Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, in vitro eğrilik algılama yeteneğine sahip proteinlerin karakterizasyonunu sağlayan tanımlanmış bir eğriliğe sahip sentetik bir membran sağlamak için nanobar destekli bir lipit çift katmanlı sistem geliştirilmiştir.

Özet

Membran eğriliği, hücre göçü, hücre bölünmesi ve vezikül kaçakçılığı gibi hücrelerin çeşitli temel süreçlerinde önemli roller oynar. Sadece hücresel aktiviteler tarafından pasif olarak üretilmez, aynı zamanda protein etkileşimlerini aktif olarak düzenler ve birçok hücre içi sinyallemede rol oynar. Bu nedenle, membran eğriliğinin proteinlerin ve lipitlerin dağılımını ve dinamiklerini düzenlemedeki rolünü incelemek büyük değer taşımaktadır. Son zamanlarda, kavisli membran ve protein in vitro arasındaki ilişkiyi incelemek için birçok teknik geliştirilmiştir. Geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında, yeni geliştirilen nanobar destekli lipit çift katmanlı (SLB), önceden tanımlanmış bir membran eğriliği ve yerel düz kontrol ile desenli nanobar dizileri üzerinde sürekli bir lipit çift katmanı oluşturarak membran eğriliği üretiminde hem yüksek verim hem de daha iyi doğruluk sunar. Hem lipit akışkanlığı hem de kavisli membranlara protein duyarlılığı, floresan mikroskopi görüntüleme kullanılarak kantitatif olarak karakterize edilebilir. Burada, nanobar dizileri içeren fabrikasyon cam yüzeylerde bir SLB'nin nasıl oluşturulacağına ve bu SLB üzerinde eğriliğe duyarlı proteinlerin karakterizasyonuna ilişkin ayrıntılı bir prosedür tanıtılmaktadır. Ek olarak, nanoçip yeniden kullanımı ve görüntü işleme protokolleri ele alınmaktadır. Nanobar-SLB'nin ötesinde, bu protokol eğrilik algılama çalışmaları için her türlü nanoyapılı cam çipine kolayca uygulanabilir.

Giriş

Membran eğriliği, morfogenez, hücre bölünmesi ve hücre göçü1 gibi çeşitli hücresel süreçlerde meydana gelen bir hücrenin kritik bir fiziksel parametresidir. Membran eğriliğinin hücresel olayların basit bir sonucunun ötesinde olduğu artık yaygın olarak kabul edilmektedir; bunun yerine, protein etkileşimlerinin ve hücre içi sinyalleşmenin etkili bir düzenleyicisi olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, klatrin aracılı endositozda yer alan birkaç proteinin tercihen kavisli membrana bağlandığı ve endositoz2 için bir sıcak nokta oluşumuna neden olduğu bulunmuştur. Membran deformasyonunun sitoiskelet kuvvetleri tarafından membran çekilmesi, farklı büyüklükte kafa gruplarına sahip lipit asimetrisinin varlığı, konik şekilli transmembran proteinlerinin varlığı, BAR-domain proteinleri (Bin, amfifin ve Rvs proteinlerinden sonra adlandırılmıştır) gibi membran şekillendirici proteinlerin birikmesi ve amfipatik helislerin membrana yerleştirilmesi gibi birçok farklı nedeni vardır1 . İlginç bir şekilde, bu proteinler ve lipitler sadece zarı deforme etmekle kalmaz, aynı zamanda membran eğriliğini algılayabilir ve tercihli birikim gösterebilir1. Bu nedenle, farklı eğriliklere sahip membranların, bunlara bağlı proteinlerin ve lipitlerin dağılımını ve dinamiklerini ve ilgili hücre içi süreçler üzerindeki potansiyel etkilerini değiştirip değiştirmediğini ve nasıl değiştirdiğini incelemek çok önemlidir.

Hem canlı hücre hem de in vitro sistemlerde kavisli membran ve proteinler arasındaki etkileşimi analiz etmek için birçok teknik geliştirilmiştir. Canlı hücre sistemi, zengin lipit çeşitliliği ve dinamik protein sinyal regülasyonu 2,3,4,5,6,7 ile gerçek bir hücre ortamı sağlar. Bununla birlikte, böyle sofistike bir sistemin, hücre içi ortamdaki belirsizlikler ve dalgalanmalar nedeniyle incelenmesi zordur. Bu nedenle, bilinen lipit türlerinden ve saflaştırılmış proteinlerden oluşan yapay bir membran kullanan in vitro testler, proteinler ve kavisli membranlar arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için güçlü sulandırma sistemleri haline gelmiştir. Geleneksel olarak, farklı çaplardaki lipozomlar, eğriliğe duyarlı proteinleri, santrifüj kuvveti kullanan bir ko-sedimantasyon testi veya protein agregasyonunu önlemek için yoğunluk gradyanına sahip bir ko-yüzdürme testi yoluyla tespit etmek için ekstrüzyon ile üretilir 8,9. Bununla birlikte, ekstrüde lipozomların eğriliği, ekstrüder10'da kullanılan membran filtresinin mevcut gözenek boyutu ile sınırlıdır. Tek lipozom eğriliği (SLiC) testinin, farklı çaplara sahip lipozomların floresan etiketli olduğu ve yüzeye hareketsiz hale getirildiği, böylece eğriliğin floresan yoğunluğu11 ile işaretlenebildiği bu sınırlamanın üstesinden geldiği kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, küçük veziküllerde lipit bileşiminde güçlü değişkenlik gözlenmiştir, bu da eğrilik ölçümünün doğruluğunu etkiler12. Tether çekme deneyleri, optik bir cımbız kullanarak dev unilamellar veziküllerden (GUV'ler) çekilen geçici tether üzerindeki eğriliğin daha doğru bir ölçümünü sağlar, burada eğrilik13,14 üretilen membran gerilimi tarafından iyi kontrol edilebilir. Bu yöntem, pozitif veya negatif eğrilik algılama proteinlerini incelemek için uygundur, ancak tüp nesil10'un verimi ile sınırlıdır. Desteklenen membran tüpleri (SMrT) testi, mikroakışkan akışlarla aynı lipit rezervuarından ekstrüde edilen çoklu membran tüplerinin eşzamanlı olarak üretilmesini sağlar. Bununla birlikte, membran eğriliği nanotüp boyunca içsel olarak değişir, bu da floresan yoğunluğuna dayalı eğrilik ölçümünün doğruluğunu tehlikeye atar15,16. Buna karşılık, tasarlanmış topografyaları içeren yüzeylerde desteklenen bir lipit çift katmanlı (SLB) oluşturmak için küçük unilamellar veziküller (SUV'lar, çap <100 nm 17) kullanarak, nanofabrikasyon veya nanomalzemeler tarafından önceden belirlenmiş eğriliklere sahip tek bir çift katmanlı membran üretti18,19,20.

Burada, nanobar dizileri ile imal edilmiş nanoçip yüzeylerinde SLB'nin oluşumu ve proteinlerin in vitro eğrilik hassasiyetini araştırmak için nasıl kullanılabileceği için bir protokol sunuyoruz. Şekil 1'de gösterildiği gibi, tahlilin altı temel bileşeni vardır: A) Çipin mikroakışkan bir oda ile temizlenmesi ve montajı; b) Tanımlanmış lipit bileşimine sahip SUV'ların hazırlanması; C) SLB'nin bir nanoçip üzerinde oluşumu ve eğriliğe duyarlı proteinlerle bağlanması; d) Floresan mikroskobu altında SLB ve eğriliğe duyarlı proteinlerin görüntülenmesi ve karakterizasyonu; e) Çipin yeniden kullanılmak üzere temizlenmesi; f) Protein eğriliği algılama yeteneğinin kantitatif analizi için görüntü işleme. Ayrıntılı protokol aşağıda adım adım açıklanmıştır.

Protokol

1. Nanoçip temizliği

  1. Nanoçipi, desenli tarafı yukarı bakacak şekilde 10 mL'lik bir beherin içine yerleştirin.
    NOT: Bu kuvars nanoçip,21'den önce açıklandığı gibi elektron ışını litografisi ile üretilmiştir. Çip üzerindeki nanoyapının geometrisi ve düzenlemesi özel olarak tasarlanabilir. Burada kullanılan gradyan nanoçubuklarının boyutları 2000 nm uzunluğunda, 600 nm yüksekliğinde ve 100 ila 1000 nm genişliğindedir (100 nm adım seti).
  2. Beher'e dikkatlice 1 mL% 98 sülfürik asit ekleyin ve asidin çipin ön ve arka tarafını tamamen kapladığından emin olun.
    NOT: %98 sülfürik asit son derece aşındırıcıdır ve cilt veya gözlerle temas ettiğinde hızlı doku yıkımına ve ciddi kimyasal yanıklara neden olabilir. Duman davlumbazında uygun koruma ile kullanın.
  3. Beheri yavaşça döndürün ve tüm beher ısınana kadar damla damla damla 200 μL% 30 hidrojen peroksit ekleyin. Sülfürik asit ve hidrojen peroksitin, organik moleküllerin nanoçip17'den uzaklaştırılması için piranha çözeltisi oluşturmak üzere iyice karıştırıldığından emin olun. SLB'yi daha önce açıklandığı gibi UV ışığı ve ozona maruz kalma gibi temiz hidrofilik yüzeylerde üretmek için alternatif teknikler vardır23.
    NOT: Reaksiyon son derece ekzotermiktir ve çözeltinin kaynamasına neden olabilir, bu nedenle sülfürik aside damla damla hidrojen peroksit ekleyin ve dönmeye devam edin.
  4. Beheri ikincil bir cam kaba yerleştirin ve safsızlıkları iyice temizlemek için nanoçipi gece boyunca piranha çözeltisine batırılmış halde tutun.
    NOT: Reaksiyonun gaz üretebilmesi ihtimaline karşı beheri herhangi bir örtü olmadan davlumbazın içine yerleştirin.
  5. Beheri çıkarın ve piranha çözeltisini dikkatlice bir asit atık kabına pipetleyin.
  6. Artık asidi seyreltmek ve asit atığına atmak için beherin içine 5 mL deiyonize su yükleyin. Bu adımı beş kez tekrarlayın ve asit atıklarını nötralize etmek için 5 M NaOH kullanın.
  7. Çipi cımbızla alın ve artık asidi iyice gidermek için sürekli bir deiyonize su akışıyla yıkayın. SLB oluşumu22 için çipi %99,9 azot gazı ile fön ile kurulayın.

2. Küçük unilamellar veziküllerin (SUV'lar) üretimi

  1. Kehribar bir şişeye 100 μL kloroform ekleyin.
    NOT: Kloroform oldukça uçucu, renksiz bir sıvıdır ve solunması veya yutulması durumunda toksik olabilir. Maske ve eldivenler açıkken duman başlığında kullanın.
  2. 500 μg lipit karışımını kloroform içinde çözün. Burada kullanılan lipit karışımının bileşimi% 89.5 mol yumurta fosfatidilkolinleri (PC), beyin fosfatidilserin (PS) 10 mol% ve Texas Red 1,2-dihekzadekanoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin, trietilammonyum tuzu (Texas Red DHPE) 0.5 mol'dür.
  3. Şişedeki lipit karışımını, kloroform uçucu hale gelene ve lipit karışımı kuruyana kadar% 99.9 azot gazı ile üfleyerek kurutun.
    NOT: Bu adım duman davlumbazında yapılmalıdır. Fön ile kuruturken sıvı sıçramasından kaçının.
  4. Kehribar şişede bulunan lipit karışımını kapaksız olarak alüminyum folyo kaplı vakumlu kurutucuya yerleştirin. Daha sonra kloroformu tamamen uçucu hale getirmek için numuneyi bir pompayla 3 saat vakumla kurulayın.
  5. Flakona 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS) tamponu ekleyin. Çözeltiyi homojen olana kadar vorteksleyin.
    NOT: PBS tamponu, kalsiyum, magnezyum ve fenol kırmızısı içermeyen 150 mM NaCl'den oluşur; pH, PC ve PS lipit çift katmanlı hale getirmek için 7.2'ye ayarlanır.
  6. Bir banyo sonikatöründe lipit karışımını 30 kHz frekansında 50 dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra lipit karışımını 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve parafilm ile kapatın.
  7. Lipid karışımını sıvı azotta 20 s dondurun ve ardından bir su banyosunda 2 dakika boyunca 42 ° C'de çözün. Donma-çözülme döngülerini 30 kez tekrarlayın. Bundan sonra, lipit karışımı berrak bir sıvı gibi görünür.
    DİKKAT: Sıvı azot yaklaşık -195.8 °C kaynama noktasına sahiptir. Donma veya kriyojenik yanıklara neden olabilir. Isı yalıtım eldivenleri ile sınırlı olmayan alanda kullanın.
  8. İki cam gaz geçirmez şırıngayı ve mini ekstrüderin konektörünü sırasıyla etanol, kloroform ve metanol ile durulayın. Aparatı önceden temizlemek için durulama sırasını beş kez tekrarlayın. Organik çözücü tamamen uçucu hale gelene kadar onları duman davlumbazında bırakın.
  9. Mini ekstrüder aparatını monte edin ve aparatı önceden ıslatmak için konektörden 500 μL PBS tamponunu geçirin, ardından tamponu başka bir şırıngadan atın. Bu adım safsızlıkları giderir ve ekstrüzyonu kolaylaştırır.
  10. Mini ekstrüder aparatını 100 nm gözenek boyutunda bir polikarbonat filtre membranı ile birleştirin.
    NOT: Filtre zarının gözenek boyutu, lipozomların çapını belirler.
  11. Şırıngalardan biriyle 500 μL PBS tamponu alın ve diğer ucundaki ikinci boş şırıngayı doldurmak için yavaşça filtreden geçirin. Aparat sızıntısını kontrol etmek için ekstrüzyonu üç kez ileri geri tekrarlayın ve tamponu ikinci şırıngadan atın.
  12. PBS tamponunu değiştirmek için lipit karışımını mini ekstrüderden geçirin. Daha sonra SUV'ları oluşturmak için 20 kez ileri geri ekstrüzyon yapın. Veziküllerin çok katmanlı karakteri, SLB oluşumunu etkileyecek yetersiz sayıda ekstrüzyon süresi ile korunabilir23.
  13. Daha büyük parçacıklarla kirlenmeyi azaltmak için SUV'ları ikinci şırıngadan toplayın ve 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Şırınganın kopması ihtimaline karşı şırıngayı doğrudan konektörden çıkarın.
  14. Floresan etiketli lipitlerin ağartılmasını önlemek için tüpü alüminyum folyo ile sarın ve 4 ° C'de saklayın. Genellikle, SUV'lar 7 güne kadar saklanabilir.

3. Bir nanoçip üzerinde SLB'nin oluşumu

  1. Temizlenmiş nanoçipi deiyonize sudan bir çift cımbızla dikkatlice çıkarın ve% 99.9 azot gazı ile fön ile kurutun.
  2. Nanoçipin yüzey temizliğini 1 saat boyunca hava plazma işlemi ile yapın.
  3. Nanoçipi, iki parça PDMS-bir orta PDMS ve bir üst PDMS'den oluşan bir polidimetilsiloksan (PDMS) odasında birleştirin (Şekil 1A). Orta PDMS, nanobar desenine yeterli pozlama sağlamak için merkezde oval şekilli büyük bir açıklık ile ince (~ 0,5 mm) dir. Üst PDMS kalındır (~4,0 mm), büyük oval açıklık içinde sıvı kullanımı için bir giriş ve çıkış olarak iki küçük delik vardır.
    1. Çipi, desen yukarı bakacak şekilde temiz bir yüzeye yerleştirin.
    2. Orta PDMS'yi çiple yavaşça örtün ve tüm desenin orta PDMS'deki büyük oval şekilli açıklığın merkezi alanına maruz kaldığından emin olun.
    3. Üst PDMS'yi orta PDMS ile örtün ve iki küçük deliğini orta PDMS'nin büyük oval deliği bölgesinde tutun. Daha sonra PDMS odası monte edilir.
      NOT: PDMS en yaygın kullanılan silikon bazlı organik polimerdir. Biyouyumlu, şeffaf ve mikroskop altında çip montajı ve görüntüleme için özelleştirilmiş bir şekil olarak tasarlanmak üzere deforme olabilir. Daha da önemlisi, plazma işleminden sonra kovalent olarak başka bir PDMS tabakasına veya cama sıkıca yapıştırılabilir, bu da SLB'yi hazırlamak için oda olarak uygun hale getirir. Bu adım, boşlukları ve sızıntıyı önlemek için her PDMS katmanının sıkıca takılmasını sağlar.
  4. SUV'ları üst PDMS'deki iki küçük delikten birinden PDMS odasına bir pipetle yükleyin ve SLB'yi oluşturmak için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  5. PBS tamponunu küçük deliğin bir tarafından PDMS odasına nazikçe pipetleyin ve bağlanmamış SUV'ları yıkamak için atıkları diğer delikten pamuklu bir tomurcukla çıkarın. Daha sonra nanoçip üzerinde oluşturulan SLB'yi edinin (SLB'nin kalitesi, adım 4.4'te gösterildiği ve temsili sonuçlar bölümünde tartışıldığı gibi fotobeyazlatma sonrası floresan geri kazanımı (FRAP) ile test edilir).
    NOT: PBS tamponunu hazneye pipetlediğinizde, herhangi bir kabarcık enjekte edilmemesi için pipet ucu tamponla dolu ve sıvı yüzeyiyle temas halinde olmalıdır.

4. SLB'nin ve nanoçip üzerindeki eğrilik algılama proteininin bağlanmasını görüntüleme

NOT: Bu bölüm, deney için mevcut mikroskop sistemine bağlı olacaktır. Burada, görüntülemenin nasıl yapılacağına dair genel bir kılavuz açıklanacaktır. Ayrıntılı ayarlar farklı mikroskop kurulumları arasında değiştirilebilir.

  1. 100x (N.A.1.4) yağ hedefi kullanarak lazer tarama konfokal mikroskopisini ayarlayın. Lipid ve proteinin floresansını uyarabilecek uyarma lazer gücünü seçmek için ZEN yazılımını açın. Texas Red DHPE / EGFP> Akıllı Kurulum > Edinme modunu seçin.
  2. Nanobar kenarları lipit kanalının altında keskin olana kadar çip üzerindeki nanoçubukları bulmak için odak düğmesiyle odağı ayarlayın.
  3. Protein eklemeden önce lipit kanalının kontrol görüntüsünü elde etmek için tarama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: Çerçeve Boyutu = 512 piksel x 512 piksel (512 piksel x 512 piksel, 124 nm piksel boyutu), Piksel Başına Bit = 16 (16 bit derinlik), Tarama hızı = 5 ve Ortalama = 4 (dört kez/çizgi ortalama modu).
  4. FRAP tahlilini, floresan etiketli lipit çift katmanını rastgele tek bir nanobar alanı üzerinde ağartarak yapın.
    1. Deneme Bölgeleri ve Ağartma onay kutularını seçin. Merkezdeki tüm nanobarı içerebilen 5 μm çapında dairesel bir alan çizin (nanobar boyutu 2 μm'dir) ve Deney Bölgelerine ekleyin. Hızlandırılmış görüntüleme parametrelerini aşağıdaki örnekte olduğu gibi girin: Tarama hızı = 9 ve Ortalama = 1'i seçin. Zaman Serisi > Süre = 100 döngü ve Aralık = 2 sn'yi seçin. Ağartma parametrelerini aşağıdaki örnekte olduğu gibi girin: # görüntülerden sonra başla onay kutusunu seçin ve üç görüntü seçin.
    2. FRAP gerçekleştiren lazer onay kutularını seçin ve gücü %100,0 olarak değiştirin. FRAP denemesi için Denemeyi Başlat'ı tıklatın.
      NOT: FRAP, hücresel moleküllerin hareketliliğini karakterize etmek için yaygın bir yöntemdir. SLB iyi akışkanlığa sahipse, ağartılmış alandaki floresan, ağartılmış floroforlar yayıldıkça ve diğer alanlardan ağartılmamış floroforlar yayıldıkça yavaş yavaş iyileşecektir.
  5. Protein çözeltisini PDMS odasına yükleyin ve proteinin SLB üzerine bağlanmasına izin vermek için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    NOT: Şekil 2G,H'de lipid bileşimini göstermek için kullanılan proteinler, nanobar kavisli SLB'lerde protein bağlanmasını kolaylaştırır 74 μM GFP ve 79 μM GFP-His'tir. Bu iki protein, His-etiketi olmayan veya His-etiketi olan yeşil floresan proteinlerdir. Şekil 4 ve Şekil 5'te eğrilik algılama çalışması için kullanılan proteinler 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 ve 16 μM FBAR + IDRFBP17'dir. Bu üç protein, sezgisel olarak hem eğrilik jeneratörleri hem de sensörler olarak kabul edilen tipik bir BAR proteini olan FBP17'nin alanlarıdır. Her protein hacmi 20 μL'dir.
  6. Nanobarları yeniden odaklayın ve protein eğriliği algılama tespiti için hem lipit hem de protein kanallarının görüntülerini almak için adım 4.3'ü tekrarlayın.
  7. FRAP testini hem lipit hem de protein kanallarında yapmak için adım 4.4'ü tekrarlayın ve eğrilik algılama proteininin hareketliliğini karakterize etmek için hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin.

5. Nanoçipin yeniden kullanımı

  1. Nanoçipi cımbızla alın ve deiyonize suyla doldurulmuş 50 mL'lik bir beherde PDMS odasından dikkatlice ayırın.
    NOT: Bu kritik bir adımdır. Cımbızların nanoyapıya temas etmesini önleyin ve çatlakları önlemek için çipi ayrılmaya zorlamayın.
  2. Yüzeye yapışmış organik kalıntıları gidermek için nanoçipi susuz etanol ile iyice yıkayın.
    NOT: Susuz etanol ile yıkamadan önce yüzeydeki suyu çıkarmak için temiz mendil kağıdı kullanın.
    DİKKAT: Susuz etanol oldukça uçucu ve hafif tehlikeli bir kimyasaldır. Cilt ve gözlerle temasından kaçının. Maske ve eldivenler açıkken duman başlığında kullanın.
  3. Artık etanol çıkarmak için çipi bol miktarda deiyonize suyla iyice yıkayın. Daha sonra çipi %99,9 azot gazı ile kurulayın.
    NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce çip üzerindeki tüm etanol izlerini çıkarmak önemlidir, çünkü piranha asidi organik çözücü ile şiddetli reaksiyona girebilir ve patlamalara neden olabilir.
  4. Çipi, desen tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir 10 mL beherine yerleştirin ve çipi, 'nanoçipin temizlenmesi' ile aynı adımları izleyen yeniden kullanım için piranha çözeltisi ile temizleyin.

6. Görüntü ölçümü

  1. Bir mikroskop tarafından elde edilen görüntüleri, nanobar dizisi Fiji yazılımında sonraki analizler için dikey konumda olacak şekilde döndürün.
  2. Tek tek nanobarı hem lipit kanalında hem de protein kanalında kare bir maske (51 piksel x 51 piksel) ile bulmak için özel olarak yazılmış bir MATLAB kodu 'c_pillarmask_averaging' kullanın.
    NOT: Bu MATLAB kodu nanoçip için özel olarak tasarlanmıştır. GitHub'da şu bağlantı aracılığıyla edinilebilir: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
  3. MATLAB kodu 'BarGra_avg'daki meshgrid işleviyle görüntünün köşelerindeki üç ROI (5 piksel x 5 piksel) ile her görüntünün arka plan sinyallerini çıkarın. Bu işlem, mikroskop kurulumunun veya mikroskop aşamasında çip tesviyesinin neden olduğu potansiyel düzensiz arka plan gürültülerini düzeltmeyi amaçlamaktadır.
  4. MATLAB kodu 'BarGra_avg' kullanarak aynı büyüklükteki nanobarların ortalama görüntülerini oluşturun, burada her bir nokta, tüm bireysel nanobar kare maskelerinde o noktadaki değerlerin ortalamasıdır. Nanoçubukların etrafındaki ortalama sinyal dağılımını sezgisel olarak göstermek için Fiji yazılımındaki ortalama görüntülerin 3B yüzey grafiklerini oluşturun. Poligon Çarpanı için > Yüzey Grafiğini Analiz Et > Giriş 100'ü seçin ve Gölge, Çizim Ekseni ve Pürüzsüz onay kutularını seçin.
  5. Her nanobarı, floresan yoğunluklarını sırasıyla MATLAB kodu 'avg_nanobar_quantification' ile çıkarmak için iki nanobar uç alanı ve bir nanobar merkezi alanı içeren üç alana ayırın. Nanobar ROI'lerinin boyutları, 'konum' dosyası kullanılarak nanobarların boyutuna göre ayarlanır.
  6. Yüzey alanı etkisini hariç tutan nanobar-uç yoğunluğunu elde etmek için protein yoğunluklarını çubuk uç alanındaki 'avg_nanobar_quantification' MATLAB kodundan çıkarılan lipit yoğunluklarına bölün.
  7. Bağlanma eğrisini elde etmek için nanobar uç yoğunluğunu GraphPad Prizma'da farklı konsantrasyonlarla çizin. Analiz menüsünü açın. Eğriyi Hill denklemine uydurmak için Doğrusal olmayan regresyon (eğri uyumu) > Bağlama - Doygunluk > Tepe eğimi işleviyle özel bağlama'yı seçin ve ardından KD ve Tepe katsayısı değerini hesaplayın.
  8. Lipid ve protein yoğunlukları, MATLAB kodu 'avg_nanobar_quantification' kullanılarak aynı görüntüde elde edilen 600 nm nanobar merkezinde karşılık gelen yoğunluklarına normalleştirilir.
  9. Aynı büyüklükteki nanobarlarla protein eğriliği algılamasını ölçmek için nanobar uç alanında normalleştirilmiş protein yoğunluklarının en parlak dokuz pikselini çubuk merkez alanına bölünerek kullanın, değer "uçtan merkeze oran" olarak adlandırılır. Farklı büyüklükteki nanobarlarla protein eğriliği algılama aralığını ölçmek için lipit yoğunluğunu normalleştirmek için normalleştirilmiş protein yoğunluğunun oranını kullanın, değer "Normalleştirilmiş Nanobar-Uç Yoğunluğu" olarak adlandırılır. Bu değerler MATLAB kodu 'avg_nanobar_quantification' ile hesaplanır.
  10. FRAP yığını görüntüsünü Fiji yazılımına yükleyin. FRAP alanını seçin ve bir yatırım getirisi oluşturun. Her seferinde FRAP alanının yoğunluğunu ölçmek için Daha > Çoklu ölçüm işlevini seçin. FRAP kurtarma eğrisini oluşturmak için yoğunluğu GraphPad Prizma'da çizin.

Sonuçlar

Nanobar tasarımı, nanobar genişliği ile tanımlanan eğrilik ve merkezde yerel olarak bir düz / sıfır eğrilik kontrolü ile her iki ucunda yarım daire içeren pozitif eğrilik algılama proteinlerini araştırmak için önerilir (Şekil 2A, B). SLB'nin nanobarlar üzerinde başarılı bir şekilde oluşturulması, Şekil 2C'de gösterildiği gibi tüm nanobar yüzeyi boyunca eşit olarak dağılmış lipit işaretleyici sinyalleri ile s...

Tartışmalar

Burada açıklanan nanobar-SLB sistemi, mevcut birkaç in vitro tahlildeki avantajların benzersiz bir kombinasyonunu sunmaktadır. Proteinlerin lipozom yüzdürme veya sedimantasyon testi olarak yüksek oranda kavisli membranlara tercihli bağlanmasını etkili bir şekilde ortaya çıkarır, ancak çok daha az numune gerektirir ve bireysel nanobarlarda daha doğru tanımlanmış eğrilik sunar 8,29. Ayrıca, SLB hareketli olduğundan ve sürekli olarak...

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışmada rakip bir finansal çıkar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi'ndeki (NTU) Yıkıcı Fotonik Teknolojiler Merkezi'ne (CDPT), nanoyapı imalatını ve SEM görüntülemeyi destekledikleri için, protein saflaştırma için Biyolojik Bilimler Okulu NTU'daki Protein Üretim Platformu'na (PPP) ve konfokal mikroskop için Kimya ve Biyomedikal Mühendisliği NTU Okulu'na teşekkür ederiz. Bu çalışma, Singapur Eğitim Bakanlığı (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 ve MOE-T2EP30220-0009), Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri programı kapsamında MOE finansmanı tarafından desteklenen Dijital Moleküler Analitik ve Bilim Enstitüsü (IDMxS), İnsan Sınırı Bilim Programı Vakfı (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao) tarafından finanse edilmektedir. Araştırma bursu için Kimya ve Biyomedikal Mühendisliği NTU Okulu (X. Miao) ve araştırma bursu için Çin Burs Konseyi (J. Wu).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anhydrous EthanolSigma-Aldrich100983
Aluminum foilDiamondRN0879999FU
Amber VialSigma-Aldrich27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)Avanti Polar Lipids, Inc.840032
10 mL BeakerSchott-DuranSCOT211060804
50 mL BeakerSchott-DuranSCOT211061706
1000 mL BeakerSchott-DuranSCOT211065408The second container 
ChloroformSigma-AldrichV800117
Cotton budsWatsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)Avanti Polar Lipids, Inc.790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids, Inc.840051
F-BARProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
F-BAR+IDRProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
GFPProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
GFP-HisProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
GraphPad PrismGraphPadV9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)Thermo ScientificH325-500
IDR from human FBP17Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJNational Institutes of Health1.50d
Laser Scanning Confocal MicroscopyZeiss LSM 800 with Airyscan100x (N.A.1.4) oil objective.
MethanolFisher scientific10010240
Mini-extuder Avanti Polar Lipids, Inc.610000-1EA
1.5 mL MicrotubesGreiner616201
MATLABMathworksR2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μmWhatman800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS)Life Technologies Holdings Pte Ltd.70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) BaseDow Corning CorporationSYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) CrosslinkerDow Corning CorporationSYLGARD 184
Plasma CleanerHARRICK PLASMAPDC-002-HP
Quartz NanochipDonghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich795429
Sulfuric acidSigma-Aldrich258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium SaltLife Technologies Holdings Pte Ltd.T1395MP
TweezerGooiPDC-002-HP
Ultrasonic CleanersElmaD-78224
VoterxScientific IndustriesG560E
Vacuum DesiccatorNUCERITE5312
Water BathJulaboTW8

Referanslar

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 189nanobar dizisimembran e rili ie rilik alg lama proteinidesteklenen lipit ift katmanlin vitro tahlil

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır