Липидная двухслойная система с поддержкой нанобара для изучения белков, чувствительных к кривизне мембраны in vitro

Резюме

Здесь разработана липидная бислойная система с поддержкой нанобара, чтобы обеспечить синтетическую мембрану с определенной кривизной, которая позволяет характеризовать белки с способностью зондировать кривизну in vitro.

Аннотация

Кривизна мембраны играет важную роль в различных важных процессах клеток, таких как миграция клеток, деление клеток и перемещение пузырьков. Он не только пассивно генерируется клеточной активностью, но и активно регулирует белковые взаимодействия и участвует во многих внутриклеточных передачах сигналов. Таким образом, большое значение имеет изучение роли кривизны мембран в регулировании распределения и динамики белков и липидов. В последнее время было разработано множество методик для изучения взаимосвязи между изогнутой мембраной и белком in vitro. По сравнению с традиционными методами, недавно разработанный липидный бислой с поддержкой нанобара (SLB) обеспечивает как высокую пропускную способность, так и лучшую точность в генерации кривизны мембраны путем формирования непрерывного липидного бислоя на узорчатых массивах нанобаров с заранее определенной кривизной мембраны и локальным плоским контролем. Как липидная текучесть, так и чувствительность белка к изогнутым мембранам могут быть количественно охарактеризованы с помощью флуоресцентной микроскопии. Здесь представлена подробная процедура формирования SLB на изготовленных стеклянных поверхностях, содержащих нанобарные массивы, и характеристика чувствительных к кривизне белков на таких SLB. Кроме того, рассматриваются протоколы повторного использования наночипов и обработки изображений. Помимо нанобара-SLB, этот протокол легко применим ко всем типам наноструктурированных стеклянных чипов для исследований с измерением кривизны.

Введение

Кривизна мембраны является критическим физическим параметром клетки, который происходит в различных клеточных процессах, таких как морфогенез, деление клеток и миграция клеток¹. В настоящее время широко признано, что кривизна мембраны выходит за рамки простого результата клеточных событий; вместо этого он стал эффективным регулятором белковых взаимодействий и внутриклеточной сигнализации. Например, было обнаружено, что несколько белков, участвующих в клатрин-опосредованном эндоцитозе, предпочтительно связываются с изогнутой мембраной, что приводит к образованию горячей точки для эндоцитоза². Существует много различных пр....

протокол

1. Очистка наночипа

1. Поместите наночип в стакан объемом 10 мл с узорчатой стороной вверх.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот кварцевый наночип был изготовлен с помощью электронно-лучевой литографии, как описано выше²¹. Геометрия и расположение наноструктуры на чипе могут быть разработаны по индивидуальному заказу. Размеры градиентных нанобаров, используемых здесь, составляют 2000 нм в длину, 600 нм в высоту и от 100 до 1000 нм в ширину (шаг 100 нм).
2. Осторожно добавьте 1 мл 98% серной кислоты в стакан и убедитесь, что кислота полностью покрывает переднюю и заднюю стороны чипа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 98% серная кислота чрезв....

Результаты

Конструкция Nanobar рекомендуется для зондирования белков с положительным измерением кривизны, которая содержит полукруг на каждом конце с кривизной, определяемой шириной нанобара, и один плоский / нулевой контроль кривизны локально в центре (рисунок 2A, B). Успешн?.......

Обсуждение

Система nanobar-SLB, описанная здесь, предлагает уникальное сочетание преимуществ в нескольких существующих анализах in vitro. Он эффективно выявляет предпочтительное связывание белков с сильно изогнутыми мембранами в качестве анализа липосомной флоатации или седиментации, но требует г.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous Ethanol	Sigma-Aldrich	100983
Aluminum foil	Diamond	RN0879999FU
Amber Vial	Sigma-Aldrich	27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840032
10 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211060804
50 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211061706
1000 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211065408	The second container
Chloroform	Sigma-Aldrich	V800117
Cotton buds	Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840051
F-BAR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
F-BAR+IDR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP-His	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GraphPad Prism	GraphPad	V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)	Thermo Scientific	H325-500
IDR from human FBP17	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ	National Institutes of Health	1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	LSM 800 with Airyscan	100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol	Fisher scientific	10010240
Mini-extuder	Avanti Polar Lipids, Inc.	610000-1EA
1.5 mL Microtubes	Greiner	616201
MATLAB	Mathworks	R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm	Whatman	800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS)	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Plasma Cleaner	HARRICK PLASMA	PDC-002-HP
Quartz Nanochip	Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	T1395MP
Tweezer	Gooi	PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners	Elma	D-78224
Voterx	Scientific Industries	G560E
Vacuum Desiccator	NUCERITE	5312
Water Bath	Julabo	TW8