Système bicouche lipidique supporté par nanobar pour l’étude in vitro de protéines de détection de courbure membranaire

Résumé

Ici, un système bicouche lipidique soutenu par nanobar est développé pour fournir une membrane synthétique avec une courbure définie qui permet la caractérisation de protéines ayant une capacité de détection de courbure in vitro.

Résumé

La courbure de la membrane joue un rôle important dans divers processus essentiels des cellules, tels que la migration cellulaire, la division cellulaire et le trafic des vésicules. Il n’est pas seulement généré passivement par les activités cellulaires, mais régule également activement les interactions protéiques et est impliqué dans de nombreuses signaux intracellulaires. Ainsi, il est très utile d’examiner le rôle de la courbure de la membrane dans la régulation de la distribution et de la dynamique des protéines et des lipides. Récemment, de nombreuses techniques ont été développées pour étudier la relation entre la membrane courbe et la protéine in vitro. Par rapport aux techniques traditionnelles, la bicouche lipidique (SLB) nouvellement développée offre à la fois un débit élevé et une meilleure précision dans la génération de courbure de la membrane en formant une bicouche lipidique continue sur des réseaux à motifs de nanobarres avec une courbure membranaire prédéfinie et un contrôle plat local. La fluidité lipidique et la sensibilité des protéines aux membranes courbes peuvent être caractérisées quantitativement à l’aide de l’imagerie par microscopie à fluorescence. Ici, une procédure détaillée sur la façon de former un SLB sur des surfaces de verre fabriquées contenant des réseaux nanobar et la caractérisation des protéines sensibles à la courbure sur ces SLB sont introduites. En outre, les protocoles de réutilisation des nanopuces et de traitement d’images sont couverts. Au-delà du nanobar-SLB, ce protocole est facilement applicable à tous les types de copeaux de verre nanostructurés pour les études de détection de courbure.

Introduction

La courbure membranaire est un paramètre physique critique d’une cellule qui se produit dans une variété de processus cellulaires tels que la morphogenèse, la division cellulaire et la migration cellulaire¹. Il est maintenant largement reconnu que la courbure de la membrane est au-delà d’un simple résultat d’événements cellulaires; Au lieu de cela, il est apparu comme un régulateur efficace des interactions protéiques et de la signalisation intracellulaire. Par exemple, plusieurs protéines impliquées dans l’endocytose médiée par la clathrine se lient préférentiellement à la membrane incurvée, entraînant la formation d’un point chaud pour l’endocytose². Il existe de nombreuses causes différentes de déformation membranaire telles que l’attraction de la membrane par les forces du cytosquelette, la présence d’asymétrie lipidique avec des groupes de tête de différentes tailles, l’existence de protéines transmembranaires de forme conique, l’accumulation de protéines de formation de la membrane comme les protéines du domaine BAR (nommées d’après les protéines Bin, amphiphysine et Rvs), et l’insertion du domaine des hélices amphipathiques dans la membrane¹ . Fait intéressant, ces protéines et lipides non seulement déforment la membrane, mais peuvent également détecter la courbure de la membrane et présenter une accumulation préférentielle¹. Par conséquent, il est crucial d’étudier si et comment des membranes avec des courbures différentes modifient la distribution et la dynamique des protéines et des lipides qui leur sont attachés et les impacts potentiels sur les processus intracellulaires connexes.

De nombreuses techniques ont été développées pour analyser l’interaction entre la membrane incurvée et les protéines dans les cellules vivantes et les systèmes in vitro. Le système cellulaire vivant fournit un environnement cellulaire réel avec une riche diversité lipidique et une régulation dynamique de la signalisation des protéines 2,3,4,5,6,7. Cependant, un système aussi sophistiqué est difficile à étudier en raison des incertitudes et des fluctuations de l’environnement intracellulaire. Par conséquent, les essais in vitro utilisant une membrane artificielle composée d’espèces lipidiques connues et de protéines purifiées sont devenus de puissants systèmes de reconstitution pour caractériser la relation entre les protéines et les membranes courbes. Traditionnellement, des liposomes de différents diamètres sont générés par extrusion pour détecter les protéines sensibles à la courbure via soit un test de co-sédimentation utilisant la force centrifuge, soit un test de co-flottation avec un gradient de densité pour éviter l’agrégation des protéines ^8,9. Cependant, la courbure des liposomes extrudés est limitée par la taille des pores disponibles du filtre à membrane utilisé dans l’extrudeuse¹⁰. Il a été prouvé que le test de courbure mono-liposomique (SLiC) surmonte cette limitation, dans lequel des liposomes de différents diamètres sont marqués par fluorescence et immobilisés sur la surface afin que la courbure puisse être marquée par l’intensité fluorescente¹¹. Cependant, une forte variabilité de la composition lipidique a été observée dans les petites vésicules, ce qui affecte la précision de la mesure de la courbure¹². Les expériences de traction d’attache fournissent une mesure plus précise de la courbure sur l’attache transitoire tirée des vésicules unilamellaires géantes (GUV) à l’aide d’une pince optique, où la courbure peut être bien contrôlée par la tension membranaire générée^13,14. Cette méthode convient à l’étude des protéines de détection de courbure positive ou négative, mais elle est limitée par le débit de la génération de tubes¹⁰. Le test des tubes à membrane supportée (SMrT) permet la génération simultanée de plusieurs tubes à membrane qui sont extrudés à partir du même réservoir lipidique par des écoulements microfluidiques. Néanmoins, la courbure de la membrane varie intrinsèquement le long du nanotube, ce qui compromet la précision de la mesure de la courbure basée sur l’intensité de fluorescence^15,16. En comparaison, l’utilisation de petites vésicules unilamellaires (VUS, diamètre <100 nm¹⁷) pour former une bicouche lipidique supportée (SLB) sur des surfaces contenant des topographies conçues a généré une membrane bicouche unique avec des courbures prédéterminées par nanofabrication ou nanomatériaux de haute précision^18,19,20.

Ici, nous présentons un protocole pour la formation du SLB sur des surfaces de nanopuces fabriquées avec des réseaux nanobar et comment il peut être utilisé pour sonder la sensibilité à la courbure des protéines in vitro. Comme le montre la figure 1, le test comporte six composants essentiels : A) Nettoyage et assemblage de la puce avec une chambre microfluidique; B) Préparation de VUS avec une composition lipidique définie; C) Formation du SLB sur une nanopuce et liaison avec des protéines sensibles à la courbure; D) Imagerie et caractérisation des protéines sensibles au SLB et à la courbure sous microscopie à fluorescence; E) Nettoyage de la puce pour la réutiliser; F) Traitement d’images pour l’analyse quantitative de la capacité de détection de la courbure des protéines. Le protocole détaillé est décrit étape par étape ci-dessous.

Protocole

1. Nettoyage de la nanopuce

1. Placez la nanopuce dans un bécher de 10 mL avec le côté à motifs vers le haut.
   REMARQUE: Cette nanopuce de quartz a été fabriquée par lithographie par faisceau d’électrons comme décrit précédemment²¹. La géométrie et la disposition de la nanostructure sur la puce peuvent être conçues sur mesure. Les tailles des nanobarres de gradient utilisées ici sont de 2000 nm de longueur, 600 nm de hauteur et 100 à 1000 nm de largeur (pas à pas de 100 nm).
2. Ajoutez soigneusement 1 mL d’acide sulfurique à 98% dans le bécher et assurez-vous que l’acide recouvre complètement l’avant et l’arrière de la puce.
   REMARQUE: L’acide sulfurique à 98% est extrêmement corrosif et peut causer une destruction rapide des tissus et de graves brûlures chimiques au contact de la peau ou des yeux. Utilisez-le dans la hotte avec une protection appropriée.
3. Faites tourner lentement le bécher et ajoutez 200 μL de peroxyde d’hydrogène à 30% goutte à goutte jusqu’à ce que le bécher entier devienne chaud. S’assurer que l’acide sulfurique et le peroxyde d’hydrogène sont bien mélangés pour former une solution de piranha pour l’élimination des molécules organiques de la nanopuce¹⁷. Il existe d’autres techniques pour générer le SLB sur des surfaces hydrophiles propres, telles que l’exposition à la lumière UV et à l’ozone, comme décrit précédemment²³.
   REMARQUE: La réaction est extrêmement exothermique et peut faire bouillir la solution, alors ajoutez du peroxyde d’hydrogène à l’acide sulfurique goutte à goutte et continuez à tourner.
4. Placez le bécher dans un récipient en verre secondaire et gardez la nanopuce immergée dans la solution de piranha pendant la nuit pour nettoyer soigneusement les impuretés.
   REMARQUE: Placez le bécher dans la hotte sans aucun couvercle au cas où la réaction pourrait générer du gaz.
5. Sortez le bécher et pipeter soigneusement la solution de piranha dans un récipient à déchets acides.
6. Chargez 5 mL d’eau désionisée dans le bécher pour diluer l’acide résiduel et l’éliminer dans les déchets acides. Répétez cette étape cinq fois et utilisez 5 M NaOH pour neutraliser les déchets acides.
7. Prenez la puce avec une pince à épiler et lavez avec un jet continu d’eau désionisée pour éliminer complètement l’acide résiduel. Sécher la puce avec de l’azote gazeux à 99,9% pour la formation de SLB²².

2. Génération de petites vésicules unilamellaires (VUS)

1. Ajouter 100 μL de chloroforme dans un flacon ambré.
   REMARQUE: Le chloroforme est un liquide très volatil et incolore, et il peut être toxique s’il est inhalé ou avalé. Utilisez-le dans la hotte avec le masque et les gants.
2. Dissoudre 500 μg du mélange lipidique dans le chloroforme. La composition du mélange lipidique utilisé ici est de 89,5% en mole de phosphatidylcholines d’œuf (PC), 10% en mole de phosphatidylsérine cérébrale (PS) et 0,5% en mole de Texas Red 1,2-dihexadécanoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine, sel de triéthylammonium (Texas Red DHPE).
3. Sécher le mélange lipidique dans le flacon avec de l’azote gazeux à 99,9 % jusqu’à ce que le chloroforme soit volatilisé et que le mélange lipidique soit sec.
   REMARQUE: Cette étape doit être effectuée dans la hotte. Évitez les éclaboussures de liquide lors du brushing.
4. Placez le mélange lipidique présent dans le flacon ambré sans couvercle dans le dessiccateur sous vide recouvert d’une feuille d’aluminium. Sécher ensuite l’échantillon sous vide avec une pompe pendant 3 h pour volatiliser complètement le chloroforme.
5. Ajouter 250 μL de tampon de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans le flacon. Vortex la solution jusqu’à ce qu’elle soit homogène.
   REMARQUE : Le tampon PBS est constitué de 150 mM de NaCl, sans calcium, magnésium et rouge de phénol ; le pH est ajusté à 7,2 pour fabriquer la bicouche lipidique PC et PS.
6. Soniquer le mélange lipidique pendant 30 min à une fréquence de 50 kHz dans un sonicateur de bain. Ensuite, transférer le mélange lipidique dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et sceller avec un parafilm.
7. Congeler le mélange lipidique dans de l’azote liquide pendant 20 s puis décongeler à 42 °C pendant 2 min au bain-marie. Répétez les cycles de gel-dégel 30 fois. Après cela, le mélange lipidique ressemble à un liquide clair.
   ATTENTION : L’azote liquide a un point d’ébullition d’environ −195,8 °C. Il peut causer des engelures ou des brûlures cryogéniques. Utilisez-le dans l’espace non confiné avec des gants d’isolation thermique.
8. Rincez deux seringues étanches au gaz en verre et le connecteur de la mini-extrudeuse avec de l’éthanol, du chloroforme et du méthanol respectivement. Répétez la séquence de rinçage cinq fois pour prénettoyer l’appareil. Laissez-les dans la hotte jusqu’à ce que le solvant organique soit complètement volatilisé.
9. Assemblez l’appareil de mini-extrudeuse et passez 500 μL de tampon PBS à travers le connecteur pour prémouiller l’appareil, puis jetez le tampon d’une autre seringue. Cette étape élimine les impuretés et facilite l’extrusion.
10. Assembler l’appareil de mini-extrudeuse avec une membrane filtrante en polycarbonate de la taille d’un pore de 100 nm.
    REMARQUE: La taille des pores de la membrane filtrante détermine le diamètre des liposomes.
11. Prenez 500 μL de tampon PBS avec l’une des seringues et poussez-le doucement à travers le filtre pour remplir la deuxième seringue vide à l’autre extrémité. Répétez l’extrusion trois fois pour vérifier la fuite de l’appareil et jetez le tampon de la deuxième seringue.
12. Passez le mélange lipidique à travers la mini extrudeuse pour remplacer le tampon PBS. Ensuite, extrudez d’avant en arrière 20 fois pour former des VUS. Le caractère multilamellaire des vésicules peut être conservé avec un nombre insuffisant de temps d’extrusion, ce qui affectera la formation de SLB²³.
13. Récupérez les VUS de la deuxième seringue pour réduire la contamination par des particules plus grosses et transférez-les dans un tube à centrifuger de 1,5 mL.
    REMARQUE: Retirez la seringue directement du connecteur au cas où la seringue se détacherait.
14. Enveloppez le tube avec du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment des lipides marqués par fluorescence et conservez-les à 4 °C. Habituellement, les VUS peuvent être stockés jusqu’à 7 jours.

3. Formation du SLB sur une nanopuce

1. Retirez soigneusement la nanopuce nettoyée de l’eau désionisée avec une pince à épiler et séchez-la avec 99,9% d’azote gazeux.
2. Effectuer le nettoyage de surface de la nanopuce avec un traitement plasma à l’air pendant 1 h.
3. Assemblez la nanopuce dans une chambre de polydiméthylsiloxane (PDMS), composée de deux morceaux de PDMS-un PDMS intermédiaire et d’un PDMS supérieur (Figure 1A). Le PDMS moyen est mince (~0,5 mm) avec une grande ouverture de forme ovale au centre pour assurer une exposition suffisante au motif nanobar. Le PDMS supérieur est épais (~ 4,0 mm) avec deux petits trous dans la grande ouverture ovale comme entrée et sortie pour la manipulation des liquides.
   1. Placez la puce sur une surface propre avec le motif vers le haut.
   2. Couvrez délicatement le PDMS central avec la puce et assurez-vous que l’ensemble du motif est exposé à la zone centrale de la grande ouverture ovale dans le PDMS central.
   3. Couvrez le PDMS supérieur avec le PDMS du milieu et gardez ses deux petits trous dans la région du grand trou ovale du PDMS du milieu. Ensuite, la chambre PDMS est assemblée.
      REMARQUE: PDMS est le polymère organique à base de silicium le plus largement utilisé. Il est biocompatible, transparent et déformable pour être conçu comme une forme personnalisée pour l’assemblage de puces et l’imagerie au microscope. Plus important encore, il peut être collé de manière covalente à une autre couche PDMS ou à un verre étroitement après le traitement au plasma, ce qui le rend approprié comme chambre pour préparer le SLB. Cette étape garantit que chaque couche de PDMS est bien ajustée pour éviter les lacunes et les fuites.
4. Chargez les VUS dans la chambre PDMS à partir de l’un des deux petits trous dans le PDMS supérieur avec une pipette et incuber pendant 15 minutes à température ambiante pour former le SLB.
5. Pipeter doucement le tampon PBS dans la chambre PDMS d’un côté du petit trou et retirer les déchets avec un coton-tige de l’autre trou pour laver les VUS non liés. Acquérir ensuite le SLB formé sur la nanopuce (la qualité du SLB est testée par récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) comme indiqué à l’étape 4.4 et discuté dans la section des résultats représentatifs).
   REMARQUE: Lors de la pipetage du tampon PBS dans la chambre, l’embout de la pipette doit être plein du tampon et en contact avec la surface du liquide pour éviter l’injection de bulles.

4. Imagerie du SLB et de la liaison à la protéine de détection de courbure sur la nanopuce

REMARQUE: Cette section dépendra du système de microscope disponible pour l’expérience. Ici, une ligne directrice générale sur la façon d’effectuer l’imagerie sera décrite. Les réglages détaillés peuvent être modifiés entre les différentes configurations de microscope.

1. Configurez la microscopie confocale à balayage laser à l’aide d’un objectif d’huile 100x (N.A.1.4). Ouvrez le logiciel ZEN pour sélectionner la puissance laser d’excitation qui peut exciter la fluorescence du lipide et de la protéine. Choisissez le mode d’acquisition > Smart Setup > Texas Red DHPE / EGFP.
2. Ajustez la mise au point avec le bouton de mise au point pour localiser les nanobarres sur la puce jusqu’à ce que les bords nanobar soient nets sous le canal lipidique.
3. Définissez les paramètres de balayage comme ci-dessous pour obtenir une image de contrôle du canal lipidique avant d’ajouter une protéine : Taille de trame = 512 px x 512 px (512 pixels x 512 pixels, une taille de pixel de 124 nm), Bits par pixel = 16 (profondeur de 16 bits), Vitesse de numérisation = 5 et Moyenne = 4 (mode de moyenne de quatre fois/ligne).
4. Effectuer le test FRAP en blanchissant la bicouche lipidique marquée par fluorescence sur une seule zone nanobar aléatoire.
   1. Cochez les cases Régions d’expérimentation et Blanchiment . Dessinez une zone circulaire de 5 μm de diamètre qui peut inclure la nanobarre entière au centre (la taille nanobar est de 2 μm) et ajoutez-la aux régions expérimentales. Entrez les paramètres d’imagerie time-lapse comme exemple suivant : choisissez Vitesse de numérisation = 9 et Moyenne = 1. Choisissez Série chronologique > Durée = 100 cycles et Intervalle = 2 s. Entrez les paramètres de blanchiment comme exemple suivant : cochez la case Démarrer après # images et choisissez trois images.
   2. Cochez les cases laser qui exécutent FRAP et modifiez l’alimentation à 100,0 %. Cliquez sur Démarrer l’expérience pour l’expérience FRAP.
      REMARQUE: FRAP est une méthode courante pour caractériser la mobilité des molécules cellulaires. Si le SLB a une bonne fluidité, la fluorescence dans la zone blanchie se rétablira progressivement à mesure que les fluorophores blanchis diffusent et que les fluorophores non blanchis d’autres zones diffusent à l’intérieur.
5. Chargez la solution protéique dans la chambre PDMS et incuber pendant 5 min à température ambiante pour permettre la liaison de la protéine sur le SLB.
   NOTE: Les protéines utilisées dans la figure 2G,H pour démontrer la composition lipidique facilitent la liaison des protéines sur les SLB courbés nanobar sont 74 μM GFP et 79 μM GFP-His. Ces deux protéines sont des protéines de fluorescence verte sans ou avec His-tag. Les protéines utilisées pour l’étude de détection de la courbure dans les figures 4 et 5 sont 16 μM F-BAR, 16 μM IDR FBP17 et 16 μM FBAR+IDR^FBP17. Ces trois protéines sont les domaines de FBP17, qui est une protéine BAR typique qui est intuitivement supposée à la fois comme générateurs de courbure et capteurs. Chaque volume de protéines est de 20 μL.
6. Refocalisez les nanobarres et répétez l’étape 4.3 pour prendre des images des canaux lipidiques et protéiques pour la détection de la courbure des protéines.
7. Répétez l’étape 4.4 pour effectuer le test FRAP sur les canaux lipidiques et protéiques et effectuer une imagerie accélérée pour caractériser la mobilité de la protéine de détection de courbure.

5. Réutilisation de la nanopuce

1. Prenez la nanopuce avec une pince à épiler et détachez-la soigneusement de la chambre PDMS dans un bécher de 50 ml rempli d’eau désionisée.
   REMARQUE : Il s’agit d’une étape critique. Empêchez les pincettes de toucher la nanostructure et ne forcez pas la puce à se séparer pour éviter les fissures.
2. Lavez soigneusement la nanopuce avec de l’éthanol anhydre pour éliminer les résidus organiques fixés à la surface.
   REMARQUE: Utilisez du papier de soie propre pour éliminer l’eau sur la surface avant de laver avec de l’éthanol anhydre.
   ATTENTION : L’éthanol anhydre est un produit chimique très volatil et légèrement dangereux. Évitez tout contact avec la peau et les yeux. Utilisez-le dans la hotte avec le masque et les gants.
3. Lavez soigneusement la puce avec beaucoup d’eau désionisée pour éliminer l’éthanol résiduel. Ensuite, séchez la puce avec 99,9% d’azote gazeux.
   NOTE: Il est important d’éliminer toute trace d’éthanol sur la puce avant de passer à l’étape suivante car l’acide piranha peut réagir violemment avec le solvant organique et peut provoquer des explosions.
4. Placez la puce dans un bécher propre de 10 mL avec le côté du motif vers le haut et nettoyez la puce avec une solution de piranha pour la réutilisation qui suit les mêmes étapes que le « nettoyage de la nanopuce ».

6. Quantification de l’image

1. Faire pivoter les images acquises par un microscope de sorte que le réseau nanobar soit en position verticale pour une analyse ultérieure dans le logiciel Fidji.
2. Utilisez un code MATLAB personnalisé « c_pillarmask_averaging » pour localiser la nanobarre individuelle par un masque carré (51 pixels x 51 pixels) à la fois dans le canal lipidique et le canal protéique.
   REMARQUE: Ce code MATLAB est spécialement conçu pour la nanopuce. Il peut être obtenu sur GitHub via le lien: https://github.com/wtzhaolab/GNB_SLB_MX.
3. Soustrayez les signaux d’arrière-plan de chaque image avec les trois ROI (5 pixels x 5 pixels) aux coins de l’image par la fonction maillage dans le code MATLAB 'BarGra_avg'. Cette opération vise à corriger les bruits de fond inégaux potentiels causés par la configuration du microscope ou le nivellement de la puce sur la scène du microscope.
4. Générez les images moyennes des nanobarres de même taille à l’aide du code MATLAB « BarGra_avg », où chaque point est la moyenne des valeurs à ce point dans tous les masques carrés nanobarres individuels. Générez des tracés de surface 3D des images moyennes dans le logiciel Fidji pour montrer intuitivement la distribution moyenne du signal autour des nanobarres. Choisissez Analyze > Surface Plot > Input 100 pour Polygon Multiplier, puis cochez les cases Shade, Draw Axis (Axe de dessin) et Smooth (Lisse).
5. Segmentez chaque nanobarre en trois zones, qui comprennent deux zones d’extrémité nanobar et une zone de centre nanobarre pour extraire leurs intensités de fluorescence respectivement par le code MATLAB « avg_nanobar_quantification ». Les tailles des ROI nanobar sont ajustées en fonction de la dimension des nanobarres à l’aide du fichier 'position'.
6. Divisez les intensités protéiques par les intensités lipidiques extraites du code MATLAB 'avg_nanobar_quantification' à l’extrémité de la barre pour obtenir la densité nanobar-extrémité qui exclut l’effet de surface.
7. Tracez la densité d’extrémité nanobar avec différentes concentrations dans GraphPad Prism pour obtenir la courbe de liaison. Ouvrez le menu Analyser . Choisissez Régression non linéaire (ajustement de la courbe) > Liaison - Saturation > Liaison spécifique avec fonction de pente de Hill pour ajuster la courbe à l’équation de Hill, puis calculez la valeur du coefficient KD et Hill.
8. Les intensités lipidiques et protéiques sont normalisées à leurs intensités correspondantes au centre nanobarres de 600 nm acquis dans la même image à l’aide du code MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
9. Utilisez les neuf pixels les plus brillants d’intensités protéiques normalisées à la zone d’extrémité nanobar divisée par la zone centrale de la barre pour quantifier la détection de la courbure des protéines avec des nanobarres de même taille, la valeur est appelée « rapport de bout en bout ». Utilisez le rapport de l’intensité protéique normalisée pour normaliser l’intensité lipidique afin de quantifier la plage de détection de la courbure des protéines avec des nanobarres de différentes tailles, la valeur est appelée « Densité nanobar-extrémité normalisée ». Ces valeurs sont calculées par le code MATLAB 'avg_nanobar_quantification'.
10. Chargez l’image de la pile FRAP dans le logiciel Fidji. Choisissez la zone FRAP et générez un retour sur investissement. Choisissez la fonction Plus > Multi mesures pour mesurer l’intensité de la zone FRAP pour chaque fois. Tracez l’intensité dans GraphPad Prism pour générer la courbe de récupération FRAP.

Résultats

La conception nanobar est recommandée pour sonder les protéines de détection de courbure positive, qui contient un demi-cercle à chaque extrémité avec une courbure définie par la largeur nanobar et un contrôle de courbure plate/nulle localement au centre (Figure 2A, B). La formation réussie du SLB sur les nanobarres entraîne une distribution uniforme des signaux de marqueurs lipidiques sur toute la surface nanobaraire, comme le montre la figure...

Discussion

Le système nanobar-SLB décrit ici offre une combinaison unique des avantages de plusieurs tests in vitro existants. Il révèle efficacement la liaison préférentielle des protéines aux membranes très incurvées comme le test de flottaison ou de sédimentation des liposomes, mais nécessite beaucoup moins d’échantillons et offre une courbure plus précisément définie sur des nanobarres individuelles ^8,29. Il offre également une large gamme de ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous Ethanol	Sigma-Aldrich	100983
Aluminum foil	Diamond	RN0879999FU
Amber Vial	Sigma-Aldrich	27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840032
10 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211060804
50 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211061706
1000 mL Beaker	Schott-Duran	SCOT211065408	The second container
Chloroform	Sigma-Aldrich	V800117
Cotton buds	Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt)	Avanti Polar Lipids, Inc.	790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken)	Avanti Polar Lipids, Inc.	840051
F-BAR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
F-BAR+IDR	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GFP-His	Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore		Proteins and peptide
GraphPad Prism	GraphPad	V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS)	Thermo Scientific	H325-500
IDR from human FBP17	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ	National Institutes of Health	1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy	Zeiss	LSM 800 with Airyscan	100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol	Fisher scientific	10010240
Mini-extuder	Avanti Polar Lipids, Inc.	610000-1EA
1.5 mL Microtubes	Greiner	616201
MATLAB	Mathworks	R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm	Whatman	800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS)	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker	Dow Corning Corporation	SYLGARD 184
Plasma Cleaner	HARRICK PLASMA	PDC-002-HP
Quartz Nanochip	Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	795429
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt	Life Technologies Holdings Pte Ltd.	T1395MP
Tweezer	Gooi	PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners	Elma	D-78224
Voterx	Scientific Industries	G560E
Vacuum Desiccator	NUCERITE	5312
Water Bath	Julabo	TW8