Um Sistema de Bicamada Lipídica Suportado por Nanobar para o Estudo de Proteínas de Detecção de Curvatura de Membrana in vitro

Resumo

Aqui, um sistema de bicamada lipídica suportado por nanobar é desenvolvido para fornecer uma membrana sintética com uma curvatura definida que permite a caracterização de proteínas com capacidade de detecção de curvatura in vitro.

Resumo

A curvatura da membrana desempenha papéis importantes em vários processos essenciais das células, como migração celular, divisão celular e tráfico de vesículas. Não é apenas gerado passivamente por atividades celulares, mas também regula ativamente as interações proteicas e está envolvido em muitas sinalizações intracelulares. Assim, é de grande valor examinar o papel da curvatura da membrana na regulação da distribuição e dinâmica de proteínas e lipídios. Recentemente, muitas técnicas foram desenvolvidas para estudar a relação entre a membrana curva e a proteína in vitro. Em comparação com as técnicas tradicionais, a recém-desenvolvida bicamada lipídica suportada por nanobarras (SLB) oferece alto rendimento e melhor precisão na geração de curvatura de membrana, formando uma bicamada lipídica contínua em matrizes padronizadas de nanobarras com uma curvatura de membrana pré-definida e controle plano local. Tanto a fluidez lipídica quanto a sensibilidade proteica a membranas curvas podem ser quantitativamente caracterizadas usando microscopia de fluorescência. Aqui, um procedimento detalhado sobre como formar um SLB em superfícies de vidro fabricadas contendo matrizes de nanobarras e a caracterização de proteínas sensíveis à curvatura em tal SLB são introduzidos. Além disso, os protocolos para reutilização de nanochips e processamento de imagens são cobertos. Além do nanobar-SLB, este protocolo é prontamente aplicável a todos os tipos de chips de vidro nanoestruturados para estudos de detecção de curvatura.

Introdução

A curvatura da membrana é um parâmetro físico crítico de uma célula que ocorre em uma variedade de processos celulares, como morfogênese, divisão celular e migração celular¹. É amplamente reconhecido agora que a curvatura da membrana está além de um simples resultado de eventos celulares; em vez disso, emergiu como um regulador eficaz das interações proteicas e da sinalização intracelular. Por exemplo, várias proteínas envolvidas na endocitose mediada por clatrina se ligam preferencialmente à membrana curva, resultando na formação de um hotspot para endocitose². Existem muitas causas diferentes de deformação da membrana, como a tração da membrana pelas forças do citoesqueleto, a presença de assimetria lipídica com grupos de cabeça de diferentes tamanhos, a existência de proteínas transmembranares com forma cônica, o acúmulo de proteínas modeladoras de membrana, como proteínas do domínio BAR (nomeadas após as proteínas Bin, anfifisina e Rvs) e a inserção do domínio das hélices anfipáticas na membrana¹ . Curiosamente, essas proteínas e lipídios não apenas deformam a membrana, mas também podem sentir a curvatura da membrana e exibir acúmulo preferencial¹. Portanto, é crucial estudar se e como membranas com diferentes curvaturas alteram a distribuição e a dinâmica de proteínas e lipídios ligados a elas e os impactos potenciais nos processos intracelulares relacionados.

Muitas técnicas foram desenvolvidas para analisar a interação entre membrana curva e proteínas em sistemas celulares vivos e in vitro. O sistema celular vivo proporciona um ambiente celular real com rica diversidade lipídica e regulação dinâmica da sinalização proteica 2,3,4,5,6,7. No entanto, um sistema tão sofisticado é difícil de estudar devido às incertezas e flutuações no ambiente intracelular. Assim, os ensaios in vitro utilizando uma membrana artificial composta por espécies lipídicas conhecidas e proteínas purificadas tornaram-se poderosos sistemas de reconstituição para caracterizar a relação entre proteínas e membranas curvas. Tradicionalmente, lipossomas de diferentes diâmetros são gerados por extrusão para detectar proteínas sensíveis à curvatura por meio de um ensaio de co-sedimentação usando força centrífuga ou um ensaio de co-flotação com um gradiente de densidade para evitar a agregação de proteínas ^8,9. No entanto, a curvatura dos lipossomas extrudados é limitada pelo tamanho dos poros disponíveis do filtro de membrana utilizado na extrusora¹⁰. Está comprovado que o ensaio de curvatura de lipossomo único (SLiC) supera essa limitação, no qual lipossomas com diferentes diâmetros são marcados com fluorescência e imobilizados na superfície para que a curvatura possa ser marcada pela intensidade fluorescente¹¹. Entretanto, tem sido observada forte variabilidade na composição lipídica em pequenas vesículas, o que afeta a acurácia da medida da curvatura¹². Experimentos de puxar amarração fornecem uma medida mais precisa da curvatura na corda transitória puxada de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) usando um tweezer óptico, onde a curvatura pode ser bem controlada pela tensão da membrana gerada^13,14. Este método é adequado para estudar proteínas de detecção de curvatura positiva ou negativa, mas é limitado pelo rendimento da geração de tubos¹⁰. O ensaio de tubos de membrana suportados (SMrT) permite a geração simultânea de múltiplos tubos de membrana que são extrudados do mesmo reservatório lipídico por fluxos microfluídicos. No entanto, a curvatura da membrana varia intrinsecamente ao longo do nanotubo, o que compromete a precisão da medida da curvatura baseada na intensidade de fluorescência^15,16. Em comparação, a utilização de pequenas vesículas unilamelares (SUVs, diâmetro <100 nm¹⁷) para formar uma bicamada lipídica suportada (SLB) em superfícies contendo topografias projetadas gerou uma única membrana bicamada com curvaturas predeterminadas por nanofabricação ou nanomateriais em alta precisão^18,19,20.

Aqui, apresentamos um protocolo para a formação do SLB em superfícies de nanochips fabricadas com matrizes de nanobarras e como ele pode ser usado para sondar a sensibilidade à curvatura de proteínas in vitro. Como mostra a Figura 1, existem seis componentes essenciais do ensaio: A) Limpeza e montagem do chip com câmara microfluídica; B) Preparação de SUVs com composição lipídica definida; C) Formação do SLB em nanochip e ligação com proteínas sensíveis à curvatura; D) Imagem e caracterização do SLB e proteínas sensíveis à curvatura sob microscopia de fluorescência; E) Limpeza do chip para reutilização; F) Processamento de imagens para análise quantitativa da capacidade de detecção da curvatura de proteínas. O protocolo detalhado é descrito passo a passo abaixo.

Protocolo

1. Limpeza de nanochip

1. Coloque o nanochip em um copo de 10 mL com o lado padronizado voltado para cima.
   NOTA: Este nanochip de quartzo foi fabricado através de litografia por feixe de elétrons, conforme descrito antes^{do 21}. A geometria e o arranjo da nanoestrutura no chip podem ser projetados sob medida. Os tamanhos das nanobarras de gradiente usadas aqui são de 2000 nm de comprimento, 600 nm de altura e 100 a 1000 nm de largura (conjunto de degraus de 100 nm).
2. Adicione cuidadosamente 1 mL de ácido sulfúrico a 98% ao copo e certifique-se de que o ácido cubra totalmente a frente e a parte traseira do chip.
   NOTA: 98% de ácido sulfúrico é extremamente corrosivo e pode causar rápida destruição tecidual e queimaduras químicas graves em contato com a pele ou os olhos. Use-o no exaustor com proteção adequada.
3. Gire lentamente o copo e adicione 200 μL de 30% de peróxido de hidrogênio gota a gota até que todo o copo fique quente. Garantir que o ácido sulfúrico e o peróxido de hidrogênio estejam bem misturados para formar solução de piranha para a remoção de moléculas orgânicas do nanochip¹⁷. Existem técnicas alternativas para gerar o SLB em superfícies hidrofílicas limpas, como a luz UV e a exposição ao ozônio, conforme descrito anteriormente²³.
   NOTA: A reação é extremamente exotérmica e pode fazer com que a solução ferva, então adicione peróxido de hidrogênio ao ácido sulfúrico gota a gota e continue girando.
4. Coloque o copo em um recipiente de vidro secundário e mantenha o nanochip imerso na solução de piranha durante a noite para limpar bem as impurezas.
   NOTA: Coloque o copo no exaustor sem qualquer cobertura, caso a reação possa gerar gás.
5. Retire o copo e pipete cuidadosamente a solução de piranha para um recipiente de resíduos ácidos.
6. Carregar 5 mL de água deionizada no copo para diluir o ácido residual e descartá-lo nos resíduos ácidos. Repita este passo cinco vezes e use 5 M NaOH para neutralizar os resíduos ácidos.
7. Pegue o chip com uma pinça e lave com um fluxo contínuo de água deionizada para remover completamente o ácido residual. Secar o cavaco com gás nitrogênio a 99,9% para formação de SLB²².

2. Geração de pequenas vesículas unilamelares (SUVs)

1. Adicionar 100 μL de clorofórmio a um frasco para injetáveis de âmbar.
   NOTA: O clorofórmio é um líquido altamente volátil e incolor, e pode ser tóxico se inalado ou engolido. Use-o no exaustor com a máscara e as luvas.
2. Dissolver 500 μg da mistura lipídica em clorofórmio. A composição da mistura lipídica usada aqui é de 89,5 mol% de fosfatidilcolinas de ovo (PC), 10 mol% de fosfatidilserina cerebral (PS) e 0,5 mol% de Texas Red 1,2-dihexadecanoil-sn-glycero-3-fosfoethanolamine, sal de trietilamônio (Texas Red DHPE).
3. Seque a mistura lipídica no frasco para injetáveis com 99,9% de gás azoto até que o clorofórmio esteja volatilizado e a mistura lipídica esteja seca.
   NOTA: Esta etapa deve ser executada no exaustor. Evite respingos líquidos durante a secagem por sopro.
4. Coloque a mistura lipídica presente no frasco para injetáveis de âmbar sem a tampa no dessecador a vácuo coberto de folha de alumínio. Em seguida, seque a amostra a vácuo com uma bomba por 3 h para volatilizar completamente o clorofórmio.
5. Adicione 250 μL de tampão salino tamponada com fosfato (PBS) ao frasco para injetáveis. Vórtice a solução até que fique homogênea.
   NOTA: O tampão PBS consiste em 150 mM de NaCl, sem cálcio, magnésio e vermelho de fenol; o pH é ajustado para 7,2 para fazer a bicamada lipídica PC e PS.
6. Sonicate a mistura lipídica por 30 min a uma frequência de 50 kHz em um sonicator de banho. Em seguida, transfira a mistura lipídica para um tubo de centrífuga de 1,5 mL e lacre com parafilme.
7. Congelar a mistura lipídica em azoto líquido durante 20 s e depois descongelar a 42 °C durante 2 minutos em banho-maria. Repita os ciclos de congelamento-descongelamento 30 vezes. Depois disso, a mistura lipídica parece um líquido claro.
   CUIDADO: O nitrogênio líquido tem um ponto de ebulição de cerca de -195,8 °C. Pode causar congelamento ou queimaduras criogênicas. Use-o no espaço não confinado com luvas de isolamento térmico.
8. Enxaguar duas seringas de vidro à prova de gás e o conector da miniextrusora com etanol, clorofórmio e metanol, respectivamente. Repita a sequência de enxaguamento cinco vezes para pré-limpar o aparelho. Deixe-os no exaustor até que o solvente orgânico esteja completamente volatilizado.
9. Monte o aparelho de miniextrusora e passe 500 μL de tampão PBS através do conector para pré-molhar o aparelho, em seguida, descarte o tampão de outra seringa. Esta etapa remove as impurezas e facilita a extrusão.
10. Monte o aparelho miniextrusora com uma membrana filtrante de policarbonato de 100 nm.
    NOTA: O tamanho dos poros da membrana filtrante determina o diâmetro dos lipossomas.
11. Tomar 500 μL de tampão PBS com uma das seringas e empurrá-lo suavemente através do filtro para encher a segunda seringa vazia na outra extremidade. Repetir a extrusão para frente e para trás três vezes para verificar a fuga do aparelho e eliminar o tampão da segunda seringa.
12. Passe a mistura lipídica através da mini extrusora para substituir o tampão PBS. Em seguida, extruda para frente e para trás 20 vezes para formar SUVs. O caráter multilamelar das vesículas pode ser mantido com número insuficiente de tempos de extrusão, o que afetará a formação de SLB²³.
13. Recolha os SUV da segunda seringa para reduzir a contaminação com partículas maiores e transfira-os para um tubo de centrífuga de 1,5 ml.
    NOTA: Remova a seringa diretamente do conector caso a seringa se rompa.
14. Envolva o tubo com papel alumínio para evitar o branqueamento de lípidos marcados com fluorescência e guarde-os a 4 °C. Normalmente, os SUVs podem ser armazenados por até 7 dias.

3. Formação do SLB em um nanochip

1. Retire cuidadosamente o nanochip limpo da água desionizada com um par de pinças e seque a seco com gás nitrogênio a 99,9%.
2. Realizar a limpeza da superfície do nanochip com tratamento com plasma de ar por 1 h.
3. Monte o nanochip em uma câmara de polidimetilsiloxano (PDMS), que consiste em duas peças de PDMS-a PDMS médio e um PDMS superior (Figura 1A). O PDMS médio é fino (~0,5 mm) com uma grande abertura oval no centro para garantir exposição suficiente ao padrão nanobar. O PDMS superior é espesso (~ 4,0 mm) com dois pequenos orifícios dentro da grande abertura oval como uma entrada e uma saída para manuseio de líquidos.
   1. Coloque o chip em uma superfície limpa com o padrão voltado para cima.
   2. Cubra suavemente o PDMS médio com o chip e certifique-se de que todo o padrão esteja exposto à área central da grande abertura oval no PDMS médio.
   3. Cubra o PDMS superior com o PDMS médio e mantenha seus dois pequenos orifícios dentro da região do grande orifício oval do PDMS médio. Em seguida, a câmara PDMS é montada.
      NOTA: PDMS é o polímero orgânico à base de silício mais utilizado. É biocompatível, transparente, bem como deformável para ser projetado como uma forma personalizada para montagem de chips e imagem sob o microscópio. Mais importante ainda, ele pode ser covalentemente preso a outra camada PDMS ou vidro firmemente após o tratamento com plasma, tornando-o adequado como a câmara para preparar o SLB. Esta etapa garante que cada camada de PDMS seja bem ajustada para evitar lacunas e vazamentos.
4. Carregue os SUVs na câmara PDMS a partir de um dos dois pequenos orifícios no PDMS superior com uma pipeta e incube por 15 minutos à temperatura ambiente para formar o SLB.
5. Pipete suavemente o tampão PBS para a câmara PDMS de um lado do pequeno orifício e remova os resíduos com um cotonete do outro orifício para lavar os SUVs não ligados. Em seguida, adquira o SLB formado no nanochip (a qualidade do SLB é testada pela recuperação de fluorescência após fotobranqueamento (FRAP), conforme mostrado na etapa 4.4 e discutido na seção de resultados representativos).
   NOTA: Ao canalizar o tampão PBS para a câmara, a ponta da pipeta deve estar cheia do tampão e em contato com a superfície do líquido para evitar a injeção de bolhas.

4. Obtenção de imagens do SLB e da ligação de proteínas de detecção de curvatura no nanochip

NOTA: Esta seção dependerá do sistema de microscópio disponível para o experimento. Aqui, uma diretriz geral sobre como realizar a imagem será descrita. As configurações detalhadas podem ser alteradas entre as diferentes configurações de microscópio.

1. Configure a microscopia confocal de varredura a laser usando uma objetiva de óleo de 100x (N.A.1.4). Abra o software ZEN para selecionar a potência do laser de excitação que pode excitar a fluorescência do lipídio e da proteína. Escolha o modo de aquisição > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
2. Ajuste o foco com o botão de foco para localizar as nanobarras no chip até que as bordas da nanobarra estejam afiadas sob o canal lipídico.
3. Defina os parâmetros de varredura como abaixo para obter uma imagem de controle do canal lipídico antes de adicionar proteína: Tamanho do quadro = 512 px x 512 px (512 pixels x 512 pixels, um tamanho de pixel de 124 nm), Bits por pixel = 16 (profundidade de 16 bits), Velocidade de digitalização = 5 e Média = 4 (modo de média de quatro vezes / linha).
4. Realizar o ensaio FRAP branqueando a bicamada lipídica marcada com fluorescência em uma única área de nanobar aleatória.
   1. Marque as caixas de seleção Regiões do experimento e branqueamento . Desenhe uma área circular de 5 μm de diâmetro que pode incluir toda a nanobarra no centro (o tamanho da nanobarra é de 2 μm) e adicione às Regiões do Experimento. Insira parâmetros de imagem de lapso de tempo como o exemplo a seguir: escolha Velocidade de varredura = 9 e Média = 1. Escolha Série Temporal > Duração = 100 ciclos e Intervalo = 2 s. Insira parâmetros de branqueamento como o exemplo a seguir: marque a caixa de seleção Iniciar após # imagens e escolha três imagens.
   2. Marque as caixas de seleção a laser que executam o FRAP e altere a energia para 100,0%. Clique em Iniciar Experimento para o experimento FRAP.
      NOTA: O FRAAP é um método comum para caracterizar a mobilidade de moléculas celulares. Se o SLB tiver boa fluidez, a fluorescência na área branqueada se recuperará gradualmente à medida que os fluoróforos branqueados se difundirem e os fluoróforos não branqueados de outras áreas se difundirem.
5. Carregar a solução proteica na câmara PDMS e incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente para permitir a ligação da proteína no SLB.
   NOTA: As proteínas utilizadas na Figura 2G,H para demonstrar a composição lipídica facilitam a ligação de proteínas em SLBs curvados em nanobarras são 74 μM GFP e 79 μM GFP-His. Estas duas proteínas são proteínas de fluorescência verde sem ou com His-tag. As proteínas utilizadas para o estudo da detecção de curvatura na Figura 4 e na Figura 5 são 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 e 16 μM FBAR+IDR^FBP17. Essas três proteínas são os domínios da FBP17, que é uma proteína BAR típica que é intuitivamente assumida como geradores de curvatura e sensores. Cada volume de proteína é de 20 μL.
6. Reoriente as nanobarras e repita a etapa 4.3 para tirar imagens dos canais lipídicos e proteicos para detecção de detecção de curvatura de proteínas.
7. Repita a etapa 4.4 para conduzir o ensaio FRAP nos canais lipídico e proteico e realizar imagens de lapso de tempo para caracterizar a mobilidade da proteína de detecção de curvatura.

5. Reutilização de nanochips

1. Pegue o nanochip com uma pinça e separe-o cuidadosamente da câmara PDMS em um copo de 50 mL cheio de água deionizada.
   Observação : esta é uma etapa crítica. Evite que a pinça toque na nanoestrutura e não force o chip a se separar para evitar rachaduras.
2. Lave bem o nanochip com etanol anidro para remover os resíduos orgânicos ligados na superfície.
   NOTA: Use papel de seda limpo para remover a água na superfície antes de lavar com etanol anidro.
   CUIDADO: O etanol anidro é um produto químico altamente volátil e ligeiramente perigoso. Evite o contato com a pele e os olhos. Use-o no exaustor com a máscara e as luvas.
3. Lave bem o chip com muita água deionizada para remover o etanol residual. Em seguida, seque o chip com 99,9% de gás nitrogênio.
   NOTA: É importante remover todos os vestígios de etanol no chip antes de prosseguir para a próxima etapa, porque o ácido piranha pode reagir violentamente com solvente orgânico e pode causar explosões.
4. Coloque o chip em um copo limpo de 10 mL com o lado do padrão voltado para cima e limpe o chip com solução de piranha para reutilização, que segue os mesmos passos da "limpeza do nanochip".

6. Quantificação da imagem

1. Gire as imagens adquiridas por um microscópio para que a matriz de nanobarras esteja em uma posição vertical para análise subsequente no software de Fiji.
2. Use um código MATLAB personalizado 'c_pillarmask_averaging' para localizar a nanobarra individual por uma máscara quadrada (51 pixels x 51 pixels) tanto no canal lipídico quanto no canal de proteínas.
   NOTA: Este código MATLAB foi especialmente concebido para o nanochip. Ele pode ser obtido no GitHub através do link: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
3. Subtraia os sinais de fundo de cada imagem com os três ROIs (5 pixels x 5 pixels) nos cantos da imagem pela função de malha no código MATLAB 'BarGra_avg'. Esta operação visa corrigir potenciais ruídos de fundo irregulares causados pela configuração do microscópio ou nivelamento do chip no estágio do microscópio.
4. Gere as imagens médias das nanobarras do mesmo tamanho usando o código MATLAB 'BarGra_avg', onde cada ponto é a média dos valores naquele ponto em todas as máscaras quadradas individuais de nanobar. Gere gráficos de superfície 3D das imagens médias no software de Fiji para mostrar a distribuição média do sinal em torno das nanobarras intuitivamente. Escolha Analisar Gráfico de Superfície > > Entrada 100 para Multiplicador de Polígonos e marque as caixas de seleção Sombra, Eixo de Desenho e Suavização.
5. Segmente cada nanobar em três áreas, que incluem duas áreas de extremidade de nanobar e uma área de centro de nanobar para extrair suas intensidades de fluorescência, respectivamente, pelo código MATLAB 'avg_nanobar_quantification'. Os tamanhos dos ROIs de nanobarras são ajustados de acordo com a dimensão das nanobarras usando o arquivo de 'posição'.
6. Divida as intensidades de proteína por intensidades lipídicas extraídas do código MATLAB 'avg_nanobar_quantification' na área da extremidade da barra para obter a densidade da extremidade da nanobarra que exclui o efeito da área de superfície.
7. Plote a densidade da extremidade da nanobarra com diferentes concentrações no GraphPad Prism para obter a curva de ligação. Abra o menu Analisar . Escolha Regressão não linear (ajuste de curva) > Ligação - Saturação > Ligação específica com função de inclinação de Hill para ajustar a curva com a equação de Hill e, em seguida, calcular o valor do coeficiente KD e Hill.
8. As intensidades lipídicas e proteicas são normalizadas para suas intensidades correspondentes no centro de nanobarras de 600 nm adquiridas na mesma imagem usando o código MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
9. Use os nove pixels mais brilhantes de intensidades de proteína normalizadas na área da extremidade da nanobarra dividida pela área do centro da barra para quantificar a detecção da curvatura da proteína com nanobarras do mesmo tamanho, o valor é nomeado como "relação fim-a-centro". Use a proporção de intensidade de proteína normalizada para normalizar a intensidade lipídica para quantificar a faixa de detecção de curvatura de proteína com nanobarras de tamanhos diferentes, o valor é nomeado como "Densidade Final-Nanobar Normalizada". Esses valores são calculados pelo código MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
10. Carregue a imagem da pilha FRAP no software Fiji. Escolha a área FRAP e gere um ROI. Escolha a função Mais > Multimedida para medir a intensidade da área FRAP para cada vez. Plote a intensidade no GraphPad Prism para gerar a curva de recuperação FRAP.

Resultados

O projeto de nanobar é recomendado para sondar proteínas de detecção de curvatura positiva, que contém um meio círculo em cada extremidade com curvatura definida pela largura da nanobarra e um controle de curvatura plana/zero localmente no centro (Figura 2A,B). A formação bem-sucedida do SLB em nanobarras resulta em sinais de marcadores lipídicos distribuídos uniformemente em toda a superfície do nanobar, como mostrado na Figura 2C. O...

Discussão

O sistema nanobar-SLB descrito aqui oferece uma combinação única das vantagens em vários ensaios in vitro existentes. Revela eficientemente a ligação preferencial de proteínas a membranas altamente curvas como o ensaio de flutuação ou sedimentação de lipossomas, mas requer muito menos amostras e oferece curvatura mais precisamente definida em nanobarras individuais ^8,29. Ele também oferece uma ampla gama de curvatura precisamente controlada p...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous Ethanol	Sigma-Aldrich	100983
Aluminum foil	Diamond	RN0879999FU
Amber Vial	Sigma-Aldrich	27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840032
10 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211060804
50 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211061706
1000 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211065408	The second container
Chloroform	Sigma-Aldrich	V800117
Cotton buds	Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840051
F-BAR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
F-BAR+IDR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP-His	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GraphPad Prism	GraphPad	V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)	Thermo Scientific	H325-500
IDR from human FBP17	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ	National Institutes of Health	1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	LSM 800 with Airyscan	100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol	Fisher scientific	10010240
Mini-extuder	Avanti Polar Lipids, Inc.	610000-1EA
1.5 mL Microtubes	Greiner	616201
MATLAB	Mathworks	R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm	Whatman	800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS)	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Plasma Cleaner	HARRICK PLASMA	PDC-002-HP
Quartz Nanochip	Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	T1395MP
Tweezer	Gooi	PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners	Elma	D-78224
Voterx	Scientific Industries	G560E
Vacuum Desiccator	NUCERITE	5312
Water Bath	Julabo	TW8