АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь разработана липидная бислойная система с поддержкой нанобара, чтобы обеспечить синтетическую мембрану с определенной кривизной, которая позволяет характеризовать белки с способностью зондировать кривизну in vitro.

Аннотация

Кривизна мембраны играет важную роль в различных важных процессах клеток, таких как миграция клеток, деление клеток и перемещение пузырьков. Он не только пассивно генерируется клеточной активностью, но и активно регулирует белковые взаимодействия и участвует во многих внутриклеточных передачах сигналов. Таким образом, большое значение имеет изучение роли кривизны мембран в регулировании распределения и динамики белков и липидов. В последнее время было разработано множество методик для изучения взаимосвязи между изогнутой мембраной и белком in vitro. По сравнению с традиционными методами, недавно разработанный липидный бислой с поддержкой нанобара (SLB) обеспечивает как высокую пропускную способность, так и лучшую точность в генерации кривизны мембраны путем формирования непрерывного липидного бислоя на узорчатых массивах нанобаров с заранее определенной кривизной мембраны и локальным плоским контролем. Как липидная текучесть, так и чувствительность белка к изогнутым мембранам могут быть количественно охарактеризованы с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь представлена подробная процедура формирования SLB на изготовленных стеклянных поверхностях, содержащих нанобарные массивы, и характеристика чувствительных к кривизне белков на таких SLB. Кроме того, рассматриваются протоколы повторного использования наночипов и обработки изображений. Помимо нанобара-SLB, этот протокол легко применим ко всем типам наноструктурированных стеклянных чипов для исследований с измерением кривизны.

Введение

Кривизна мембраны является критическим физическим параметром клетки, который происходит в различных клеточных процессах, таких как морфогенез, деление клеток и миграция клеток1. В настоящее время широко признано, что кривизна мембраны выходит за рамки простого результата клеточных событий; вместо этого он стал эффективным регулятором белковых взаимодействий и внутриклеточной сигнализации. Например, было обнаружено, что несколько белков, участвующих в клатрин-опосредованном эндоцитозе, предпочтительно связываются с изогнутой мембраной, что приводит к образованию горячей точки для эндоцитоза2. Существует много различных причин деформации мембраны, таких как притяжение мембраны цитоскелетными силами, наличие асимметрии липидов с различными по размеру головными группами, существование трансмембранных белков с конической формой, накопление мембранообразующих белков, таких как белки BAR-домена (названные в честь белков Bin, amphiphysin и Rvs), и вставка домена амфипатических спиралей в мембрану1 . Интересно, что эти белки и липиды не только деформируют мембрану, но также могут ощущать искривление мембраны и проявлять предпочтительное накопление1. Поэтому крайне важно изучить, изменяют ли мембраны с различными кривизнами распределение и динамику белков и липидов, прикрепленных к ним, и потенциальное воздействие на связанные внутриклеточные процессы.

Многие методы были разработаны для анализа взаимодействия между изогнутой мембраной и белками как в живых клетках, так и в системах in vitro. Система живых клеток обеспечивает реальную клеточную среду с богатым липидным разнообразием и динамической регуляцией передачи сигналов белка 2,3,4,5,6,7. Однако такую сложную систему трудно изучать из-за неопределенностей и флуктуаций во внутриклеточной среде. Следовательно, анализы in vitro с использованием искусственной мембраны, состоящей из известных видов липидов и очищенных белков, стали мощными системами восстановления для характеристики отношений между белками и изогнутыми мембранами. Традиционно липосомы различного диаметра генерируются экструзией для обнаружения чувствительных к кривизне белков либо с помощью анализа совместного осаждения с использованием центробежной силы, либо анализа совместной флотации с градиентом плотности, чтобы избежать агрегации белка 8,9. Однако кривизна экструдированных липосом ограничена доступным размером пор мембранного фильтра, используемого в экструдере10. Было доказано, что анализ искривления одной липосомы (SLiC) преодолевает это ограничение, в котором липосомы с различным диаметром мечутся флуоресценцией и иммобилизуются на поверхность, так что кривизна может быть отмечена флуоресцентной интенсивностью11. Однако сильная изменчивость липидного состава наблюдалась в небольших везикулах, что влияет на точность измерения кривизны12. Эксперименты по вытягиванию троса обеспечивают более точное измерение кривизны на переходном тросе, вытягиваемом из гигантских одноламеллярных везикул (GUV) с использованием оптического пинцета, где кривизна может хорошо контролироваться напряжением мембраны, генерируемым13,14. Этот метод подходит для изучения белков, чувствительных к положительной или отрицательной кривизне, но ограничен пропускной способностью трубчатой генерации10. Анализ поддерживаемых мембранных трубок (SMrT) обеспечивает одновременную генерацию нескольких мембранных трубок, которые выдавливаются из одного и того же липидного резервуара микрофлюидными потоками. Тем не менее, кривизна мембраны изменяется внутренне вдоль нанотрубки, что ставит под угрозу точность измерения кривизны на основе интенсивности флуоресценции15,16. Для сравнения, использование небольших одноламеллярных везикул (внедорожников, диаметром <100 нм17) для формирования поддерживаемого липидного бислоя (SLB) на поверхностях, содержащих разработанные топографии, генерировало одну двухслойную мембрану с кривизнами, предопределенными нанопроизводством или наноматериалами с высокой точностью 18,19,20.

Здесь мы представляем протокол формирования SLB на изготовленных поверхностях наночипов с нанобарными массивами и то, как его можно использовать для исследования чувствительности к кривизне белков in vitro. Как показано на рисунке 1, существует шесть основных компонентов анализа: А) Очистка и сборка чипа с микрофлюидной камерой; Б) Подготовка внедорожников с определенным липидным составом; В) Образование SLB на наночипе и связывание с кривизной чувствительных белков; D) Визуализация и характеристика чувствительных к SLB и кривизне белков при флуоресцентной микроскопии; Д) Очистка чипа для повторного использования; F) Обработка изображений для количественного анализа способности восприятия кривизны белка. Подробный протокол описан шаг за шагом ниже.

протокол

1. Очистка наночипа

  1. Поместите наночип в стакан объемом 10 мл с узорчатой стороной вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот кварцевый наночип был изготовлен с помощью электронно-лучевой литографии, как описано выше21. Геометрия и расположение наноструктуры на чипе могут быть разработаны по индивидуальному заказу. Размеры градиентных нанобаров, используемых здесь, составляют 2000 нм в длину, 600 нм в высоту и от 100 до 1000 нм в ширину (шаг 100 нм).
  2. Осторожно добавьте 1 мл 98% серной кислоты в стакан и убедитесь, что кислота полностью покрывает переднюю и заднюю стороны чипа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 98% серная кислота чрезвычайно коррозионна и может вызвать быстрое разрушение тканей и серьезные химические ожоги при контакте с кожей или глазами. Используйте его в вытяжном шкафу с надлежащей защитой.
  3. Медленно вращайте стакан и добавляйте 200 мкл 30% перекиси водорода капля за каплей, пока весь стакан не станет горячим. Убедитесь, что серная кислота и перекись водорода хорошо перемешаны с образованием раствора пираньи для удаления органических молекул из наночипа17. Существуют альтернативные методы генерации SLB на чистых гидрофильных поверхностях, такие как воздействие ультрафиолетового света и озона, как описано ранее23.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция чрезвычайно экзотермическая и может привести к кипению раствора, поэтому добавляйте перекись водорода в серную кислоту по каплям и продолжайте вращаться.
  4. Поместите стакан во вторичный стеклянный контейнер и держите наночип погруженным в раствор пираньи на ночь, чтобы тщательно очистить примеси.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите стакан в вытяжной капюшон без какой-либо крышки на случай, если реакция может привести к образованию газа.
  5. Выньте стакан и аккуратно выложите раствор пираньи в контейнер для кислотных отходов.
  6. Загрузите 5 мл деионизированной воды в стакан, чтобы разбавить остаточную кислоту и выбросить ее в кислотные отходы. Повторите этот шаг пять раз и используйте 5 M NaOH для нейтрализации кислотных отходов.
  7. Возьмите чип пинцетом и промойте непрерывным потоком деионизированной воды, чтобы тщательно удалить остаточную кислоту. Высушите чип феном с 99,9% газообразным азотом для формирования SLB22.

2. Генерация малых одноламеллярных везикул (внедорожников)

  1. Добавьте 100 мкл хлороформа во флакон янтаря.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хлороформ представляет собой очень летучую, бесцветную жидкость, и он может быть токсичным при вдыхании или проглатывании. Используйте его в вытяжном капюшоне с маской и перчатками.
  2. Растворить 500 мкг липидной смеси в хлороформе. Состав используемой здесь липидной смеси составляет 89,5 моль% яичных фосфатидилхолинов (ПК), 10 моль% фосфатидилсерина мозга (PS) и 0,5 моль% техасского красного 1,2-дигексадеканоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, соли триэтиламмония (Texas Red DHPE).
  3. Высушите липидную смесь во флаконе с 99,9% газообразным азотом до тех пор, пока хлороформ не испарится и липидная смесь не высохнет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен в вытяжном шкафу. Избегайте разбрызгивания жидкости при сушке феном.
  4. Поместите липидную смесь, присутствующую в янтарном флаконе без крышки, в вакуумный осушитель, покрытый алюминиевой фольгой. Затем вакуумно высушите образец с помощью насоса в течение 3 ч, чтобы полностью испарить хлороформ.
  5. Добавьте 250 мкл буферного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) во флакон. Вращайте раствор до однородности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер PBS состоит из 150 мМ NaCl, без кальция, магния и фенолов красного цвета; pH регулируется до 7,2 для того, чтобы сделать PC и PS липидными двухслойными.
  6. Хранить липидную смесь в течение 30 мин на частоте 50 кГц в ванне соникаторе. Затем переложите липидную смесь в центрифужную трубку объемом 1,5 мл и запечатайте парапленкой.
  7. Заморозить липидную смесь в жидком азоте на 20 с, а затем разморозить при 42 °C в течение 2 мин на водяной бане. Повторите циклы замораживания-оттаивания 30 раз. После этого липидная смесь выглядит как прозрачная жидкость.
    ВНИМАНИЕ: Жидкий азот имеет температуру кипения около −195,8 °C. Это может вызвать обморожение или криогенные ожоги. Используйте его в неограниченном пространстве с теплоизоляционными перчатками.
  8. Промыть два стеклянных газонепроницаемых шприца и соединитель мини-экструдера с этанолом, хлороформом и метанолом соответственно. Повторите последовательность промывки пять раз, чтобы предварительно очистить устройство. Оставьте их в вытяжном шкафу до тех пор, пока органический растворитель полностью не испарится.
  9. Соберите мини-экструдер и пропустите 500 мкл буфера PBS через разъем, чтобы предварительно намочить устройство, а затем выбросьте буфер из другого шприца. Этот этап удаляет примеси и облегчает экструзию.
  10. Соберите мини-экструдер с поликарбонатной фильтрующей мембраной размером 100 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер пор фильтрующей мембраны определяет диаметр липосом.
  11. Возьмите 500 мкл буфера PBS с одним из шприцев и осторожно протолкните его через фильтр, чтобы заполнить второй пустой шприц на другом конце. Повторите экструзию вперед и назад три раза, чтобы проверить утечку аппарата и выбросить буфер из второго шприца.
  12. Пропустите липидную смесь через мини-экструдер для замены буфера PBS. Затем выдавливайте вперед и назад 20 раз, чтобы сформировать внедорожники. Многоламеллярный характер везикул может сохраняться при недостаточном количестве времени экструзии, что повлияет на образование SLB23.
  13. Соберите внедорожники со второго шприца, чтобы уменьшить загрязнение более крупными частицами, и перенесите его в трубку центрифуги объемом 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките шприц прямо из разъема на случай, если шприц сломается.
  14. Оберните трубку алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить отбеливание флуоресцентных липидов, и храните их при 4 °C. Обычно внедорожники могут храниться до 7 дней.

3. Формирование SLB на наночипе

  1. Осторожно извлеките очищенный наночип из деионизированной воды с помощью пинцета и высушите феном с 99,9% газообразного азота.
  2. Выполняют очистку поверхности наночипа воздушно-плазменной обработкой в течение 1 ч.
  3. Соберите наночип в полидиметилсилоксановую (PDMS) камеру, которая состоит из двух частей PDMS - средней PDMS и верхней PDMS (рисунок 1A). Средняя PDMS тонкая (~ 0,5 мм) с большим овальным отверстием в центре, чтобы обеспечить достаточную экспозицию нанобарного рисунка. Верхняя PDMS имеет толщину (~ 4,0 мм) с двумя небольшими отверстиями в большом овальном отверстии в качестве входного отверстия и выхода для обработки жидкости.
    1. Поместите чип на чистую поверхность с рисунком вверх.
    2. Аккуратно накройте среднюю PDMS чипом и убедитесь, что весь рисунок подвергается воздействию центральной области большого отверстия овальной формы в середине PDMS.
    3. Закройте верхнюю PDMS средней PDMS и держите два ее небольших отверстия в области большого овального отверстия средней PDMS. Затем собирается камера PDMS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS является наиболее широко используемым органическим полимером на основе кремния. Он является биосовместимым, прозрачным, а также деформируемым, чтобы быть разработанным как индивидуальная форма для сборки чипа и визуализации под микроскопом. Что еще более важно, он может быть ковалентно прикреплен к другому слою PDMS или стеклу плотно после плазменной обработки, что делает его подходящим в качестве камеры для подготовки SLB. Этот шаг гарантирует, что каждый слой PDMS плотно прилегает, чтобы избежать зазоров и утечек.
  4. Загрузите внедорожники в камеру PDMS из одного из двух небольших отверстий в верхней части PDMS с пипеткой и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы сформировать SLB.
  5. Аккуратно нанесите буфер PBS в камеру PDMS с одной стороны небольшого отверстия и удалите отходы ватной палочкой из другого отверстия, чтобы смыть несвязанные внедорожники. Затем приобретите SLB, сформированный на наночипе (качество SLB проверяется флуоресцентным восстановлением после фотоотбеливания (FRAP), как показано на этапе 4.4 и обсуждается в разделе репрезентативных результатов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При пипетке буфера PBS в камеру наконечник пипетки должен быть заполнен буфером и контактировать с поверхностью жидкости, чтобы избежать нагнетания каких-либо пузырьков.

4. Визуализация SLB и связывание белка, чувствительного к кривизне на наночипе

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел будет зависеть от системы микроскопа, доступной для эксперимента. Здесь будет описано общее руководство по выполнению визуализации. Подробные настройки могут быть изменены между различными настройками микроскопа.

  1. Настройте лазерную сканирующую конфокальную микроскопию с использованием 100-кратного (N.A.1.4) масляного объектива. Откройте программное обеспечение ZEN, чтобы выбрать мощность лазера возбуждения, которая может возбуждать флуоресценцию липидов и белков. Выберите режим получения > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
  2. Отрегулируйте фокусировку с помощью ручки фокусировки, чтобы найти нанобары на чипе до тех пор, пока края нанобара не станут острыми под липидным каналом.
  3. Задайте параметры сканирования, как показано ниже, чтобы получить контрольное изображение липидного канала перед добавлением белка: Размер кадра = 512 px x 512 px (512 пикселей x 512 пикселей, размер пикселя 124 нм), Бит на пиксель = 16 (16-битная глубина), Скорость сканирования = 5 и Усреднение = 4 (режим усреднения четыре раза на строку).
  4. Проведите анализ FRAP путем отбеливания флуоресцентно меченого липидного бислоя на случайной области нанобара.
    1. Установите флажки Области эксперимента и Отбеливание . Нарисуйте круглую область диаметром 5 мкм, которая может включать в себя весь нанобар в центре (размер нанобара составляет 2 мкм) и добавьте к областям эксперимента. Введите параметры покадровой съемки в следующем примере: выберите Скорость сканирования = 9 и Усреднение = 1. Выберите Временной ряд > Длительность = 100 циклов и Интервал = 2 с. Введите параметры отбеливания в следующем примере: установите флажок Начать после # изображений и выберите три изображения.
    2. Установите флажки лазера, которые выполняют FRAP, и измените мощность на 100,0%.. Нажмите кнопку Начать эксперимент для эксперимента FRAP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: FRAP является распространенным методом характеристики подвижности клеточных молекул. Если SLB имеет хорошую текучесть, флуоресценция в обесцвеченной области будет постепенно восстанавливаться, поскольку обесцвеченные флуорофоры диффундируют, а неотбеленные флуорофоры из других областей диффундируют.
  5. Загрузите белковый раствор в камеру PDMS и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить связывание белка на SLB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Белки, используемые на рисунке 2G,H для демонстрации липидного состава, облегчающего связывание белков на нанобар-изогнутых SLOB, составляют 74 мкМ GFP и 79 мкМ GFP-His. Эти два белка являются зелеными флуоресцентными белками без или с His-tag. Белки, используемые для исследования чувствительности кривизны на рисунках 4 и 5, составляют 16 мкМ F-BAR, 16 мкМ IDRFBP17 и 16 мкМ FBAR+IDRFBP17. Эти три белка являются доменами из FBP17, который является типичным белком BAR, который интуитивно предполагается как генераторы кривизны и датчики. Каждый объем белка составляет 20 мкл.
  6. Перефокусируйте нанобары и повторите шаг 4.3, чтобы получить изображения как липидных, так и белковых каналов для обнаружения искривления белка.
  7. Повторите шаг 4.4 для проведения анализа FRAP как на липидном, так и на белковом каналах и выполните покадровую визуализацию для характеристики подвижности белка, чувствительного к кривизне.

5. Повторное использование наночипа

  1. Возьмите наночип пинцетом и аккуратно отсоедините его от камеры PDMS в стакане объемом 50 мл, заполненном деионизированной водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это критический шаг. Предотвратите прикосновение пинцета к наноструктуре и не заставляйте чип отделяться, чтобы избежать трещин.
  2. Тщательно вымойте наночип безводным этанолом, чтобы удалить органические остатки, прикрепленные к поверхности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте чистую папиросную бумагу для удаления воды с поверхности перед мытьем безводным этанолом.
    ВНИМАНИЕ: Безводный этанол является высоколетучим и слегка опасным химическим веществом. Избегайте контакта с кожей и глазами. Используйте его в вытяжном капюшоне с маской и перчатками.
  3. Тщательно вымойте чип большим количеством деионизированной воды, чтобы удалить остаточный этанол. Затем высушите чип феном с 99,9% газообразным азотом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить все следы этанола на чипе, прежде чем переходить к следующему этапу, потому что кислота пираньи может бурно реагировать с органическим растворителем и может вызвать взрывы.
  4. Поместите чип в чистый стакан объемом 10 мл лицом вверх и очистите чип раствором пираньи для повторного использования, которое следует тем же шагам, что и «очистка наночипа».

6. Количественная оценка изображения

  1. Поверните изображения, полученные микроскопом, так, чтобы массив нанобаров находился в вертикальном положении для последующего анализа в программном обеспечении Fiji.
  2. Используйте специально написанный код MATLAB «c_pillarmask_averaging», чтобы найти отдельный нанобар с помощью квадратной маски (51 пиксель x 51 пиксель) как в липидном, так и в белковом канале.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот код MATLAB специально разработан для наночипа. Его можно получить на GitHub по ссылке: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
  3. Вычтите фоновые сигналы каждого изображения с тремя ROI (5 пикселей x 5 пикселей) по углам изображения с помощью функции сетки в коде MATLAB 'BarGra_avg'. Эта операция направлена на исправление потенциальных неравномерных фоновых шумов, вызванных установкой микроскопа или выравниванием чипа на ступени микроскопа.
  4. Генерируйте средние изображения нанобаров одинакового размера, используя код MATLAB «BarGra_avg», где каждая точка является средним значением значений в этой точке во всех отдельных нанобарных квадратных масках. Генерируйте 3D-графики поверхности средних изображений в программном обеспечении Фиджи, чтобы интуитивно показать среднее распределение сигнала вокруг нанобаров. Выберите «Анализировать > поверхностной графике > Input 100 для множителя полигонов» и установите флажки «Тень», «Ось рисования» и «Сглаживание».
  5. Сегментируйте каждый нанобар на три области, которые включают в себя две области нанобара и одну область нанобарного центра, чтобы извлечь их интенсивность флуоресценции соответственно с помощью кода MATLAB «avg_nanobar_quantification». Размеры ROI нанобара корректируются в соответствии с размерами нанобаров с помощью файла «положение».
  6. Разделите интенсивность белка на интенсивность липидов, извлеченных из кода MATLAB «avg_nanobar_quantification» в области стержня, чтобы получить плотность нанобарного конца, которая исключает эффект площади поверхности.
  7. Нанесите на график плотность нанобарного конца с различными концентрациями в GraphPad Prism, чтобы получить кривую связывания. Откройте меню Анализ . Выберите Нелинейная регрессия (подгонка кривой) > Привязка - Насыщенность > Конкретная привязка с функцией наклона Хилла , чтобы соответствовать кривой уравнению Хилла, а затем вычислить значение коэффициента КД и Хилла.
  8. Интенсивность липидов и белков нормализуется до соответствующих им интенсивностей в центре нанобаров 600 нм, полученном на том же изображении с использованием кода MATLAB «avg_nanobar_quantification».
  9. Используйте самые яркие девять пикселей нормализованной интенсивности белка в области нанобара, деленной на область стержневого центра, для количественной оценки искривления белка с нанобарами того же размера, значение называется «отношением конца к центру». Используйте соотношение нормализованной интенсивности белка для нормализации интенсивности липидов для количественной оценки диапазона восприятия кривизны белка с нанобарами разного размера, значение называется «Нормализованная плотность нанобара»... Эти значения вычисляются кодом MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
  10. Загрузите образ стека FRAP в программное обеспечение Fiji. Выберите область FRAP и создайте рентабельность инвестиций. Выберите функцию More > Multi measure для измерения интенсивности области FRAP за каждый раз. Настройте интенсивность в GraphPad Prism для создания кривой восстановления FRAP.

Результаты

Конструкция Nanobar рекомендуется для зондирования белков с положительным измерением кривизны, которая содержит полукруг на каждом конце с кривизной, определяемой шириной нанобара, и один плоский / нулевой контроль кривизны локально в центре (рисунок 2A, B). Успешн?...

Обсуждение

Система nanobar-SLB, описанная здесь, предлагает уникальное сочетание преимуществ в нескольких существующих анализах in vitro. Он эффективно выявляет предпочтительное связывание белков с сильно изогнутыми мембранами в качестве анализа липосомной флоатации или седиментации, но требует г...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей финансовой заинтересованности в этой работе.

Благодарности

Мы благодарим Наньянский нанофабрикационный центр (N2FC) и Центр прорывных фотонных технологий (CDPT) в Наньянском технологическом университете (NTU) за поддержку изготовления наноструктур и визуализации SEM, Платформу производства белка (PPP) в Школе биологических наук NTU для очистки белка и Школу химической и биомедицинской инженерии NTU за конфокальный микроскоп. Эта работа финансируется Министерством образования Сингапура (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 и MOE-T2EP30220-0009), Институтом цифровой молекулярной аналитики и науки (IDMxS), поддерживаемым финансированием MOE по схеме Исследовательских центров передового опыта (W. Zhao), Фондом Human Frontier Science Program (W. Zhao, RGY0088/2021), Грантом NTU Start-up Grant (W. Zhao), Школа химической и биомедицинской инженерии NTU для исследовательской стипендии (X. Miao) и China Scholarship Council для исследовательской стипендии (J. Wu).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anhydrous EthanolSigma-Aldrich100983
Aluminum foilDiamondRN0879999FU
Amber VialSigma-Aldrich27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)Avanti Polar Lipids, Inc.840032
10 mL BeakerSchott-DuranSCOT211060804
50 mL BeakerSchott-DuranSCOT211061706
1000 mL BeakerSchott-DuranSCOT211065408The second container 
ChloroformSigma-AldrichV800117
Cotton budsWatsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)Avanti Polar Lipids, Inc.790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)Avanti Polar Lipids, Inc.840051
F-BARProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
F-BAR+IDRProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
GFPProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
GFP-HisProtein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, SingaporeProteins and peptide
GraphPad PrismGraphPadV9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)Thermo ScientificH325-500
IDR from human FBP17Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJNational Institutes of Health1.50d
Laser Scanning Confocal MicroscopyZeiss LSM 800 with Airyscan100x (N.A.1.4) oil objective.
MethanolFisher scientific10010240
Mini-extuder Avanti Polar Lipids, Inc.610000-1EA
1.5 mL MicrotubesGreiner616201
MATLABMathworksR2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μmWhatman800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS)Life Technologies Holdings Pte Ltd.70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) BaseDow Corning CorporationSYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) CrosslinkerDow Corning CorporationSYLGARD 184
Plasma CleanerHARRICK PLASMAPDC-002-HP
Quartz NanochipDonghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich795429
Sulfuric acidSigma-Aldrich258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium SaltLife Technologies Holdings Pte Ltd.T1395MP
TweezerGooiPDC-002-HP
Ultrasonic CleanersElmaD-78224
VoterxScientific IndustriesG560E
Vacuum DesiccatorNUCERITE5312
Water BathJulaboTW8

Ссылки

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

189in vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены