Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Zusammenfassung

Hier wird ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem entwickelt, um eine synthetische Membran mit einer definierten Krümmung bereitzustellen, die die Charakterisierung von Proteinen mit Krümmungssensorik in vitro ermöglicht.

Zusammenfassung

Die Membrankrümmung spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen essentiellen Prozessen von Zellen, wie Zellmigration, Zellteilung und Vesikeltransport. Es wird nicht nur passiv durch zelluläre Aktivitäten erzeugt, sondern reguliert auch aktiv Proteininteraktionen und ist an vielen intrazellulären Signalen beteiligt. Daher ist es von großem Wert, die Rolle der Membrankrümmung bei der Regulierung der Verteilung und Dynamik von Proteinen und Lipiden zu untersuchen. In jüngster Zeit wurden viele Techniken entwickelt, um die Beziehung zwischen der gekrümmten Membran und dem Protein in vitro zu untersuchen. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken bietet die neu entwickelte nanobar-gestützte Lipiddoppelschicht (SLB) sowohl einen hohen Durchsatz als auch eine bessere Genauigkeit bei der Erzeugung von Membrankrümmungen, indem sie eine kontinuierliche Lipiddoppelschicht auf strukturierten Arrays von Nanobarren mit einer vordefinierten Membrankrümmung und lokaler flacher Kontrolle bildet. Sowohl die Lipidfluidität als auch die Proteinempfindlichkeit gegenüber gekrümmten Membranen können mittels fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung quantitativ charakterisiert werden. Hier wird ein detailliertes Verfahren zur Bildung eines SLB auf hergestellten Glasoberflächen mit Nanobar-Arrays und zur Charakterisierung krümmungsempfindlicher Proteine auf solchen SLB vorgestellt. Darüber hinaus werden Protokolle für die Wiederverwendung von Nanochips und die Bildverarbeitung behandelt. Über den Nanobar-SLB hinaus ist dieses Protokoll leicht auf alle Arten von nanostrukturierten Glaschips für Krümmungsstudien anwendbar.

Einleitung

Die Membrankrümmung ist ein kritischer physikalischer Parameter einer Zelle, der bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Morphogenese, Zellteilung und Zellmigration auftritt¹. Es ist heute allgemein anerkannt, dass die Membrankrümmung über ein einfaches Ergebnis zellulärer Ereignisse hinausgeht; Stattdessen hat es sich als wirksamer Regulator von Proteininteraktionen und intrazellulären Signalen herausgestellt. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass mehrere Proteine, die an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligt sind, bevorzugt an die gekrümmte Membran binden, was zur Bildung eines Hotspots für Endozytose² führt. Es gibt viele verschiedene Ursachen für die Membranverformung wie das Ziehen der Membran durch die Zytoskelettkräfte, das Vorhandensein von Lipidasymmetrie mit unterschiedlich großen Kopfgruppen, das Vorhandensein von Transmembranproteinen mit konischer Form, die Akkumulation von membranformenden Proteinen wie BAR-Domänenproteinen (benannt nach Bin-, Amphiphysin- und Rvs-Proteinen) und das Einfügen amphipathischer Helices-Domäne in die Membran¹ . Interessanterweise verformen diese Proteine und Lipide nicht nur die Membran, sondern können auch die Membrankrümmung wahrnehmen und eine bevorzugte Akkumulation aufweisen¹. Daher ist es entscheidend zu untersuchen, ob und wie Membranen mit unterschiedlichen Krümmungen die Verteilung und Dynamik der an sie gebundenen Proteine und Lipide verändern und welche Auswirkungen dies auf die damit verbundenen intrazellulären Prozesse haben kann.

Viele Techniken wurden entwickelt, um die Interaktion zwischen gekrümmter Membran und Proteinen sowohl in lebenden Zell- als auch in In-vitro-Systemen zu analysieren. Das Lebendzellsystem bietet eine reale Zellumgebung mit reicher Lipiddiversität und dynamischer Proteinsignalregulation 2,3,4,5,6,7. Ein solch ausgeklügeltes System ist jedoch aufgrund der Unsicherheiten und Schwankungen in der intrazellulären Umgebung schwer zu untersuchen. Daher sind die In-vitro-Assays mit einer künstlichen Membran, die aus bekannten Lipidspezies und gereinigten Proteinen besteht, zu leistungsfähigen Rekonstitutionssystemen geworden, um die Beziehung zwischen Proteinen und gekrümmten Membranen zu charakterisieren. Herkömmlicherweise werden Liposomen unterschiedlicher Durchmesser durch Extrusion erzeugt, um krümmungsempfindliche Proteine entweder über einen Co-Sedimentationsassay mit Zentrifugalkraft oder einen Coflotationsassay mit einem Dichtegradienten zu detektieren, um eine Proteinaggregation zu vermeiden ^8,9. Die Krümmung der extrudierten Liposomen ist jedoch durch die verfügbare Porengröße des im Extruder¹⁰ verwendeten Membranfilters begrenzt. Es wurde nachgewiesen, dass der Single Liposome Curvature (SLiC) Assay diese Einschränkung überwindet, bei der Liposomen mit unterschiedlichen Durchmessern fluoreszenzmarkiert und auf der Oberfläche immobilisiert werden, so dass die Krümmung durch die Fluoreszenzintensität markiert werden kann¹¹. Es wurde jedoch eine starke Variabilität der Lipidzusammensetzung in kleinen Vesikeln beobachtet, was die Genauigkeit der Krümmungsmessung beeinflusst¹². Tether-Pulling-Experimente liefern eine genauere Messung der Krümmung des transienten Seils, das von riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) gezogen wird, mit einer optischen Pinzette, bei der die Krümmung durch die erzeugte Membranspannung gut gesteuert werden kann^13,14. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung von Proteinen mit positiver oder negativer Krümmung, ist jedoch durch den Durchsatz der Röhrchenerzeugung¹⁰ eingeschränkt. Der SMrT-Assay (Supported Membrane Tubes) ermöglicht die gleichzeitige Erzeugung mehrerer Membranröhren, die durch mikrofluidische Strömungen aus demselben Lipidreservoir extrudiert werden. Dennoch variiert die Membrankrümmung intrinsisch entlang der Nanoröhre, was die Genauigkeit der fluoreszenzintensitätsbasierten Krümmungsmessung^{beeinträchtigt 15,16}. Im Vergleich dazu erzeugte die Verwendung kleiner unilamellärer Vesikel (SUVs, Durchmesser <100 nm¹⁷) zur Bildung einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) auf Oberflächen, die entworfene Topographien enthielten, eine einzelne Doppelschichtmembran mit Krümmungen, die durch Nanofabrikation oder Nanomaterialien in hoher Genauigkeit vorbestimmt^{waren 18,19,20}.

Hier stellen wir ein Protokoll für die Bildung des SLB auf hergestellten Nanochip-Oberflächen mit Nanobar-Arrays vor und wie damit die Krümmungsempfindlichkeit von Proteinen in vitro untersucht werden kann. Wie in Abbildung 1 gezeigt, gibt es sechs wesentliche Komponenten des Assays: A) Reinigung und Montage des Chips mit einer mikrofluidischen Kammer; B) Herstellung von SUVs mit definierter Lipidzusammensetzung; C) Bildung des SLB auf einem Nanochip und Bindung an krümmungsempfindliche Proteine; D) Bildgebung und Charakterisierung der SLB- und krümmungsempfindlichen Proteine mittels Fluoreszenzmikroskopie; E) Reinigung des Chips zur Wiederverwendung; F) Bildverarbeitung zur quantitativen Analyse der Proteinkrümmungsfähigkeit. Das detaillierte Protokoll wird im Folgenden Schritt für Schritt beschrieben.

Protokoll

1. Reinigung des Nanochips

1. Legen Sie den Nanochip mit der gemusterten Seite nach oben in ein 10-ml-Becherglas.
   HINWEIS: Dieser Quarz-Nanochip wurde mittels Elektronenstrahllithographie hergestellt, wie zuvor^{beschrieben 21}. Die Geometrie und Anordnung der Nanostruktur auf dem Chip kann kundenspezifisch gestaltet werden. Die Größen der hier verwendeten Gradienten-Nanobarren betragen 2000 nm Länge, 600 nm Höhe und 100 bis 1000 nm Breite (100 nm Step-Set).
2. Geben Sie vorsichtig 1 ml 98% Schwefelsäure in das Becherglas und stellen Sie sicher, dass die Säure die Vorder- und Rückseite des Chips vollständig bedeckt.
   HINWEIS: 98% Schwefelsäure ist extrem ätzend und kann bei Kontakt mit Haut oder Augen zu schneller Gewebezerstörung und schweren chemischen Verbrennungen führen. Verwenden Sie es im Abzug mit angemessenem Schutz.
3. Drehen Sie das Becherglas langsam und fügen Sie 200 μL 30% Wasserstoffperoxid Tropfen für Tropfen hinzu, bis das ganze Becherglas heiß wird. Stellen Sie sicher, dass Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid gut gemischt sind, um Piranha-Lösung zur Entfernung organischer Moleküle aus dem Nanochip¹⁷ zu bilden. Es gibt alternative Techniken zur Erzeugung des SLB auf sauberen hydrophilen Oberflächen, wie UV-Licht und Ozonbelastung, wie zuvor beschrieben²³.
   HINWEIS: Die Reaktion ist extrem exotherm und kann dazu führen, dass die Lösung kocht, also fügen Sie der Schwefelsäure Tropfen für Tropfen Wasserstoffperoxid hinzu und drehen Sie sich weiter.
4. Stellen Sie das Becherglas in einen sekundären Glasbehälter und lassen Sie den Nanochip über Nacht in die Piranha-Lösung eintauchen, um die Verunreinigungen gründlich zu reinigen.
   HINWEIS: Stellen Sie das Becherglas ohne Abdeckung in den Abzug, falls die Reaktion Gas erzeugen kann.
5. Nehmen Sie das Becherglas heraus und pipetten Sie die Piranha-Lösung vorsichtig in einen sauren Abfallbehälter.
6. Laden Sie 5 ml entionisiertes Wasser in das Becherglas, um die Restsäure zu verdünnen und in den sauren Abfall zu werfen. Wiederholen Sie diesen Schritt fünfmal und verwenden Sie 5 M NaOH, um den sauren Abfall zu neutralisieren.
7. Nehmen Sie den Chip mit einer Pinzette und waschen Sie ihn mit einem kontinuierlichen Strom von entionisiertem Wasser, um Restsäure gründlich zu entfernen. Föhnen Sie den Chip mit 99,9% Stickstoffgas für SLB-Bildung²².

2. Erzeugung kleiner unilamellärer Vesikel (SUVs)

1. 100 μL Chloroform in eine bernsteinfarbene Durchstechflasche geben.
   HINWEIS: Chloroform ist eine leicht flüchtige, farblose Flüssigkeit und kann beim Einatmen oder Verschlucken giftig sein. Verwenden Sie es im Abzug mit Maske und Handschuhen.
2. 500 μg der Lipidmischung werden in Chloroform gelöst. Die Zusammensetzung der hier verwendeten Lipidmischung beträgt 89,5 Mol-% Ei-Phosphatidylcholin (PC), 10 Mol-% Hirnphosphatidylserin (PS) und 0,5 Mol-% Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin, Triethylammoniumsalz (Texas Red DHPE).
3. Föhnen Sie das Lipidgemisch in der Durchstechflasche mit 99,9% Stickstoffgas, bis sich das Chloroform verflüchtigt hat und das Lipidgemisch trocken ist.
   HINWEIS: Dieser Schritt sollte im Abzug durchgeführt werden. Vermeiden Sie Flüssigkeitsspritzer beim Föhnen.
4. Legen Sie die in der bernsteinfarbenen Durchstechflasche vorhandene Lipidmischung ohne Deckel in den mit Aluminiumfolie überzogenen Vakuum-Exsikkator. Anschließend wird die Probe mit einer Pumpe für 3 h vakuumgetrocknet, um das Chloroform vollständig zu verflüchtigen.
5. Geben Sie 250 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Durchstechflasche. Wirbeln Sie die Lösung, bis sie homogen ist.
   HINWEIS: PBS-Puffer besteht aus 150 mM NaCl, ohne Kalzium, Magnesium und Phenolrot; Der pH-Wert wird auf 7,2 eingestellt, um die PC- und PS-Lipiddoppelschicht herzustellen.
6. Sonisieren Sie die Lipidmischung für 30 min bei einer Frequenz von 50 kHz in einem Badsonicator. Anschließend wird die Lipidmischung in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen überführt und mit Parafilm versiegelt.
7. Das Lipidgemisch in flüssigem Stickstoff für 20 s einfrieren und dann bei 42 °C für 2 min im Wasserbad auftauen. Wiederholen Sie die Gefrier-Tau-Zyklen 30 Mal. Danach sieht die Lipidmischung wie eine klare Flüssigkeit aus.
   ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff hat einen Siedepunkt von etwa −195,8 °C. Es kann Erfrierungen oder kryogene Verbrennungen verursachen. Verwenden Sie es im unbeschränkten Raum mit Wärmeisolierhandschuhen.
8. Spülen Sie zwei gasdichte Glasspritzen und den Anschluss des Mini-Extruders mit Ethanol, Chloroform bzw. Methanol aus. Wiederholen Sie die Spülsequenz fünfmal, um das Gerät vorzureinigen. Lassen Sie sie im Abzug, bis das organische Lösungsmittel vollständig verflüchtigt ist.
9. Montieren Sie die Mini-Extrudervorrichtung, führen Sie 500 μL PBS-Puffer durch den Stecker, um die Vorbefeuchtung der Apparatur vorzubenetzen, und entsorgen Sie dann den Puffer aus einer anderen Spritze. Dieser Schritt entfernt Verunreinigungen und erleichtert die Extrusion.
10. Bestücken Sie die Mini-Extruder-Apparatur mit einer porengroßen Polycarbonat-Filtermembran von 100 nm.
    HINWEIS: Die Porengröße der Filtermembran bestimmt den Durchmesser der Liposomen.
11. Nehmen Sie 500 μL PBS-Puffer mit einer der Spritzen und drücken Sie sie vorsichtig durch den Filter, um die zweite leere Spritze am anderen Ende zu füllen. Wiederholen Sie die Extrusion dreimal hin und her, um die Leckage des Geräts zu überprüfen, und entsorgen Sie den Puffer aus der zweiten Spritze.
12. Lassen Sie die Lipidmischung durch den Mini-Extruder, um den PBS-Puffer zu ersetzen. Dann extrudieren Sie 20 Mal hin und her, um SUVs zu bilden. Der mehrschalige Charakter der Vesikel kann bei unzureichender Anzahl von Extrusionszeiten erhalten bleiben, was die SLB-Bildung^{beeinflusst 23}.
13. Sammeln Sie die SUVs aus der zweiten Spritze, um die Kontamination mit größeren Partikeln zu reduzieren, und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
    HINWEIS: Entfernen Sie die Spritze gerade aus dem Stecker, falls die Spritze abbricht.
14. Wickeln Sie das Röhrchen mit Aluminiumfolie ein, um ein Bleichen von fluoreszierend markierten Lipiden zu verhindern, und lagern Sie sie bei 4 °C. In der Regel können die SUVs bis zu 7 Tage gelagert werden.

3. Bildung des SLB auf einem Nanochip

1. Den gereinigten Nanochip vorsichtig mit einer Pinzette aus entionisiertem Wasser herausnehmen und mit 99,9% Stickstoffgas föhnen.
2. Führen Sie die Oberflächenreinigung des Nanochips mit Luftplasmabehandlung für 1 h durch.
3. Montieren Sie den Nanochip in einer Polydimethylsiloxankammer (PDMS), die aus zwei PDMS-Teilen besteht - einem mittleren PDMS und einem oberen PDMS (Abbildung 1A). Das mittlere PDMS ist dünn (~ 0,5 mm) mit einer großen ovalen Öffnung in der Mitte, um eine ausreichende Exposition gegenüber dem Nanobalkenmuster zu gewährleisten. Das obere PDMS ist dick (~ 4,0 mm) mit zwei kleinen Löchern in der großen ovalen Öffnung als Einlass und Auslass für Liquid Handling.
   1. Legen Sie den Chip auf eine saubere Oberfläche mit dem Muster nach oben.
   2. Decken Sie das mittlere PDMS vorsichtig mit dem Chip ab und stellen Sie sicher, dass das gesamte Muster dem zentralen Bereich der großen ovalen Öffnung im mittleren PDMS ausgesetzt ist.
   3. Decken Sie das obere PDMS mit dem mittleren PDMS ab und halten Sie seine beiden kleinen Löcher im Bereich des großen ovalen Lochs des mittleren PDMS. Dann wird die PDMS-Kammer zusammengebaut.
      HINWEIS: PDMS ist das am weitesten verbreitete organische Polymer auf Siliziumbasis. Es ist biokompatibel, transparent und verformbar, um als kundenspezifische Form für die Chipmontage und Bildgebung unter dem Mikroskop entworfen zu werden. Noch wichtiger ist, dass es nach der Plasmabehandlung kovalent auf eine andere PDMS-Schicht oder ein Glas geklebt werden kann, wodurch es sich als Kammer zur Vorbereitung des SLB eignet. Dieser Schritt stellt sicher, dass jede PDMS-Schicht fest sitzt, um Lücken und Leckagen zu vermeiden.
4. Laden Sie die SUVs aus einem der beiden kleinen Löcher im oberen PDMS mit einer Pipette in die PDMS-Kammer und inkubieren Sie 15 min bei Raumtemperatur, um den SLB zu bilden.
5. Pipettieren Sie den PBS-Puffer vorsichtig von einer Seite des kleinen Lochs in die PDMS-Kammer und entfernen Sie den Abfall mit einem Wattestäbchen aus dem anderen Loch, um die ungebundenen SUVs wegzuwaschen. Dann erfassen Sie das auf dem Nanochip gebildete SLB (die Qualität des SLB wird durch Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleiche (FRAP) getestet, wie in Schritt 4.4 gezeigt und im Abschnitt über die repräsentativen Ergebnisse diskutiert).
   HINWEIS: Wenn Sie den PBS-Puffer in die Kammer pipettieren, sollte die Pipettenspitze voll mit dem Puffer und in Kontakt mit der Flüssigkeitsoberfläche sein, um eine Injektion von Blasen zu vermeiden.

4. Abbildung der SLB- und Krümmungsproteinbindung auf dem Nanochip

HINWEIS: Dieser Abschnitt hängt von dem für das Experiment verfügbaren Mikroskopsystem ab. Hier wird eine allgemeine Richtlinie zur Durchführung der Bildgebung beschrieben. Die Detaileinstellungen können zwischen den verschiedenen Mikroskopaufbauten geändert werden.

1. Richten Sie die konfokale Laserscanning-Mikroskopie mit einem 100-fachen (N.A.1.4) Ölobjektiv ein. Öffnen Sie die ZEN-Software, um die Anregungslaserleistung auszuwählen, die die Fluoreszenz des Lipids und des Proteins anregen kann. Wählen Sie den Erfassungsmodus > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
2. Stellen Sie den Fokus mit dem Fokusknopf ein, um die Nanobalken auf dem Chip zu lokalisieren, bis die Nanobalkenkanten unter dem Lipidkanal scharf sind.
3. Stellen Sie die Scanparameter wie folgt ein, um vor dem Hinzufügen von Protein ein Kontrollbild des Lipidkanals zu erhalten: Bildgröße = 512 px x 512 px (512 Pixel x 512 Pixel, eine Pixelgröße von 124 nm), Bits pro Pixel = 16 (16-Bit-Tiefe), Scangeschwindigkeit = 5 und Mittelwertbildung = 4 (Mittelungsmodus von vier Mal/Zeile).
4. Führen Sie den FRAP-Assay durch, indem Sie die fluoreszierend markierte Lipiddoppelschicht auf einem zufälligen einzelnen Nanobarbereich bleichen.
   1. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Experimentbereiche und Bleichen. Zeichnen Sie eine kreisförmige Fläche von 5 μm Durchmesser, die den gesamten Nanobar in der Mitte umfassen kann (Nanobargröße ist 2 μm) und fügen Sie sie den Experimentbereichen hinzu. Geben Sie Zeitraffer-Bildgebungsparameter wie im folgenden Beispiel ein: Wählen Sie Scangeschwindigkeit = 9 und Mittelwertbildung = 1. Wählen Sie Zeitreihe > Dauer = 100 Zyklen und Intervall = 2 s. Geben Sie Bleichparameter wie im folgenden Beispiel ein: Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Start nach # Bildern und wählen Sie drei Bilder aus.
   2. Aktivieren Sie die Laser-Kontrollkästchen, die FRAP ausführen, und ändern Sie die Leistung auf 100,0%. Klicken Sie für den FRAP-Test auf Test starten .
      HINWEIS: FRAP ist eine gängige Methode zur Charakterisierung der Mobilität zellulärer Moleküle. Wenn der SLB eine gute Fließfähigkeit aufweist, erholt sich die Fluoreszenz im gebleichten Bereich allmählich, da gebleichte Fluorophore diffundieren und ungebleichte Fluorophore aus anderen Bereichen eindiffundieren.
5. Laden Sie die Proteinlösung in die PDMS-Kammer und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur, um die Bindung des Proteins an das SLB zu ermöglichen.
   HINWEIS: Die Proteine, die in Abbildung 2G,H verwendet werden, um die Lipidzusammensetzung zu demonstrieren, die die Proteinbindung auf nanobar-gekrümmten SLBs erleichtern, sind 74 μM GFP und 79 μM GFP-His. Diese beiden Proteine sind grüne Fluoreszenzproteine ohne oder mit His-Tag. Die Proteine, die für die Krümmungssensorstudie in Abbildung 4 und Abbildung 5 verwendet werden, sind 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 und 16 μM FBAR+^{IDR FBP17}. Diese drei Proteine sind die Domänen von FBP17, einem typischen BAR-Protein, das intuitiv sowohl als Krümmungsgeneratoren als auch als Sensoren angenommen wird. Jedes Proteinvolumen beträgt 20 μL.
6. Fokussieren Sie die Nanobalken erneut und wiederholen Sie Schritt 4.3, um Bilder von Lipid- und Proteinkanälen für die Erkennung von Proteinkrümmungen aufzunehmen.
7. Wiederholen Sie Schritt 4.4, um den FRAP-Assay sowohl auf Lipid- als auch auf Proteinkanälen durchzuführen und Zeitrafferaufnahmen durchzuführen, um die Mobilität des Krümmungssensorproteins zu charakterisieren.

5. Wiederverwendung von Nanochips

1. Greifen Sie den Nanochip mit einer Pinzette und lösen Sie ihn vorsichtig aus der PDMS-Kammer in einem 50-ml-Becherglas, das mit entionisiertem Wasser gefüllt ist.
   HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. Verhindern Sie, dass die Pinzette die Nanostruktur berührt, und zwingen Sie den Chip nicht, sich zu trennen, um Risse zu vermeiden.
2. Waschen Sie den Nanochip gründlich mit wasserfreiem Ethanol, um organische Rückstände auf der Oberfläche zu entfernen.
   HINWEIS: Verwenden Sie sauberes Seidenpapier, um Wasser auf der Oberfläche zu entfernen, bevor Sie mit wasserfreiem Ethanol waschen.
   ACHTUNG: Wasserfreies Ethanol ist eine leicht flüchtige und leicht gefährliche Chemikalie. Kontakt mit Haut und Augen vermeiden. Verwenden Sie es im Abzug mit Maske und Handschuhen.
3. Waschen Sie den Chip gründlich mit viel entionisiertem Wasser, um Ethanolreste zu entfernen. Anschließend föhnen Sie den Chip mit 99,9% Stickstoffgas.
   HINWEIS: Es ist wichtig, alle Spuren von Ethanol auf dem Chip zu entfernen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, da die Piranhasäure heftig mit organischem Lösungsmittel reagieren und Explosionen verursachen kann.
4. Legen Sie den Chip in ein sauberes 10-ml-Becherglas mit der Musterseite nach oben und reinigen Sie den Chip mit Piranha-Lösung zur Wiederverwendung, die den gleichen Schritten wie bei der "Reinigung des Nanochips" folgt.

6. Bildquantifizierung

1. Drehen Sie die von einem Mikroskop aufgenommenen Bilder, so dass sich das Nanobar-Array in einer vertikalen Position für die anschließende Analyse in der Fidschi-Software befindet.
2. Verwenden Sie einen speziell geschriebenen MATLAB-Code "c_pillarmask_averaging", um den einzelnen Nanobalken durch eine quadratische Maske (51 Pixel x 51 Pixel) sowohl im Lipidkanal als auch im Proteinkanal zu lokalisieren.
   HINWEIS: Dieser MATLAB-Code wurde speziell für den Nanochip entwickelt. Es kann auf GitHub über den Link: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX bezogen werden.
3. Subtrahieren Sie die Hintergrundsignale jedes Bildes mit den drei ROIs (5 Pixel x 5 Pixel) an den Ecken des Bildes durch die Meshgrid-Funktion im MATLAB-Code 'BarGra_avg'. Diese Operation zielt darauf ab, mögliche ungleichmäßige Hintergrundgeräusche zu korrigieren, die durch den Mikroskopaufbau oder die Spannivellierung auf dem Mikroskoptisch verursacht werden.
4. Generieren Sie die durchschnittlichen Bilder der gleich großen Nanobar mit dem MATLAB-Code "BarGra_avg", wobei jeder Punkt der Mittelwert der Werte an diesem Punkt in allen einzelnen Nanobar-Quadratmasken ist. Generieren Sie 3D-Oberflächendiagramme der durchschnittlichen Bilder in der Fidschi-Software, um die durchschnittliche Signalverteilung um die Nanobalken intuitiv darzustellen. Wählen Sie Analysieren > Flächenplot > Eingabe 100 für Polygonmultiplikator aus, und aktivieren Sie die Kontrollkästchen Schattierung, Achse zeichnen und Glätten.
5. Segmentieren Sie jeden Nanobar in drei Bereiche, die zwei Nanobar-Endbereiche und einen Nanobar-Center-Bereich umfassen, um ihre Fluoreszenzintensitäten jeweils durch den MATLAB-Code "avg_nanobar_quantification" zu extrahieren. Die Größen der Nanobar-ROIs werden entsprechend der Abmessung der Nanobarren mithilfe der Datei "Position" angepasst.
6. Teilen Sie die Proteinintensitäten durch die Lipidintensitäten, die aus dem MATLAB-Code "avg_nanobar_quantification" im Balkenendbereich extrahiert werden, um die Nanobar-Enddichte zu erhalten, die den Oberflächeneffekt ausschließt.
7. Zeichnen Sie die Nanobar-Enddichte mit unterschiedlichen Konzentrationen in GraphPad Prism, um die Bindungskurve zu erhalten. Öffnen Sie das Menü Analysieren . Wählen Sie Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) > Bindung - Sättigung > Spezifische Bindung mit Hill-Steigungsfunktion , um die Kurve an die Hill-Gleichung anzupassen, und berechnen Sie dann den KD- und Hill-Koeffizientenwert.
8. Die Lipid- und Proteinintensitäten werden auf ihre entsprechenden Intensitäten am 600-nm-Nanobarzentrum normalisiert, das im selben Bild mit dem MATLAB-Code "avg_nanobar_quantification" aufgenommen wurde.
9. Verwenden Sie die hellsten neun Pixel normalisierter Proteinintensitäten im Nanobar-Endbereich geteilt durch den Bar-Center-Bereich, um die Proteinkrümmungserfassung mit gleich großen Nanobarren zu quantifizieren, der Wert wird als "End-to-Center-Verhältnis" bezeichnet. Verwenden Sie das Verhältnis der normalisierten Proteinintensität zur Normalisierung der Lipidintensität, um den Erfassungsbereich der Proteinkrümmung mit unterschiedlich großen Nanobar zu quantifizieren, der Wert wird als "Normalized Nanobar-End Density" bezeichnet. Diese Werte werden durch den MATLAB-Code 'avg_nanobar_quantification' berechnet.
10. Laden Sie das FRAP-Stack-Image in die Fidschi-Software. Wählen Sie den FRAP-Bereich und generieren Sie einen ROI. Wählen Sie die Funktion Mehr > Multi messen, um die Intensität des FRAP-Bereichs für jedes Mal zu messen. Zeichnen Sie die Intensität in GraphPad Prism, um die FRAP-Erholungskurve zu generieren.

Ergebnisse

Das Nanobar-Design wird für die Untersuchung positiver Krümmungssensorproteine empfohlen, die an jedem Ende einen Halbkreis mit einer Krümmung enthalten, die durch die Nanobarbreite definiert ist, und eine flache / Nullkrümmungskontrolle lokal in der Mitte (Abbildung 2A, B). Die erfolgreiche Bildung des SLB auf Nanobarren führt zu gleichmäßig verteilten Lipidmarkersignalen über die gesamte Nanobar-Oberfläche, wie in Abbildung 2C gezeigt...

Diskussion

Das hier beschriebene Nanobar-SLB-System bietet eine einzigartige Kombination der Vorteile in mehreren bestehenden in vitro Assays. Es zeigt effizient die bevorzugte Bindung von Proteinen an stark gekrümmte Membranen als Liposomenfloatations- oder Sedimentationsassay, benötigt jedoch viel weniger Proben und bietet eine genauer definierte Krümmung auf einzelnen Nanobars ^8,29. Es bietet auch eine breite Palette von präzise kontrollierten Krümmungen f?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous Ethanol	Sigma-Aldrich	100983
Aluminum foil	Diamond	RN0879999FU
Amber Vial	Sigma-Aldrich	27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840032
10 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211060804
50 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211061706
1000 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211065408	The second container
Chloroform	Sigma-Aldrich	V800117
Cotton buds	Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840051
F-BAR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
F-BAR+IDR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP-His	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GraphPad Prism	GraphPad	V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)	Thermo Scientific	H325-500
IDR from human FBP17	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ	National Institutes of Health	1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	LSM 800 with Airyscan	100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol	Fisher scientific	10010240
Mini-extuder	Avanti Polar Lipids, Inc.	610000-1EA
1.5 mL Microtubes	Greiner	616201
MATLAB	Mathworks	R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm	Whatman	800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS)	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Plasma Cleaner	HARRICK PLASMA	PDC-002-HP
Quartz Nanochip	Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	T1395MP
Tweezer	Gooi	PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners	Elma	D-78224
Voterx	Scientific Industries	G560E
Vacuum Desiccator	NUCERITE	5312
Water Bath	Julabo	TW8