Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana

Riepilogo

Qui, viene sviluppato un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per fornire una membrana sintetica con una curvatura definita che consente la caratterizzazione di proteine con capacità di rilevamento della curvatura in vitro.

Abstract

La curvatura della membrana svolge un ruolo importante in vari processi essenziali delle cellule, come la migrazione cellulare, la divisione cellulare e il traffico di vescicole. Non solo è generato passivamente dalle attività cellulari, ma regola anche attivamente le interazioni proteiche ed è coinvolto in molte segnalazioni intracellulari. Pertanto, è di grande valore esaminare il ruolo della curvatura della membrana nella regolazione della distribuzione e della dinamica delle proteine e dei lipidi. Recentemente, molte tecniche sono state sviluppate per studiare la relazione tra la membrana curva e la proteina in vitro. Rispetto alle tecniche tradizionali, il nuovo nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offre sia un throughput elevato che una migliore precisione nella generazione della curvatura della membrana formando un doppio strato lipidico continuo su matrici modellate di nanobar con una curvatura di membrana predefinita e un controllo piatto locale. Sia la fluidità lipidica che la sensibilità proteica alle membrane curve possono essere caratterizzate quantitativamente utilizzando l'imaging al microscopio a fluorescenza. Qui viene introdotta una procedura dettagliata su come formare un SLB su superfici di vetro fabbricate contenenti array di nanobar e la caratterizzazione delle proteine sensibili alla curvatura su tale SLB. Inoltre, sono coperti i protocolli per il riutilizzo dei nanochip e l'elaborazione delle immagini. Oltre al nanobar-SLB, questo protocollo è facilmente applicabile a tutti i tipi di chip di vetro nanostrutturati per studi di rilevamento della curvatura.

Introduzione

La curvatura della membrana è un parametro fisico critico di una cellula che si verifica in una varietà di processi cellulari come la morfogenesi, la divisione cellulare e la migrazione cellulare¹. È ampiamente riconosciuto ora che la curvatura della membrana è al di là di un semplice risultato di eventi cellulari; Invece, è emerso come un efficace regolatore delle interazioni proteiche e della segnalazione intracellulare. Ad esempio, è stato scoperto che diverse proteine coinvolte nell'endocitosi mediata da clatrina si legano preferenzialmente alla membrana curva, con conseguente formazione di un hotspot per l'endocitosi². Ci sono molte cause diverse di deformazione della membrana come l'attrazione della membrana da parte delle forze citoscheletriche, la presenza di asimmetria lipidica con gruppi di testa di dimensioni diverse, l'esistenza di proteine transmembrana con forma conica, l'accumulo di proteine che modellano la membrana come le proteine del dominio BAR (dal nome delle proteine Bin, anfifisina e Rvs) e l'inserimento del dominio delle eliche anfipatiche nella membrana¹ . È interessante notare che queste proteine e lipidi non solo deformano la membrana, ma possono anche percepire la curvatura della membrana e mostrare un accumulo preferenziale¹. Pertanto, è fondamentale studiare se e come membrane con diverse curvature alterano la distribuzione e la dinamica delle proteine e dei lipidi ad esse collegati e i potenziali impatti sui relativi processi intracellulari.

Molte tecniche sono state sviluppate per analizzare l'interazione tra membrana curva e proteine sia in cellule vive che in sistemi in vitro. Il sistema di cellule vive fornisce un ambiente cellulare reale con una ricca diversità lipidica e regolazione dinamica della segnalazione proteica 2,3,4,5,6,7. Tuttavia, un sistema così sofisticato è difficile da studiare a causa delle incertezze e delle fluttuazioni nell'ambiente intracellulare. Quindi, i saggi in vitro che utilizzano una membrana artificiale composta da specie lipidiche note e proteine purificate sono diventati potenti sistemi di ricostituzione per caratterizzare la relazione tra proteine e membrane curve. Tradizionalmente, liposomi di diversi diametri sono generati per estrusione per rilevare proteine sensibili alla curvatura tramite un saggio di co-sedimentazione utilizzando la forza centrifuga o un saggio di co-flottazione con un gradiente di densità per evitare l'aggregazione proteica ^8,9. Tuttavia, la curvatura dei liposomi estrusi è limitata dalla dimensione dei pori disponibile del filtro a membrana utilizzato nell'estrusore¹⁰. È stato dimostrato che il test di curvatura a liposoma singolo (SLiC) supera questa limitazione, in cui i liposomi con diametri diversi sono marcati con fluorescenza e immobilizzati sulla superficie in modo che la curvatura possa essere contrassegnata dall'intensità fluorescente¹¹. Tuttavia, è stata osservata una forte variabilità nella composizione lipidica nelle piccole vescicole, che influisce sull'accuratezza della misurazione della curvatura¹². Gli esperimenti di tirare il tethering forniscono una misurazione più accurata della curvatura sul cavo transitorio tirato da vescicole unilamellari giganti (GUV) utilizzando una pinzetta ottica, dove la curvatura può essere ben controllata dalla tensione della membrana generata^13,14. Questo metodo è adatto per studiare proteine sensibili a curvatura positiva o negativa, ma è limitato dal throughput della generazione del tubo¹⁰. Il test SMrT (Supported Membrane Tubes) consente la generazione simultanea di più tubi a membrana che vengono estrusi dallo stesso serbatoio lipidico mediante flussi microfluidici. Tuttavia, la curvatura della membrana varia intrinsecamente lungo il nanotubo, il che compromette l'accuratezza della misurazione della curvatura basata sull'intensità di fluorescenza^15,16. In confronto, l'utilizzo di piccole vescicole unilamellari (SUV, diametro <100 nm¹⁷) per formare un doppio strato lipidico supportato (SLB) su superfici contenenti topografie progettate ha generato una singola membrana a doppio strato con curvature predeterminate da nanofabbricazione o nanomateriali in alta precisione^18,19,20.

Qui, presentiamo un protocollo per la formazione dell'SLB su superfici di nanochip fabbricate con array di nanobar e come può essere utilizzato per sondare la sensibilità alla curvatura delle proteine in vitro. Come mostrato in Figura 1, ci sono sei componenti essenziali del test: A) Pulizia e assemblaggio del chip con una camera microfluidica; B) Preparazione di SUV con composizione lipidica definita; C) Formazione dell'SLB su un nanochip e legame con proteine sensibili alla curvatura; D) Imaging e caratterizzazione delle proteine SLB e curvature sensibili al microscopio a fluorescenza; E) Pulizia del chip per il riutilizzo; F) Elaborazione di immagini per l'analisi quantitativa della capacità di rilevamento della curvatura proteica. Il protocollo dettagliato è descritto passo dopo passo di seguito.

Protocollo

1. Pulizia del nanochip

1. Posizionare il nanochip in un becher da 10 mL con il lato modellato rivolto verso l'alto.
   NOTA: Questo nanochip di quarzo è stato fabbricato mediante litografia a fascio di elettroni come descritto prima²¹. La geometria e la disposizione della nanostruttura sul chip possono essere progettate su misura. Le dimensioni delle nanobarre di gradiente utilizzate qui sono 2000 nm di lunghezza, 600 nm di altezza e da 100 a 1000 nm di larghezza (100 nm step-set).
2. Aggiungere con cautela 1 mL di acido solforico al 98% al becher e assicurarsi che l'acido copra completamente la parte anteriore e posteriore del chip.
   NOTA: l'acido solforico al 98% è estremamente corrosivo e può causare una rapida distruzione dei tessuti e gravi ustioni chimiche a contatto con la pelle o gli occhi. Utilizzarlo nella cappa aspirante con un'adeguata protezione.
3. Ruotare lentamente il becher e aggiungere 200 μL di perossido di idrogeno al 30% goccia a goccia fino a quando l'intero becher diventa caldo. Assicurarsi che l'acido solforico e il perossido di idrogeno siano ben miscelati per formare una soluzione di piranha per la rimozione delle molecole organiche dal nanochip¹⁷. Esistono tecniche alternative per generare l'SLB su superfici idrofile pulite, come la luce UV e l'esposizione all'ozono come descritto in precedenza²³.
   NOTA: La reazione è estremamente esotermica e può far bollire la soluzione, quindi aggiungi il perossido di idrogeno all'acido solforico goccia a goccia e continua a ruotare.
4. Posizionare il becher in un contenitore di vetro secondario e mantenere il nanochip immerso nella soluzione di piranha durante la notte per pulire accuratamente le impurità.
   NOTA: Posizionare il becher nella cappa aspirante senza alcun coperchio nel caso in cui la reazione possa generare gas.
5. Estrarre il becher e pipettare con cura la soluzione di piranha in un contenitore per rifiuti acidi.
6. Caricare 5 ml di acqua deionizzata nel becher per diluire l'acido residuo e gettarlo nei rifiuti acidi. Ripetere questo passaggio cinque volte e utilizzare 5 M NaOH per neutralizzare i rifiuti acidi.
7. Afferrare il chip con una pinzetta e lavare con un flusso continuo di acqua deionizzata per rimuovere accuratamente l'acido residuo. Asciugare il chip con azoto gassoso al 99,9% per la formazione di SLB²².

2. Generazione di piccole vescicole unilamellari (SUV)

1. Aggiungere 100 μL di cloroformio in un flaconcino ambrato.
   NOTA: Il cloroformio è un liquido altamente volatile, incolore e può essere tossico se inalato o ingerito. Usalo nella cappa aspirante con la maschera e i guanti.
2. Sciogliere 500 μg della miscela lipidica in cloroformio. La composizione della miscela lipidica utilizzata qui è 89,5 mol% di fosfatidilcoline d'uovo (PC), 10 mol% di fosfatidilserina cerebrale (PS) e 0,5 mol% di Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, sale di trietilammonio (Texas Red DHPE).
3. Asciugare la miscela lipidica nel flaconcino con azoto gassoso al 99,9% fino a quando il cloroformio è volatilizzato e la miscela lipidica è asciutta.
   NOTA: questo passaggio deve essere eseguito nella cappa aspirante. Evitare spruzzi di liquidi durante l'asciugatura.
4. Introdurre la miscela lipidica presente nel flaconcino ambrato senza coperchio nell'essiccatore sottovuoto ricoperto di fogli di alluminio. Quindi asciugare sottovuoto il campione con una pompa per 3 ore per volatilizzare completamente il cloroformio.
5. Aggiungere 250 μL di tampone salino tampone fosfato (PBS) al flaconcino. Vortice la soluzione fino a quando non è omogenea.
   NOTA: il tampone PBS è costituito da 150 mM NaCl, senza calcio, magnesio e rosso fenolo; il pH è regolato a 7,2 per rendere il doppio strato lipidico PC e PS.
6. Sonicare la miscela lipidica per 30 minuti ad una frequenza di 50 kHz in un sonicatore da bagno. Quindi trasferire la miscela lipidica in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e sigillare con parafilm.
7. Congelare la miscela lipidica in azoto liquido per 20 secondi e poi scongelare a 42 °C per 2 minuti a bagnomaria. Ripetere i cicli di congelamento-disgelo 30 volte. Dopo di ciò, la miscela lipidica sembra un liquido chiaro.
   ATTENZIONE: L'azoto liquido ha un punto di ebollizione di circa -195,8 °C. Può causare congelamento o ustioni criogeniche. Usalo nello spazio non confinato con i guanti di isolamento termico.
8. Risciacquare due siringhe a tenuta di gas di vetro e il connettore del miniestrusore rispettivamente con etanolo, cloroformio e metanolo. Ripetere la sequenza di risciacquo cinque volte per pre-pulire l'apparecchio. Lasciarli nella cappa aspirante fino a quando il solvente organico è completamente volatilizzato.
9. Assemblare l'apparecchio miniestrusore e far passare 500 μL di tampone PBS attraverso il connettore per pre-bagnare l'apparecchio, quindi gettare il tampone da un'altra siringa. Questo passaggio rimuove le impurità e facilita l'estrusione.
10. Assemblare l'apparato miniestrusore con una membrana filtrante in policarbonato di dimensioni pore da 100 nm.
    NOTA: La dimensione dei pori della membrana filtrante determina il diametro dei liposomi.
11. Prelevare 500 μL di tampone PBS con una delle siringhe e spingerlo delicatamente attraverso il filtro per riempire la seconda siringa vuota all'altra estremità. Ripetere l'estrusione avanti e indietro tre volte per controllare la perdita dell'apparecchio ed eliminare il tampone dalla seconda siringa.
12. Far passare la miscela lipidica attraverso il mini estrusore per sostituire il tampone PBS. Quindi estrudere avanti e indietro 20 volte per formare SUV. Il carattere multilamellare delle vescicole può essere mantenuto con un numero insufficiente di tempi di estrusione, che influenzerà la formazione di SLB²³.
13. Raccogliere i SUV dalla seconda siringa per ridurre la contaminazione con particelle più grandi e trasferirla in un tubo da centrifuga da 1,5 ml.
    NOTA: Rimuovere la siringa direttamente dal connettore nel caso in cui la siringa si rompa.
14. Avvolgere il tubo con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento dei lipidi marcati con fluorescenza e conservarli a 4 °C. Di solito, i SUV possono essere conservati per un massimo di 7 giorni.

3. Formazione dell'SLB su un nanochip

1. Estrarre accuratamente il nanochip pulito dall'acqua deionizzata con un paio di pinzette e asciugare con il 99,9% di azoto gassoso.
2. Eseguire la pulizia superficiale del nanochip con trattamento al plasma ad aria per 1 ora.
3. Assemblare il nanochip in una camera di polidimetilsilossano (PDMS), che consiste di due pezzi di PDMS: un PDMS medio e un PDMS superiore (Figura 1A). Il PDMS centrale è sottile (~ 0,5 mm) con una grande apertura di forma ovale al centro per garantire un'esposizione sufficiente al modello nanobar. Il PDMS superiore è spesso (~ 4,0 mm) con due piccoli fori all'interno della grande apertura ovale come ingresso e uscita per la manipolazione dei liquidi.
   1. Posizionare il chip su una superficie pulita con il motivo rivolto verso l'alto.
   2. Coprire delicatamente il PDMS centrale con il chip e assicurarsi che l'intero modello sia esposto all'area centrale della grande apertura di forma ovale nel PDMS centrale.
   3. Coprire il PDMS superiore con il PDMS centrale e mantenere i suoi due piccoli fori all'interno della regione del grande foro ovale del PDMS centrale. Quindi viene assemblata la camera PDMS.
      NOTA: PDMS è il polimero organico a base di silicio più utilizzato. È biocompatibile, trasparente e deformabile per essere progettato come una forma personalizzata per l'assemblaggio di chip e l'imaging al microscopio. Ancora più importante, può essere incollato covalentemente a un altro strato PDMS o vetro saldamente dopo il trattamento al plasma, rendendolo adatto come camera per preparare l'SLB. Questo passaggio garantisce che ogni strato di PDMS sia ben montato per evitare spazi vuoti e perdite.
4. Caricare i SUV nella camera PDMS da uno dei due piccoli fori nel PDMS superiore con una pipetta e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente per formare l'SLB.
5. Pipettare delicatamente il tampone PBS nella camera PDMS da un lato del piccolo foro e rimuovere i rifiuti con un batuffolo di cotone dall'altro foro per lavare via i SUV non legati. Quindi acquisire l'SLB formato sul nanochip (la qualità dell'SLB viene testata mediante recupero di fluorescenza dopo fotosbiancamento (FRAP) come mostrato nel punto 4.4 e discusso nella sezione dei risultati rappresentativi).
   NOTA: quando si inserisce il tampone PBS nella camera, la punta della pipetta deve essere piena del tampone e a contatto con la superficie del liquido per evitare l'iniezione di bolle.

4. Imaging dell'SLB e del legame della proteina sensibile alla curvatura sul nanochip

NOTA: questa sezione dipende dal sistema di microscopio disponibile per l'esperimento. Qui, verrà descritta una linea guida generale su come eseguire l'imaging. Le impostazioni dettagliate possono essere modificate tra le diverse configurazioni del microscopio.

1. Impostare la microscopia confocale a scansione laser utilizzando un obiettivo olio 100x (N.A.1.4). Apri il software ZEN per selezionare la potenza del laser di eccitazione che può eccitare la fluorescenza dei lipidi e delle proteine. Scegli la modalità di acquisizione > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
2. Regolare la messa a fuoco con la manopola di messa a fuoco per individuare le nanobarre sul chip fino a quando i bordi delle nanobarre sono nitidi sotto il canale lipidico.
3. Impostare i parametri di scansione come di seguito per ottenere un'immagine di controllo del canale lipidico prima di aggiungere proteine: Dimensione fotogramma = 512 px x 512 px (512 pixel x 512 pixel, una dimensione pixel di 124 nm), Bit per pixel = 16 (profondità a 16 bit), Velocità di scansione = 5 e Media = 4 (modalità media di quattro volte / linea).
4. Condurre il test FRAP sbiancando il doppio strato lipidico marcato con fluorescenza su una singola area nanobar casuale.
   1. Seleziona le caselle di controllo Aree dell'esperimento e Sbiancamento . Disegna un'area circolare di 5 μm di diametro che può includere l'intera nanobarra al centro (la dimensione della nanobarra è di 2 μm) e aggiungi alle regioni dell'esperimento. Immettere i parametri di imaging time-lapse come nell'esempio seguente: scegliere Velocità di scansione = 9 e Media = 1. Scegliere Serie temporali > Durata = 100 cicli e Intervallo = 2 s. Immettere i parametri di sbiancamento come nell'esempio seguente: selezionare la casella di controllo Inizia dopo # immagini e scegliere tre immagini.
   2. Selezionare le caselle di controllo laser che eseguono FRAP e modificare la potenza al 100,0%. Fai clic su Avvia esperimento per l'esperimento FRAP.
      NOTA: FRAP è un metodo comune per caratterizzare la mobilità delle molecole cellulari. Se l'SLB ha una buona fluidità, la fluorescenza nell'area sbiancata si riprenderà gradualmente man mano che i fluorofori sbiancati si diffondono e i fluorofori non sbiancati provenienti da altre aree si diffondono.
5. Caricare la soluzione proteica nella camera PDMS e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per consentire il legame della proteina sull'SLB.
   NOTA: Le proteine utilizzate nella Figura 2G,H per dimostrare che la composizione lipidica facilita il legame proteico su SLB curvati a nanobar sono 74 μM GFP e 79 μM GFP-His. Queste due proteine sono proteine a fluorescenza verde senza o con His-tag. Le proteine utilizzate per lo studio del rilevamento della curvatura in Figura 4 e Figura 5 sono 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 e 16 μM FBAR+IDR^FBP17. Queste tre proteine sono i domini di FBP17, che è una tipica proteina BAR che viene intuitivamente assunta sia come generatori di curvatura che come sensori. Ogni volume proteico è di 20 μL.
6. Rifocalizzare le nanobarre e ripetere il passaggio 4.3 per acquisire immagini dei canali lipidici e proteici per il rilevamento della curvatura proteica.
7. Ripetere il passaggio 4.4 per condurre il test FRAP su entrambi i canali lipidici e proteici ed eseguire l'imaging time-lapse per caratterizzare la mobilità della proteina sensibile alla curvatura.

5. Riutilizzo dei nanochip

1. Afferrare il nanochip con una pinzetta e staccarlo con attenzione dalla camera PDMS in un becher da 50 ml riempito con acqua deionizzata.
   NOTA: questo è un passaggio critico. Evitare che le pinzette tocchino la nanostruttura e non forzare il chip a separarsi per evitare crepe.
2. Lavare accuratamente il nanochip con etanolo anidro per rimuovere i residui organici attaccati sulla superficie.
   NOTA: Utilizzare carta velina pulita per rimuovere l'acqua sulla superficie prima di lavare con etanolo anidro.
   ATTENZIONE: L'etanolo anidro è una sostanza chimica altamente volatile e leggermente pericolosa. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Usalo nella cappa aspirante con la maschera e i guanti.
3. Lavare accuratamente il chip con abbondante acqua deionizzata per rimuovere l'etanolo residuo. Quindi asciugare il chip con azoto gassoso al 99,9%.
   NOTA: È importante rimuovere tutte le tracce di etanolo sul chip prima di procedere alla fase successiva perché l'acido piranha può reagire violentemente con il solvente organico e può causare esplosioni.
4. Collocare il chip in un becher pulito da 10 mL con il lato del modello rivolto verso l'alto e pulire il chip con una soluzione piranha per il riutilizzo che segue le stesse fasi della "pulizia del nanochip".

6. Quantificazione dell'immagine

1. Ruotare le immagini acquisite da un microscopio in modo che l'array di nanobar sia in posizione verticale per la successiva analisi nel software Fiji.
2. Utilizza un codice MATLAB personalizzato 'c_pillarmask_averaging' per localizzare la singola nanobar da una maschera quadrata (51 pixel x 51 pixel) sia nel canale lipidico che nel canale proteico.
   NOTA: Questo codice MATLAB è appositamente progettato per il nanochip. Può essere ottenuto su GitHub tramite il link: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
3. Sottrarre i segnali di sfondo di ogni immagine con i tre ROI (5 pixel x 5 pixel) agli angoli dell'immagine dalla funzione meshgrid nel codice MATLAB 'BarGra_avg'. Questa operazione mira a correggere potenziali rumori di fondo irregolari causati dalla configurazione del microscopio o dal livellamento del chip sullo stadio del microscopio.
4. Genera le immagini medie delle nanobarre delle stesse dimensioni utilizzando il codice MATLAB 'BarGra_avg', dove ogni punto è la media dei valori in quel punto in tutte le singole maschere quadrate nanobar. Genera grafici di superficie 3D delle immagini medie nel software Fiji per mostrare la distribuzione media del segnale intorno alle nanobarre in modo intuitivo. Selezionate Analizza > plottaggio superficie > Input 100 per moltiplicatore poligono e selezionate le caselle di controllo Ombra (Shade), Draw Axis (Draw Axis) e Arrotonda (Smooth).
5. Segmenta ogni nanobar in tre aree, che includono due aree di estremità di nanobar e un'area di centro di nanobar per estrarre le loro intensità di fluorescenza rispettivamente mediante codice MATLAB 'avg_nanobar_quantification'. Le dimensioni dei ROI delle nanobarre vengono regolate in base alla dimensione delle nanobarre utilizzando il file "posizione".
6. Dividere le intensità proteiche per le intensità lipidiche estratte dal codice MATLAB 'avg_nanobar_quantification' nell'area bar-end per ottenere la densità nanobar-end che esclude l'effetto area superficiale.
7. Tracciare la densità dell'estremità della nanobarra con diverse concentrazioni in GraphPad Prism per ottenere la curva di legame. Aprire il menu Analizza . Scegliere Regressione non lineare (adattamento alla curva) > Binding - Saturazione > Binding specifico con funzione di pendenza di Hill per adattare la curva all'equazione di Hill e quindi calcolare il valore del coefficiente KD e Hill.
8. Le intensità lipidiche e proteiche sono normalizzate alle loro intensità corrispondenti al centro dei nanobar a 600 nm acquisite nella stessa immagine utilizzando il codice MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
9. Utilizzare i nove pixel più luminosi di intensità proteiche normalizzate nell'area di estremità della nanobarra divisa per l'area del centro della barra per quantificare il rilevamento della curvatura della proteina con nanobar delle stesse dimensioni, il valore è chiamato "rapporto end-to-center". Utilizzare il rapporto tra l'intensità proteica normalizzata per normalizzare l'intensità lipidica per quantificare l'intervallo di rilevamento della curvatura proteica con nanobar di dimensioni diverse, il valore è denominato "Normalized Nanobar-End Density". Questi valori sono calcolati dal codice MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
10. Caricare l'immagine dello stack FRAP nel software Fiji. Scegli l'area FRAP e genera un ROI. Scegliere la funzione Più > Multimisura per misurare l'intensità dell'area FRAP per ogni volta. Tracciare l'intensità in GraphPad Prism per generare la curva di recupero FRAP.

Risultati

Il design Nanobar è raccomandato per sondare le proteine sensibili alla curvatura positiva, che contiene un semicerchio a ciascuna estremità con curvatura definita dalla larghezza della nanobarra e un controllo della curvatura piatta / zero localmente al centro (Figura 2A, B). La formazione riuscita dell'SLB sui nanobar si traduce in segnali di marcatori lipidici uniformemente distribuiti su tutta la superficie dei nanobar, come mostrato nella Figura 2...

Discussione

Il sistema nanobar-SLB qui descritto offre una combinazione unica dei vantaggi in diversi saggi in vitro esistenti. Rivela in modo efficiente il legame preferenziale delle proteine a membrane altamente curve come il test di galleggiamento o sedimentazione dei liposomi, ma richiede molti meno campioni e offre una curvatura definita con maggiore precisione su singole nanobarre ^8,29. Offre inoltre una vasta gamma di curvature controllate con precisione per ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous Ethanol	Sigma-Aldrich	100983
Aluminum foil	Diamond	RN0879999FU
Amber Vial	Sigma-Aldrich	27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840032
10 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211060804
50 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211061706
1000 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211065408	The second container
Chloroform	Sigma-Aldrich	V800117
Cotton buds	Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840051
F-BAR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
F-BAR+IDR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP-His	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GraphPad Prism	GraphPad	V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)	Thermo Scientific	H325-500
IDR from human FBP17	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ	National Institutes of Health	1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	LSM 800 with Airyscan	100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol	Fisher scientific	10010240
Mini-extuder	Avanti Polar Lipids, Inc.	610000-1EA
1.5 mL Microtubes	Greiner	616201
MATLAB	Mathworks	R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm	Whatman	800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS)	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Plasma Cleaner	HARRICK PLASMA	PDC-002-HP
Quartz Nanochip	Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	T1395MP
Tweezer	Gooi	PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners	Elma	D-78224
Voterx	Scientific Industries	G560E
Vacuum Desiccator	NUCERITE	5312
Water Bath	Julabo	TW8