Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، تم تطوير نظام ثنائي الطبقة الدهنية المدعوم بشريط نانوي لتوفير غشاء اصطناعي بانحناء محدد يتيح توصيف البروتينات مع القدرة على استشعار الانحناء في المختبر.

Abstract

يلعب انحناء الغشاء أدوارا مهمة في مختلف العمليات الأساسية للخلايا ، مثل هجرة الخلايا وانقسام الخلايا والاتجار بالحويصلات. لا يتم إنشاؤه بشكل سلبي فقط من خلال الأنشطة الخلوية ، ولكن أيضا ينظم بنشاط تفاعلات البروتين ويشارك في العديد من الإشارات داخل الخلايا. وبالتالي ، من المفيد للغاية دراسة دور انحناء الغشاء في تنظيم توزيع وديناميات البروتينات والدهون. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من التقنيات لدراسة العلاقة بين الغشاء المنحني والبروتين في المختبر. بالمقارنة مع التقنيات التقليدية ، توفر الطبقة الثنائية الدهنية المدعومة بالقضيب النانوي (SLB) المطورة حديثا إنتاجية عالية ودقة أفضل في توليد انحناء الغشاء من خلال تشكيل طبقة ثنائية دهنية مستمرة على صفائف منقوشة من القضبان النانوية مع انحناء غشاء محدد مسبقا وتحكم مسطح محلي. يمكن توصيف كل من سيولة الدهون وحساسية البروتين للأغشية المنحنية كميا باستخدام التصوير المجهري الفلوري. هنا ، يتم تقديم إجراء مفصل حول كيفية تشكيل SLB على الأسطح الزجاجية المصنعة التي تحتوي على صفائف نانوية وتوصيف البروتينات الحساسة للانحناء على SLB هذا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تغطية بروتوكولات إعادة استخدام الرقائق النانوية ومعالجة الصور. بالإضافة إلى nanobar-SLB ، فإن هذا البروتوكول قابل للتطبيق بسهولة على جميع أنواع رقائق الزجاج ذات البنية النانوية لدراسات استشعار الانحناء.

Introduction

انحناء الغشاء هو معلمة فيزيائية حرجة للخلية تحدث في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية مثل التشكل وانقسام الخلايا وهجرة الخلايا1. من المعترف به على نطاق واسع الآن أن انحناء الغشاء يتجاوز نتيجة بسيطة للأحداث الخلوية. بدلا من ذلك ، برز كمنظم فعال لتفاعلات البروتين والإشارات داخل الخلايا. على سبيل المثال ، تم العثور على العديد من البروتينات المشاركة في التداخل الخلوي بوساطة الكلثرين ترتبط بشكل تفضيلي بالغشاء المنحني ، مما يؤدي إلى تكوين نقطة ساخنة للداخل الخلوي2. هناك العديد من الأسباب المختلفة لتشوه الغشاء مثل سحب الغشاء بواسطة قوى الهيكل الخلوي ، ووجود عدم تناسق الدهون مع مجموعات الرأس ذات الأحجام المختلفة ، ووجود بروتينات عبر الغشاء ذات شكل مخروطي ، وتراكم البروتينات المكونة للغشاء مثل بروتينات مجال BAR (سميت على اسم بروتينات Bin و amphiphysin و Rvs) ، وإدخال مجال الحلزونات البرمائية في الغشاء1 . ومن المثير للاهتمام أن هذه البروتينات والدهون لا تشوه الغشاء فحسب ، بل يمكنها أيضا استشعار انحناء الغشاء وإظهار تراكم تفضيلي1. لذلك ، من الأهمية بمكان دراسة ما إذا كانت الأغشية ذات الانحناءات المختلفة تغير توزيع وديناميكيات البروتينات والدهون المرتبطة بها وكيف تغير التأثيرات المحتملة على العمليات داخل الخلايا ذات الصلة.

تم تطوير العديد من التقنيات لتحليل التفاعل بين الغشاء المنحني والبروتينات في كل من الخلايا الحية وأنظمة المختبر. يوفر نظام الخلية الحية بيئة خلية حقيقية مع تنوع غني للدهون وتنظيم إشارات البروتين الديناميكي2،3،4،5،6،7. ومع ذلك ، يصعب دراسة مثل هذا النظام المتطور بسبب عدم اليقين والتقلبات في البيئة داخل الخلايا. ومن ثم ، فإن المقايسات في المختبر باستخدام غشاء اصطناعي يتكون من أنواع الدهون المعروفة والبروتينات النقية أصبحت أنظمة إعادة تكوين قوية لتوصيف العلاقة بين البروتينات والأغشية المنحنية. تقليديا ، يتم إنشاء الجسيمات الشحمية بأقطار مختلفة عن طريق البثق للكشف عن البروتينات الحساسة للانحناء إما عن طريق مقايسة الترسيب المشترك باستخدام قوة الطرد المركزي أو مقايسة التعويم المشترك مع تدرج الكثافة لتجنب تراكم البروتين 8,9. ومع ذلك ، فإن انحناء الجسيمات الشحمية المبثوقة محدود بحجم المسام المتاح لمرشح الغشاء المستخدم في الطارد10. وقد ثبت أن مقايسة انحناء الجسيمات الشحمية المفردة (SLiC) تتغلب على هذا القيد ، حيث يتم تمييز الجسيمات الشحمية بأقطار مختلفة بالتألق وتثبيتها على السطح بحيث يمكن تمييز الانحناء بكثافة الفلورسنت11. ومع ذلك ، فقد لوحظ تباين قوي في تكوين الدهون في الحويصلات الصغيرة ، مما يؤثر على دقة قياس الانحناء12. توفر تجارب سحب الحبل قياسا أكثر دقة للانحناء على الحبل العابر المسحوب من الحويصلات العملاقة أحادية الصفيحة (GUVs) باستخدام ملقط بصري ، حيث يمكن التحكم في الانحناء جيدا بواسطة توتر الغشاء الناتج13,14. هذه الطريقة مناسبة لدراسة بروتينات استشعار الانحناء الإيجابي أو السلبي ، ولكنها مقيدة بإنتاجية توليد الأنبوب10. يوفر فحص الأنابيب الغشائية المدعومة (SMrT) توليدا متزامنا لأنابيب غشائية متعددة يتم بثقها من نفس خزان الدهون بواسطة تدفقات الموائع الدقيقة. ومع ذلك ، يختلف انحناء الغشاء جوهريا على طول الأنبوب النانوي ، مما يضر بدقة قياس الانحناء القائم على شدة التألق15,16. وبالمقارنة ، فإن استخدام حويصلات صغيرة أحادية الصفيحة (سيارات الدفع الرباعي ، قطرها <100 نانومتر17) لتشكيل طبقة ثنائية دهنية مدعومة (SLB) على الأسطح التي تحتوي على طبوغرافيات مصممة ولدت غشاء أحادي الطبقة مع انحناءات محددة مسبقا بواسطة التصنيع النانوي أو المواد النانوية بدقة عالية18،19،20.

هنا ، نقدم بروتوكولا لتشكيل SLB على أسطح رقاقة نانوية مصنعة مع صفائف نانوية وكيف يمكن استخدامه لاستكشاف حساسية انحناء البروتينات في المختبر. كما هو موضح في الشكل 1 ، هناك ستة مكونات أساسية للفحص: أ) تنظيف وتجميع الرقاقة بغرفة الموائع الدقيقة ؛ ب) تحضير سيارات الدفع الرباعي ذات التركيب الدهني المحدد ؛ ج) تشكيل SLB على رقاقة نانوية وملزمة ببروتينات حساسة للانحناء ؛ د) تصوير وتوصيف SLB والبروتينات الحساسة للانحناء تحت المجهر الفلوري ؛ ه) تنظيف الرقاقة لإعادة استخدامها ؛ و) معالجة الصور للتحليل الكمي لقدرة استشعار انحناء البروتين. يتم وصف البروتوكول التفصيلي خطوة بخطوة أدناه.

Protocol

1. تنظيف رقاقة النانو

  1. ضع الشريحة النانوية في دورق سعة 10 مل بحيث يكون الجانب المنقوش متجها لأعلى.
    ملاحظة: تم تصنيع رقاقة الكوارتز النانوية هذه عبر الطباعة الحجرية لشعاع الإلكترون كما هو موضح من قبل21. يمكن تصميم هندسة وترتيب البنية النانوية على الرقاقة حسب الطلب. يبلغ طول أحجام القضبان النانوية المتدرجة المستخدمة هنا 2000 نانومتر ، وارتفاعها 600 نانومتر ، وعرضها من 100 إلى 1000 نانومتر (مجموعة خطوات 100 نانومتر).
  2. أضف بعناية 1 مل من 98٪ حمض الكبريتيك إلى الدورق ، وتأكد من أن الحمض يغطي الجزء الأمامي والخلفي من الرقاقة بالكامل.
    ملاحظة: 98٪ حمض الكبريتيك شديد التآكل ويمكن أن يسبب تدميرا سريعا للأنسجة وحروقا كيميائية خطيرة عند ملامسته للجلد أو العينين. استخدمه في غطاء الدخان مع الحماية المناسبة.
  3. قم بتدوير الكأس الزجاجية ببطء وأضف 200 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين قطرة قطرة حتى تصبح الكأس الزجاجية بأكملها ساخنة. تأكد من خلط حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين جيدا لتشكيل محلول سمكة البيرانا لإزالة الجزيئات العضوية من الرقاقة النانوية17. هناك تقنيات بديلة لتوليد SLB على الأسطح النظيفة المحبة للماء ، مثل الأشعة فوق البنفسجية والتعرض للأوزون كما هو موضح سابقا23.
    ملاحظة: التفاعل طارد للحرارة للغاية ويمكن أن يتسبب في غليان المحلول ، لذا أضف بيروكسيد الهيدروجين إلى حمض الكبريتيك قطرة قطرة واستمر في الدوران.
  4. ضع الدورق في وعاء زجاجي ثانوي واحتفظ بالشريحة النانوية مغمورة في محلول سمكة البيرانا طوال الليل لتنظيف الشوائب جيدا.
    ملاحظة: ضع الدورق في غطاء الدخان بدون أي غطاء في حالة ما إذا كان التفاعل يمكن أن يولد الغاز.
  5. أخرج الكأس الزجاجية والصق محلول سمكة البيرانا بعناية في وعاء نفايات حمضية.
  6. حمل 5 مل من الماء منزوع الأيونات في الكأس الزجاجية لتخفيف الحمض المتبقي وتخلص منه في فضلات الحمض. كرر هذه الخطوة خمس مرات واستخدم 5 M NaOH لتحييد النفايات الحمضية.
  7. أمسك الرقاقة بالملاقط واغسلها بتيار مستمر من الماء منزوع الأيونات لإزالة الحمض المتبقي جيدا. جفف الرقاقة بغاز النيتروجين بنسبة 99.9٪ لتشكيل SLB22.

2. توليد الحويصلات الصغيرة أحادية الصفيحة (سيارات الدفع الرباعي)

  1. أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى قارورة كهرمانية.
    ملاحظة: الكلوروفورم سائل شديد التقلب وعديم اللون ، ويمكن أن يكون ساما إذا تم استنشاقه أو ابتلاعه. استخدمه في غطاء الدخان مع ارتداء القناع والقفازات.
  2. حل 500 ميكروغرام من خليط الدهون في الكلوروفورم. تكوين خليط الدهون المستخدم هنا هو 89.5٪ مول٪ من فوسفاتيديل كولين البيض (PC) ، و 10٪ مول٪ من فوسفاتيديل سيرين في الدماغ (PS) ، و 0.5٪ من تكساس ريد 1،2-ديهكساديكانويل-sn-glycero-3-فوسفوإيثانولامين ، ملح ثلاثي إيثيل الأمونيوم (تكساس ريد DHPE).
  3. جفف خليط الدهون في القارورة بنسبة 99.9٪ من غاز النيتروجين حتى يتطاير الكلوروفورم ويجف خليط الدهون.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان. تجنب تناثر السوائل عند التجفيف.
  4. ضع خليط الدهون الموجود في قارورة العنبر بدون غطاء في مجفف الفراغ المغطى بورق الألمنيوم. ثم قم بتجفيف العينة بالمكنسة الكهربائية بمضخة لمدة 3 ساعات لتطاير الكلوروفورم تماما.
  5. أضف 250 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى القارورة. دوامة الحل حتى يصبح متجانسا.
    ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت PBS من 150 mM NaCl ، بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول الأحمر ؛ يتم ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.2 لصنع طبقة الدهون PC و PS.
  6. سونيك خليط الدهون لمدة 30 دقيقة على تردد 50 كيلو هرتز في سونيكاتور الحمام. ثم انقل خليط الدهون إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وأغلقه بالبارافيلم.
  7. تجمد خليط الدهون في النيتروجين السائل لمدة 20 ثانية ثم تذوب عند 42 درجة مئوية لمدة دقيقتين في حمام مائي. كرر دورات التجميد والذوبان 30 مرة. بعد ذلك ، يبدو خليط الدهون كسائل صاف.
    تنبيه: النيتروجين السائل لديه نقطة غليان حوالي -195.8 درجة مئوية. يمكن أن يسبب قضمة الصقيع أو الحروق المبردة. استخدمه في الأماكن غير الضيقة مع ارتداء قفازات عازلة للحرارة.
  8. شطف اثنين من المحاقن الزجاجية محكمة الغلق الغاز وموصل الطارد الصغير مع الإيثانول والكلوروفورم والميثانول على التوالي. كرر تسلسل الشطف خمس مرات لتنظيف الجهاز مسبقا. اتركها في غطاء الدخان حتى يتطاير المذيب العضوي تماما.
  9. قم بتجميع جهاز الطارد الصغير وتمرير 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS عبر الموصل لتبليل الجهاز مسبقا ، ثم تخلص من المخزن المؤقت من حقنة أخرى. هذه الخطوة تزيل الشوائب وتسهل البثق.
  10. قم بتجميع جهاز الطارد الصغير بغشاء مرشح بولي كربونات بحجم 100 نانومتر.
    ملاحظة: يحدد حجم المسام لغشاء المرشح قطر الجسيمات الشحمية.
  11. خذ 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS بإحدى المحاقن وادفعه برفق عبر المرشح لملء المحقنة الفارغة الثانية في الطرف الآخر. كرر البثق ذهابا وإيابا ثلاث مرات للتحقق من تسرب الجهاز وتجاهل المخزن المؤقت من المحقنة الثانية.
  12. مرر خليط الدهون عبر الطارد الصغير لاستبدال المخزن المؤقت PBS. ثم قذف ذهابا وإيابا 20 مرة لتشكيل سيارات الدفع الرباعي. يمكن الاحتفاظ بالطابع متعدد الصفائح للحويصلات مع عدد غير كاف من أوقات البثق ، مما سيؤثر على تكوين SLB23.
  13. اجمع سيارات الدفع الرباعي من المحقنة الثانية لتقليل التلوث بجزيئات أكبر ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
    ملاحظة: قم بإزالة المحقنة مباشرة من الموصل في حالة انقطاع المحقنة.
  14. لف الأنبوب بورق الألمنيوم لمنع تبييض الدهون الموسومة بالفلورسنت وتخزينها في 4 درجات مئوية. عادة ، يمكن تخزين سيارات الدفع الرباعي لمدة تصل إلى 7 أيام.

3. تشكيل SLB على رقاقة نانوية

  1. أخرج الشريحة النانوية النظيفة من الماء منزوع الأيونات بعناية باستخدام ملقط وجففها بغاز النيتروجين بنسبة 99.9٪.
  2. إجراء التنظيف السطحي للرقاقة النانوية مع معالجة بلازما الهواء لمدة 1 ساعة.
  3. قم بتجميع الرقاقة النانوية في غرفة polydimethylsiloxane (PDMS) ، والتي تتكون من قطعتين من PDMS - PDMS الأوسط و PDMS العلوي (الشكل 1 أ). PDMS الأوسط رقيق (~ 0.5 مم) مع فتحة بيضاوية كبيرة في الوسط لضمان التعرض الكافي لنمط nanobar. الجزء العلوي من PDMS سميك (~ 4.0 مم) مع فتحتين صغيرتين داخل الفتحة البيضاوية الكبيرة كمدخل ومخرج لمعالجة السوائل.
    1. ضع الشريحة على سطح نظيف بحيث يكون النمط متجها لأعلى.
    2. قم بتغطية PDMS الأوسط برفق بالشريحة ، وتأكد من تعرض النمط بالكامل للمنطقة المركزية للفتحة الكبيرة ذات الشكل البيضاوي في PDMS الأوسط.
    3. قم بتغطية PDMS العلوي ب PDMS الأوسط واحتفظ بفتحتيه الصغيرتين داخل منطقة الفتحة البيضاوية الكبيرة لنظام PDMS الأوسط. ثم يتم تجميع غرفة PDMS.
      ملاحظة: PDMS هو البوليمر العضوي القائم على السيليكون الأكثر استخداما. إنه متوافق حيويا وشفافا وقابلا للتشوه ليتم تصميمه كشكل مخصص لتجميع الرقائق والتصوير تحت المجهر. والأهم من ذلك ، يمكن أن تكون عالقة تساهميا بطبقة PDMS أخرى أو زجاج بإحكام بعد معالجة البلازما ، مما يجعلها مناسبة كغرفة لإعداد SLB. تضمن هذه الخطوة أن كل طبقة من PDMS مثبتة بإحكام لتجنب الفجوات والتسرب.
  4. قم بتحميل سيارات الدفع الرباعي في غرفة PDMS من أحد الفتحتين الصغيرتين في الجزء العلوي من PDMS باستخدام ماصة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتشكيل SLB.
  5. قم بماصة برفق المخزن المؤقت PBS في غرفة PDMS من جانب واحد من الفتحة الصغيرة وقم بإزالة النفايات باستخدام برعم قطني من الفتحة الأخرى لغسل سيارات الدفع الرباعي غير المقيدة. ثم احصل على SLB المتشكل على الرقاقة النانوية (يتم اختبار جودة SLB عن طريق استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) كما هو موضح في الخطوة 4.4 ومناقشته في قسم النتائج التمثيلية).
    ملاحظة: عند سحب المخزن المؤقت PBS في الغرفة ، يجب أن يكون طرف الماصة ممتلئا بالمخزن المؤقت وملامسا لسطح السائل لتجنب حقن أي فقاعات.

4. تصوير SLB وربط بروتين استشعار الانحناء على الرقاقة النانوية

ملاحظة: سيعتمد هذا القسم على نظام المجهر المتاح للتجربة. هنا ، سيتم وصف إرشادات شاملة حول كيفية إجراء التصوير. يمكن تغيير الإعدادات التفصيلية بين إعدادات المجهر المختلفة.

  1. قم بإعداد الفحص المجهري متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر باستخدام هدف زيت 100x (N.A.1.4). افتح برنامج ZEN لتحديد قوة ليزر الإثارة التي يمكن أن تثير مضان الدهون والبروتين. اختر وضع الاستحواذ > الإعداد الذكي > تكساس الأحمر DHPE / EGFP.
  2. اضبط التركيز باستخدام مقبض التركيز لتحديد موقع القضبان النانوية على الشريحة حتى تصبح حواف القضيب النانوي حادة أسفل قناة الدهون.
  3. قم بتعيين معلمات المسح على النحو التالي للحصول على صورة تحكم لقناة الدهون قبل إضافة البروتين: حجم الإطار = 512 بكسل × 512 بكسل (512 بكسل × 512 بكسل ، حجم بكسل 124 نانومتر) ، بت لكل بكسل = 16 (عمق 16 بت ) ، سرعة المسح الضوئي = 5 ، والمتوسط = 4 (وضع المتوسط أربع مرات / خط).
  4. قم بإجراء فحص FRAP عن طريق تبييض طبقة الدهون المزدوجة الموسومة بالفلورسنت على منطقة نانوية مفردة عشوائية.
    1. حدد خانتي الاختيار مناطق التجربة والتبييض . ارسم مساحة دائرية بقطر 5 ميكرومتر والتي يمكن أن تشمل الشريط النانوي بأكمله في المركز (حجم القضيب النانوي 2 ميكرومتر) وأضفه إلى مناطق التجربة. إدخال معلمات التصوير بفاصل زمني كمثال على النحو التالي: اختر سرعة المسح الضوئي = 9 والمتوسط = 1. اختر السلاسل الزمنية > المدة = 100 دورة والفاصل الزمني = 2 ثانية. أدخل معلمات التبييض كمثال التالي: حدد خانة الاختيار البدء بعد # الصور واختر ثلاث صور.
    2. حدد مربعات الاختيار بالليزر التي تقوم بإجراء FRAP وقم بتغيير الطاقة إلى 100.0٪. انقر على بدء التجربة لتجربة FRAP.
      ملاحظة: FRAP هي طريقة شائعة لتوصيف حركة الجزيئات الخلوية. إذا كان SLB يتمتع بسيولة جيدة ، فإن التألق في المنطقة المبيضة سوف يتعافى تدريجيا مع انتشار الفلوروفورات المبيضة وانتشار الفلوروفورات غير المبيضة من مناطق أخرى.
  5. قم بتحميل محلول البروتين في غرفة PDMS واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح بربط البروتين على SLB.
    ملاحظة: البروتينات المستخدمة في الشكل 2G ، H لتوضيح تكوين الدهون تسهل ارتباط البروتين على SLBs المنحنية النانوية هي 74 μM GFP و 79 μM GFP-His. هذان البروتينان عبارة عن بروتينات مضان خضراء بدون أو مع His-tag. البروتينات المستخدمة لدراسة استشعار الانحناء في الشكل 4 والشكل 5 هي 16 ميكرومتر F-BAR و 16 ميكرومتر IDR FBP17 و 16 ميكرومتر FBAR + IDRFBP17. هذه البروتينات الثلاثة هي المجالات من FBP17 ، وهو بروتين BAR نموذجي يفترض بشكل حدسي أنه مولدات انحناء وأجهزة استشعار. كل حجم البروتين هو 20 ميكرولتر.
  6. أعد تركيز الأشرطة النانوية وكرر الخطوة 4.3 لالتقاط صور لكل من قنوات الدهون والبروتين للكشف عن استشعار انحناء البروتين.
  7. كرر الخطوة 4.4 لإجراء اختبار FRAP على كل من قنوات الدهون والبروتين وإجراء تصوير الفاصل الزمني لتوصيف حركة بروتين استشعار الانحناء.

5. إعادة استخدام رقاقة النانو

  1. احصل على الرقاقة النانوية بملاقط وافصلها بعناية عن غرفة PDMS في دورق سعة 50 مل مملوء بالماء منزوع الأيونات.
    ملاحظة: هذه خطوة حاسمة. امنع الملقط من لمس البنية النانوية ، ولا تجبر الشريحة على الانفصال لتجنب التشققات.
  2. اغسل الرقاقة النانوية جيدا بالإيثانول اللامائي لإزالة المخلفات العضوية المرفقة على السطح.
    ملاحظة: استخدم مناديل ورقية نظيفة لإزالة الماء على السطح قبل الغسيل بالإيثانول اللامائي.
    تنبيه: الإيثانول اللامائي مادة كيميائية شديدة التقلب وخطرة قليلا. تجنب ملامسة الجلد والعينين. استخدمه في غطاء الدخان مع ارتداء القناع والقفازات.
  3. اغسل الشريحة جيدا بالكثير من الماء منزوع الأيونات لإزالة الإيثانول المتبقي. ثم جفف الشريحة بغاز النيتروجين بنسبة 99.9٪.
    ملاحظة: من المهم إزالة جميع آثار الإيثانول على الرقاقة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية لأن حمض سمكة البيرانا يمكن أن يتفاعل بعنف مع المذيبات العضوية وقد يتسبب في حدوث انفجارات.
  4. ضع الشريحة في دورق نظيف سعة 10 مل بحيث يكون جانب النمط متجها لأعلى وقم بتنظيف الشريحة بمحلول سمكة البيرانا لإعادة الاستخدام والذي يتبع نفس خطوات "تنظيف الرقاقة النانوية".

6. تحديد كمية الصورة

  1. قم بتدوير الصور التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر بحيث تكون مصفوفة nanobar في وضع رأسي للتحليل اللاحق في برنامج فيجي.
  2. استخدم رمز MATLAB المكتوب خصيصا "c_pillarmask_averaging" لتحديد موقع الشريط النانوي الفردي بواسطة قناع مربع (51 بكسل × 51 بكسل) في كل من قناة الدهون وقناة البروتين.
    ملاحظة: تم تصميم رمز MATLAB هذا خصيصا للرقاقة النانوية. يمكن الحصول عليها على GitHub عبر الرابط: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
  3. اطرح إشارات الخلفية لكل صورة باستخدام عائد الاستثمار الثلاثة (5 بكسل × 5 بكسل) في زوايا الصورة بواسطة وظيفة الشبكة في رمز MATLAB "BarGra_avg". تهدف هذه العملية إلى تصحيح ضوضاء الخلفية غير المستوية المحتملة الناتجة عن إعداد المجهر أو تسوية الرقاقة على مرحلة المجهر.
  4. قم بإنشاء متوسط صور الأشرطة النانوية ذات الحجم نفسه باستخدام رمز MATLAB "BarGra_avg" ، حيث تكون كل نقطة هي متوسط القيم عند تلك النقطة في جميع الأقنعة المربعة الفردية. توليد مخططات سطح 3D من متوسط الصور في برنامج فيجي لإظهار متوسط توزيع الإشارة حول nanobars بشكل حدسي. اختر تحليل مخطط السطح > > الإدخال 100 لمضاعف المضلع، وحدد مربعات الاختيار الظل ورسم المحور والناعم.
  5. قسم كل شريط نانوي إلى ثلاث مناطق ، والتي تشمل منطقتين نهايتين نانو ومنطقة مركز نانوبار لاستخراج شدة التألق على التوالي بواسطة رمز MATLAB "avg_nanobar_quantification". يتم ضبط أحجام عائد الاستثمار النانوي وفقا لأبعاد الأشرطة النانوية باستخدام ملف "الموضع".
  6. قسم شدة البروتين على كثافة الدهون المستخرجة من كود MATLAB "avg_nanobar_quantification" في منطقة نهاية الشريط للحصول على كثافة نهاية الشريط النانوي التي تستبعد تأثير مساحة السطح.
  7. ارسم كثافة نهاية القضيب النانوي بتركيزات مختلفة في GraphPad Prism للحصول على منحنى الربط. افتح قائمة التحليل . اختر الانحدار غير الخطي (ملاءمة المنحنى) > الربط - التشبع > الربط المحدد مع دالة منحدر التل لتناسب المنحنى مع معادلة هيل ثم احسب قيمة معامل KD و Hill.
  8. يتم تطبيع كثافة الدهون والبروتين إلى شدتها المقابلة في مركز نانوبار 600 نانومتر المكتسبة في نفس الصورة باستخدام رمز MATLAB "avg_nanobar_quantification".
  9. استخدم ألمع تسعة بكسل من كثافة البروتين الطبيعية في منطقة نهاية الشريط النانوي مقسومة على منطقة مركز الشريط لتحديد استشعار انحناء البروتين باستخدام أشرطة نانوية بنفس الحجم ، وتسمى القيمة باسم "نسبة النهاية إلى المركز". استخدم نسبة كثافة البروتين الطبيعية لتطبيع كثافة الدهون لتحديد نطاق استشعار انحناء البروتين باستخدام أشرطة نانوية مختلفة الحجم ، وتسمى القيمة باسم "كثافة نهاية Nanobar الطبيعية". يتم حساب هذه القيم بواسطة رمز MATLAB "avg_nanobar_quantification".
  10. قم بتحميل صورة مكدس FRAP في برنامج فيجي. اختر منطقة FRAP وقم بإنشاء عائد استثمار. اختر وظيفة القياس المتعدد > لقياس شدة منطقة FRAP في كل مرة. ارسم الكثافة في GraphPad Prism لإنشاء منحنى استرداد FRAP.

النتائج

يوصى بتصميم Nanobar لفحص بروتينات استشعار الانحناء الإيجابي ، والتي تحتوي على نصف دائرة في كل طرف مع انحناء محدد بعرض القضيب النانوي وتحكم واحد في الانحناء المسطح / الصفري محليا في المركز (الشكل 2 أ ، ب). ينتج عن التكوين الناجح ل SLB على القضبان النانوية إشارات علامة دهن?...

Discussion

يقدم نظام nanobar-SLB الموصوف هنا مزيجا فريدا من المزايا في العديد من المقايسات الموجودة في المختبر. يكشف بكفاءة عن الارتباط التفضيلي للبروتينات بالأغشية المنحنية للغاية مثل مقايسة تعويم الجسيمات الشحمية أو الترسيب ولكنه يتطلب عينات أقل بكثير ويوفر انحناءا محددا بدقة أكبر على قضبان نان?...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصلحة مالية منافسة في هذا العمل.

Acknowledgements

نشكر مركز نانيانغ للتصنيع النانوي (N2FC) ومركز التقنيات الضوئية التخريبية (CDPT) في جامعة نانيانغ التكنولوجية (NTU) لدعم تصنيع البنية النانوية والتصوير SEM ، ومنصة إنتاج البروتين (PPP) في كلية العلوم البيولوجية NTU لتنقية البروتين ، وكلية الهندسة الكيميائية والطبية الحيوية NTU للمجهر متحد البؤر. يتم تمويل هذا العمل من قبل وزارة التعليم السنغافورية (MOE) (W. Zhao و RG112/20 و RG95/21 و MOE-T2EP30220-0009) ، ومعهد التحليلات الجزيئية الرقمية والعلوم (IDMxS) بدعم من تمويل وزارة التربية والتعليم في إطار مخطط مراكز التميز البحثية (W. Zhao) ، ومؤسسة برنامج علوم الحدود البشرية (W. Zhao ، RGY0088/2021) ، ومنحة NTU Start-up Grant (W. Zhao) ، كلية الهندسة الكيميائية والطبية الحيوية NTU للمنحة البحثية (X. Miao) ، ومجلس المنح الدراسية الصيني للمنحة البحثية (J. Wu).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anhydrous EthanolSigma-Aldrich100983
Aluminum foilDiamondRN0879999FU
Amber VialSigma-Aldrich27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)Avanti Polar Lipids, Inc.840032
10 mL BeakerSchott-DuranSCOT211060804
50 mL BeakerSchott-DuranSCOT211061706
1000 mL BeakerSchott-DuranSCOT211065408The second container 
ChloroformSigma-AldrichV800117
Cotton budsWatsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)Avanti Polar Lipids, Inc.790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids, Inc.840051
F-BARProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
F-BAR+IDRProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
GFPProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
GFP-HisProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
GraphPad PrismGraphPadV9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)Thermo ScientificH325-500
IDR from human FBP17Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJNational Institutes of Health1.50d
Laser Scanning Confocal MicroscopyZeiss LSM 800 with Airyscan100x (N.A.1.4) oil objective.
MethanolFisher scientific10010240
Mini-extuder Avanti Polar Lipids, Inc.610000-1EA
1.5 mL MicrotubesGreiner616201
MATLABMathworksR2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μmWhatman800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS)Life Technologies Holdings Pte Ltd.70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) BaseDow Corning CorporationSYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) CrosslinkerDow Corning CorporationSYLGARD 184
Plasma CleanerHARRICK PLASMAPDC-002-HP
Quartz NanochipDonghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich795429
Sulfuric acidSigma-Aldrich258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium SaltLife Technologies Holdings Pte Ltd.T1395MP
TweezerGooiPDC-002-HP
Ultrasonic CleanersElmaD-78224
VoterxScientific IndustriesG560E
Vacuum DesiccatorNUCERITE5312
Water BathJulaboTW8

References

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved