemente con la proteína Cys espacialmente cercana. En los últimos años, Shi et al. han diseñado un nuevo método para estabilizar el péptido cíclico²⁸. La sal de sulfonio en el péptido cíclico se redujo mediante un agente reductor con un grupo sulfhidrilo que se redujo reversiblemente a Met. Sin embargo, la reacción tuvo una baja eficiencia, lo que fue perjudicial para los estudios de aplicación biológica posteriores. En el estudio actual, se diseñó una reacción de cierre de anillo Met-Cys y bromuro de propargilo-Cys, con una sola sal de sulfonio restante en la cadena lateral del péptido cíclico. La sal de sulfonio actuó como una nueva ojiva que reaccionó covalentemente con la proteína Cys en proximidad espacial. Brevemente, un péptido mutado Cys y Met fue ciclado por alquilación intramolecular, lo que resultó en la generación de un centro de sulfonio en la correa. En este proceso, la formación de un puente de cadena lateral fue crítica para los péptidos cíclicos. En general, este protocolo describe una ciclación peptídica detallada a base de sulfonio que se logra utilizando condiciones de reacción y operaciones simples. El objetivo es desarrollar un método potencial para otras aplicaciones biológicas amplias.

Protocolo

1. Preparación del equipo

PRECAUCIÓN: Morfolina, N,N-dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), TFA, morfolina, piperidina, éter dietílico y metanol son tóxicos, volátiles y corrosivos. Estos reactivos pueden dañar el cuerpo humano a través de la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Para todos los experimentos químicos, use equipo de protección, incluidos guantes desechables, abrigos experimentales y anteojos protectores.

1. Construir todos los sustratos peptídicos en resina Rink-amida 4-metilbenzhidrilamina (MBHA) mediante la síntesis manual estándar de péptidos en fase sólida (SPPS)²⁹, como se muestra en la Figura 1.
2. Utilice cualquiera de las dos opciones para construir péptidos lineales: uno, sintetizar el péptido utilizando agente condensador 2-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N, N',N'-tetrametiluronio hexafluorofosfato (HATU) y un reactivo de DIPEA; o dos, sintetizar utilizando 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) como reactivo de condensación de amida. Seleccione un protocolo apropiado para la síntesis de péptidos de acuerdo con la secuencia del péptido.
3. Para establecer un dispositivo manual de síntesis de péptidos, configure un equipo de extracción de fase sólida al vacío modificado en una campana extractora de humos y conéctelo con una llave de paso de tres vías. A continuación, coloque un cartucho de filtro de polipropileno o un reactor de vidrio en el equipo mientras está conectado al gas nitrógeno (_N2).
   NOTA: Para modificar el equipo de extracción en fase sólida al vacío, retire el tubo de extracción y mantenga el sistema sellado al vacío.
4. Cargue la resina MBHA en las columnas llenas de resina y disuélvala en DMF. Ajuste el interruptor de las llaves de paso de tres vías para el burbujeo de N₂ y luego retire el disolvente en la columna utilizando una bomba de trabajo conectada a un sistema de vacío. Calcule la cantidad de aminoácido o agente condensador requerido utilizando la siguiente fórmula:
   Aminoácido (g) y agente condensador (g) = escala de resina (g) × capacidad de carga de resina (mM/g) × equivalente (5 eq) × peso molecular (g/M)
   NOTA: Elija la cantidad de resina cargada de acuerdo con la longitud del péptido de acoplamiento. Se utilizan múltiples equivalentes (eq) de aminoácidos para reaccionar más plenamente. Los disolventes líquidos deben convertirse en volumen por densidad. El 5 eq muestra que la cantidad de entrada del compuesto calculado se amplifica por un factor de cinco.

2. Preparación de la resina

NOTA: Elija la cantidad de resina cargada de acuerdo con la longitud del péptido de acoplamiento.

1. Pesar 302 mg de resina Rink-amide MBHA (0,331 mM/g cargada) en una columna (depósito de 20 ml). Agregue 5-10 ml de DCM o DMF en la columna para hinchar la resina bajo N₂ burbujeando durante 30 min.
2. A continuación, cierre el interruptor N₂ y luego encienda el interruptor de succión de la bomba de vacío para eliminar el solvente. Luego, lave las resinas secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.

3. Desprotección Fmoc N-terminal

NOTA: La desprotección por morfolina requiere 30 min, y la desprotección por piperidina toma 5 min.

1. Prepare la solución de desprotección N-terminal de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc): prepare un volumen suficiente (500 ml) de piperidina al 20% (v/v) o morfolina al 50% (v/v) en DMF en un recipiente de vidrio para la desprotección del grupo Fmoc.
2. Añadir 10 ml de la solución de desprotección a la columna, burbujear N₂ en la solución durante 30 min o 5 min 2x, y repetir los procedimientos de desprotección 2x.
3. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.
4. Detectar la resina como una solución de color amarillo oscuro con ninhidrina al 5% (prueba de Kaiser) después de cada desprotección para confirmar la ausencia del grupo Fmoc antes del paso de acoplamiento. En detalle, agregue 1 ml de DMF a una pequeña cantidad de resina y agregue 200 μL de ninhidrina al 5% a un tubo de vidrio calentado a 130 ° C durante 3 minutos para evaluar los cambios en el color de la resina.
5. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.

4. Acoplamiento del péptido lineal (Figura 2)

NOTA: Cuando las secuencias de péptidos sintéticos contienen dos o más unidades repetitivas, el procedimiento de acoplamiento se puede llevar a cabo directamente seleccionando el tipo de aminoácido, como Fmoc-AA-OH o Fmoc-AAA-OH, y así sucesivamente. Se requieren algunos aminoácidos especiales con impedimento estérico y péptidos con secuencias de aminoácidos más largas para extender adecuadamente el tiempo de reacción para el acoplamiento.

1. Para un solo paso de acoplamiento, tome como ejemplo el acoplamiento del residuo de Cys (sintetice escamas de resina de 300 mg). Preparar una solución de mezcla que incluya Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) y HATU (5 eq, 206 mg) o Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) y HOBT (5 eq, 106 mg) en un tubo de polipropileno y disolverla en 3 mL de DMF.
2. Añadir 173 μL de DIPEA (10 eq) o 154 μL de DIC (10 eq) a la solución de Cys para activar el aminoácido. Deje que la mezcla se active previamente durante 1 minuto. Añadir la mezcla a la columna con resina, y burbujear con_N2 durante 2 h.
   NOTA: El tiempo de reacción específico requerido debe estandarizarse para detectar ninhidrina al 5%.
3. Después del acoplamiento, agregue 1 ml de DMF a una pequeña cantidad de resina y agregue 200 μL de ninhidrina al 5% a un tubo de vidrio calentado a 130 ° C durante 3 minutos. Observe el cambio de resina a incolora para confirmar la ausencia de un grupo amino libre antes del paso de desprotección.
4. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.
5. Agregue 10 ml de la solución de desprotección a la columna, burbujee con N₂ durante 30 min o 5 min 2x, agregue solución nueva y repita los procedimientos de desprotección 2x.
6. Repita los siguientes pasos: desprotección del grupo Fmoc; detección de desprotección de resina; lavado de la resina; acoplamiento del aminoácido; Detección de la reacción de acoplamiento. Repita el paso de acoplamiento hasta que se sinteticen todos los péptidos.
   NOTA: Use la prueba de Kaiser para controlar si cada paso de la desprotección está completo o si cada paso del acoplamiento de aminoácidos es completo. Alternativamente, una pequeña cantidad de péptido puede ser escindido de la resina y comprobado por LC-MS para un acoplamiento exitoso.

5. Bisalquilación entre Met y Cys (Figura 3)

1. Construya un péptido lineal con Met y Cys repitiendo los pasos 4.1-4.6. Añadir 10 ml de metanol anhidro a la columna con resina para deshidratación y secar con_N2 para el siguiente uso (repetir 2x) después del acoplamiento peptídico lineal.
2. Pesar 100 mg de la resina obtenida en el paso anterior en una columna (depósito de 20 mL) y lavar la resina con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) antes de la etapa de acoplamiento.
3. Prepare una solución para eliminar el grupo de protección Cys trt(trityl). Preparar un volumen suficiente (100 ml) de mezcla TFA/TIS/DCM (3:5:92) en un recipiente de vidrio para eliminar el grupo protectiove.
4. Añadir 5-10 ml de la solución de TFA/TIS/DCM (3:5:92) a la columna para retirar el grupo de protección durante 10 min. Repita seis veces con N₂ burbujeando hasta que el color amarillo desaparezca por completo.
5. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.
6. Prepare una solución para reaccionar con Cys desprotegido. Preparar un volumen suficiente (50 ml) de solución de mezcla (DMF) incluyendo enlazador dihalogenado (2 eq) y DIPEA (4 eq) para reaccionar con Cys desprotegido.
7. Añadir 5-10 ml de la solución de reacción a la columna para reaccionar con Cys desprotegido durante al menos 3 h con burbujeo de_N2 . Deshidratar con metanol anhidro y secar con_N2 para el siguiente uso.
8. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.
9. Prepare una solución para la ciclación peptídica: prepare un volumen suficiente (20 ml) de mezcla de TTAP (TTA: TIS:_{H 2}O = 95: 2.5: 2.5) en un recipiente de vidrio en la campana extractora para la ciclación de péptidos.
10. Añadir 5-10 ml de la solución de mezcla de TFA al tubo de polipropileno y escindir la resina bajo el cóctel de TFA durante 3 h.
    PRECAUCIÓN: El TFA es altamente corrosivo e irritante; El proceso de escisión peptídica debe realizarse en una campana extractora.
11. Realice los pasos 7.1-7.5 para obtener una solución peptídica lineal mediante purificación en fase líquida en fase inversa (HPLC). Liofilizar la solución para el próximo uso.

6. Ciclación de la sal de propargil sulfonio (Figura 4)

1. Construya un péptido lineal con Met y Cys repitiendo los pasos 4.1-4.6. Añadir 10 ml de metanol anhidro a la columna con la resina para deshidratar y secar con_N2 para el siguiente uso (repetir dos veces) después del acoplamiento peptídico lineal.
2. Pesar 100 mg de la resina obtenida en el paso anterior en una columna (depósito de 20 mL) y lavar la resina con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) antes de la etapa de acoplamiento.
3. Realice los pasos 7.1-7.5 para obtener una solución peptídica lineal por HPLC y liofilique la muestra, como se mencionó, para su próximo uso.
4. Preparar una solución acuosa de HCOOH al 1% (en volumen) y bromuro de propargil al 1,0 mM (5 eq) y añadir a la solución peptídica Met (0,2 mM, 1 eq; 0,2 ml de MeCN/_H2O[1:1, v/v]).
5. A continuación, agitar la reacción de acoplamiento de Met y bromuro de propargil a temperatura ambiente durante 12 h.
6. Después de la reacción, disolver el producto en un tubo de polipropileno en acetonitrilo y filtrarlo a través de una membrana de filtro de 0,22 μm. Luego, purifique la solución por HPLC de fase inversa inmediatamente y liofilifíquela en polvo para el próximo uso.
7. En el último paso, añadir el péptido con bromuro de propargil a un tubo de polipropileno, mantener el pH de la solución de reacción a 8,0 añadiendo (NH₄)₂solución de CO₃ y agitar la mezcla de reacción a 37 °C durante 12 h. Este paso obtiene el péptido cíclico de la sal de propargil sulfonio.
8. Recoger la última mezcla de reacción: disolverla en un tubo de polipropileno en acetonitrilo y filtrarla a través de una membrana filtrante de 0,22 μm. Luego, purifique la solución por HPLC de fase inversa inmediatamente y liofilifíquela en polvo para el próximo uso.

7. Purificación de péptidos cíclicos

1. Construya sustratos peptídicos lineales en resina Rink-amide MBHA repitiendo los pasos 4.1-4.6. Añadir 10 ml de metanol anhidro a la columna con resina para deshidratación y secar con_N2 para el siguiente uso (repetir dos veces) después del acoplamiento peptídico lineal.
2. Prepare un volumen suficiente de cóctel de escote (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:_2.5) en la campana extractora. Añadir 1-5 ml de solución de mezcla de TFA al tubo de polipropileno y escindir la resina bajo el cóctel de TFA durante 3 h.
3. A continuación, seque secuencialmente la resina bajo un vapor de_N2 en la columna. Alternativamente, use un dispositivo de filtro para filtrar la resina y recolectar la solución peptídica. Luego, agregue 20 ml de éter a la solución peptídica para precipitar el péptido, centrifugar a 3,500 x g durante 5 minutos y repetir dos veces. Recoja el precipitado de péptido crudo y séquelo bajo una corriente de N₂ para el siguiente paso.
4. Disuelva 200 mg de péptido crudo en un tubo de polipropileno en 4 ml de solución de acetonitrilo-agua y fíjelo a través de un filtro de 0,22 μm. Transfiera el péptido a un inserto de vial de HPLC. Coloque el inserto en el muestreador automático de un sistema HPLC semipreparativo de fase inversa equipado con una columna C18 de 5 μm, 4,6 mm x 250 mm y un bucle de inyección de 1 ml.
5. Purificar y aislar el péptido utilizando un programa de gradiente de 5% -95% de acetonitrilo en agua con 0,1% de TFA durante 30 minutos mientras monitorea los espectros de HPLC usando UV a 254 nm. Confirme el peso molecular del péptido mediante LC-MS, recoja la solución del péptido y liofilifíquela en polvo para el próximo uso.

Resultados

Todos los péptidos lineales se sintetizaron en resina Rink-amide MBHA mediante síntesis manual estándar de fase sólida Fmoc. Se construyó un modelo de hexapéptido cíclico (Ac (ciclo-I)-WMAAAC-NH₂) como se describe en la Figura 5A. En particular, se generó un nuevo centro quiral en la correa por alquilación Met, con los dos epímeros del péptido cíclico (Ia, Ib) confirmados por HPLC de fase inversa. Además, la conversión y la proporción de epímeros se determinaron ut...

Discusión

El enfoque sintético descrito en este documento proporciona un método para sintetizar péptidos cíclicos utilizando Cys y Met en la secuencia peptídica, en la que los péptidos lineales básicos se construyen mediante técnicas comunes de síntesis de péptidos en fase sólida. Para la bisalquilación de péptidos cíclicos entre Cys y Met, toda la ruta sintética se puede dividir en tres procesos principales: la desprotección de Cys en la resina, el acoplamiento del enlazador y la ciclación entre Cys y Met en una ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,3-bis(bromomethyl)-benzen	Energy	D0215
1,3-Dimethylbarbituric acid	Energy	A46873
1H NMR and HSQC	Bruker	AVANCE-III 400
1-Hydroxybenzotriazole hydrate	Energy	E020543
2-(7-azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU)	Energy	A1797
2-mercaptopyridine	Energy	Y31130
6-Aminocaproic acid	Energy	A010678
Acetic anhydride	Energy	A01021454
Acetonitrile	Aldrich	9758
Ammonium carbonate	Energy	12980
Dichloromethane (DCM)	Energy	W330229
Digital Heating Cooling Drybath	Thermo Scientific	88880029
Diisopropylethylamine (DIPEA)	Energy	W320014
Dimethyl formamide (DMF)	Energy	B020051
Dithiothreitol	Energy	A10027
Electrospray Ionization Mass	SHIMADZU2020	LC-MS2020
Fmoc-Ala-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30101
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30201
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30501
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30601
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30701
Fmoc-His(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R30902
Fmoc-Ile-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31001
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31201
Fmoc-Met-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31301
Fmoc-Pro-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31501
Fmoc-Ser(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31601
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31701
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31801
Fmoc-Tyr(tBu)-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R31901
Fmoc-Val-OH	Nanjing Peptide Biotech Ltd	R32001
Formic acid	Energy	W810042
High Performance Liquid Chromatography	SHIMADZU	LC-2030
Methanol	Aldrich	9758
Morpholine	Aldrich	M109062
N,N'-Diisopropylcarbodiimide	Energy	B010023
Ninhydrin Reagent	Energy	N7285
Propargyl bromide	Energy	W320293
Rink Amide MBHA resin	Nanjing Peptide Biotech Ltd.
Solid Phase Extraction (SPE) Sample Collection Plates	Thermo Scientific	60300-403
Tetrakis(triphenylphosphine) palladium	Energy	T1350
Three-way stopcocks	Bio-Rad	7328107
Triethylamine	Energy	B010737
Trifluoroacetic acid (TFA)	J&K	101398
Triisopropylsilane (TIS)	Energy	T1533