تقنية معدلة لتضيق الأبهر المستعرض في الفئران

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية معدلة ومبسطة مع إجراء انقباض الأبهر المستعرض (TAC) طفيف التوغل باستخدام مبعدة عصامي. يمكن إجراء هذا الإجراء بدون جهاز التنفس الصناعي أو المجهر ويؤدي إلى زيادة الضغط ، مما يؤدي في النهاية إلى تضخم القلب أو فشل القلب.

Abstract

انقباض الأبهر المستعرض (TAC) هو عملية جراحية تستخدم بشكل متكرر في الأبحاث المتعلقة بفشل القلب وتضخم القلب بناء على تكوين الحمل الزائد للضغط في نماذج الفئران. يتمثل التحدي الرئيسي لهذا الإجراء في تصور قوس الأبهر المستعرض بوضوح وتحديد الوعاء المستهدف بدقة. تقوم الأساليب الكلاسيكية بإجراء بضع الصدر الجزئي لكشف قوس الأبهر المستعرض. ومع ذلك ، فهو نموذج للصدر المفتوح يسبب صدمة جراحية كبيرة إلى حد ما ويتطلب جهاز التنفس الصناعي أثناء الجراحة. لمنع الصدمات غير الضرورية وتبسيط إجراءات التشغيل ، يتم الاقتراب من قوس الأبهر عبر النسبة القريبة من القص ، والوصول إلى الوعاء المستهدف وربطه باستخدام ضامد صغير عصامي يحتوي على فخ. يمكن إجراء هذا الإجراء دون دخول تجويف غشاء الجنب ولا يحتاج إلى جهاز التنفس الصناعي أو الجراحة المجهرية ، مما يترك الفئران مع أنماط التنفس الفسيولوجية ، ويبسط الإجراء ، ويقلل بشكل كبير من وقت العملية. نظرا للنهج الأقل توغلا ووقت التشغيل الأقل ، يمكن للفئران الخضوع لتفاعلات إجهاد أقل والتعافي بسرعة.

Introduction

قصور القلب هو أحد الأعراض السريرية المعقدة التي تنتج عن ضعف بنية ووظيفة ملء البطين أو إخراج الدم¹. يتم تحديد مرحلة المرض بشكل أساسي من خلال تصنيف وظيفة جمعية القلب في نيويورك بناء على شدة الأعراض والنشاط البدني². بالنسبة لأولئك المرضى الذين لديهم جزء طرد يزيد عن 50٪ ، فإن التشوهات الهيكلية و / أو الوظيفية أثارت الببتيدات الناتريوتريك لدعم تشخيص قصور القلب مع الكسر القذفي المحفوظ (HFpEF) ². مرض القلب الإقفاري هو السبب الرئيسي بين مسببات متعددة لفشل القلب. وبالتالي ، غالبا ما يستخدم نموذج احتشاء عضلة القلب (مثل ربط الشريان التاجي الدائم) لدراسة الفيزيولوجيا المرضية بعد نقص تروية القلب أو إصابة نقص التروية ^3,4. إلى جانب إصابة عضلة القلب الحادة ، تساهم عوامل الخطر الأخرى مثل ارتفاع ضغط الدم والسكري والسمنة والتاريخ العائلي لاعتلال عضلة القلب أيضا في تطور قصور القلب. بعد اجتياز المرضى المرحلة A (المعرضين لخطر الإصابة بقصور القلب) ودخول المرحلة B (ما قبل قصور القلب) ، يحدث التعديل الهيكلي¹. على سبيل المثال ، يمر مرضى ارتفاع ضغط الدم أولا بتضخم البطين الأيسر التكيفي ، ثم يتطورون تدريجيا إلى تضخم القلب غير القادر على التكيف والعبور إلى قصور القلب من خلال إعادة التشكيل المرضي⁵.

كمرحلة نهائية من أمراض القلب والأوعية الدموية المختلفة ، تمت دراسة قصور القلب المزمن لعقود⁶. تم استخدام نماذج الفئران المتعددة على نطاق واسع في أبحاث قصور القلب ، بما في ذلك ضخ الأدوية (أنجيوتنسين II) ، واضطرابات التمثيل الغذائي (مرض السكري أو النظام الغذائي عالي السعرات الحرارية) ، وانقباض الأبهر⁷. من بين هذه النماذج ، يصاحب نضح الأنجيوتنسين II آثار جانبية مختلفة للأعضاء ، مثل الكلى⁷. عادة ما تتطلب الاضطرابات الأيضية المستحثة فترة طويلة من الزمن. وقد اعتبر أن انقباض الأبهر الصاعد له صلة محدودة بالأمراض البشرية⁷.

TAC هو نموذج موثوق به يزيد من الحمل اللاحق ويحفز تضخم القلب وكذلك قصور القلب⁸. تم وصف نموذج TAC مفتوح الصدر لأول مرة بواسطة Rockman et al. وتم استخدامه في العديد من المختبرات حول العالم⁹. ومع ذلك ، فإن إجراء TAC الكلاسيكي هذا يسبب صدمة كبيرة إلى حد ما للفئران ويغير سلوكها الطبيعي ، الأمر الذي قد يستغرق وقتا طويلا للشفاء ويزعج المزيد من العلاج¹⁰. أدت إجراءات TAC المعدلة الأخرى المغلقة الصدر إلى تقليل بعض الخطوات الغازية ولكنها تتطلب مهارات جراحية مجهرية أو تهوية ميكانيكية^10,11.

يفصل البروتوكول الحالي طريقة خطوة بخطوة مع نهج طفيف التوغل لقوس الأبهر باستخدام مبعدة عصامي عبر شق خط الوسط 3 مم للحافة العلوية من القص. لا يحتاج هذا النموذج إلى مهارة جراحية مجهرية أو تهوية ميكانيكية أو قطع الأضلاع ، وبالتالي توفير طريقة جراحية سريعة ومحدودة الصدمات وغير معقدة وغير مكلفة لإجراء جراحة TAC.

Protocol

تمت الموافقة على البروتوكول الحالي من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى تونغجي ، كلية تونغجي الطبية ، جامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا ، ووهان ، الصين. يتم تنفيذ هذا الإجراء على ذكور الفئران البالغة C57 / BL6 (> 10 أسابيع من العمر). تم تعقيم جميع الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم قبل العملية.

1. إعداد أداة جراحية

1. قم بإعداد حقنة سعة 5 مل واضغط على طرف الإبرة بحامل إبرة لتخفيفها.
2. تحضير إبرة 27 غرام وفدها مع حامل الإبرة. يعد قطع طرف الإبرة بمقص العيون طريقة بديلة لإضعاف الإبرة.
3. ثني طرف إبرة 27 G 90 درجة.
   ملاحظة: سيتم استخدام هذه الإبرة كفاصل للربط مع الشريان الأورطي لانقباض الأوعية.
4. استخدم سلكا حديديا تم الحصول عليه تجاريا (درجة طبية ، قطرها 0.5 مم ، انظر جدول المواد) وخيوط حول الإبرة (الشكل 1 أ). شكل فخا صغيرا أو حلقة عند الطرف الحاد للإبرة (الشكل 1 ب).
   ملاحظة: تعمل هذه الأداة القابلة لإعادة الاستخدام كمبعدة خاصة ذاتية الصنع وتسمح للمرء بتمرير خياطة الحرير تحت الشريان الأورطي في الخطوات الأخيرة.
5. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل الجراحة (بما في ذلك المبعدة الخاصة المذكورة أعلاه) لتعقيمها.

2. إعداد الحيوان

1. تخدير الفأر عن طريق الحقن داخل الصفاق لمحلول الصوديوم بنتوباربيتال (50 مجم / كجم ، انظر جدول المواد) وفقا لوزن الجسم. حقن تحت الجلد 100 ميكرولتر من 0.5٪ يدوكائين محليا في منطقة الجراحة.
2. تأكد من تخدير الماوس بالكامل عن طريق قرص إصبع قدم الماوس بطرف الملقط.
3. ضع مرهم العيون على كلتا العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
4. إزالة الشعر من الحلق وأعلى الصدر مع كريم مزيل الشعر أو مقص.
5. تطهير المنطقة الخالية من الشعر مع ثلاثة الدعك بالتناوب من اليود و 70 ٪ من الإيثانول في دوائر متحدة المركز تتحرك إلى الخارج.
6. ضع الماوس في وضع الاستلقاء على وسادة تدفئة مغطاة بستارة معقمة مع توجيه رأسه إلى المشغل. ثبت الأطراف بشريط لاصق وقواطع بخياطة 4-0 (الشكل 2 أ).
7. أدخل مسبار المستقيم (انظر جدول المواد) لمراقبة درجة حرارة الجسم أثناء العملية. الحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية خلال العملية بأكملها.
8. ارتد زوجا من القفازات المعقمة.
   ملاحظة: بمجرد ارتداء القفازات المعقمة ، لا تلمس المناطق أو الأشياء الأخرى غير المعقمة.
9. قطع حفرة (قطرها 1-1.5 سم) في ستارة معقمة جديدة يمكن التخلص منها مع مقص العيون المعقمة. ضع الستارة المعقمة فوق الماوس وتأكد من أن مجال التشغيل غير المشعر مرئي من خلال الفتحة.
   ملاحظة: تسمح هذه الخطوة للمشغل بتجنب لمس المناطق الأخرى غير المعقمة ، مما يساعد في الحفاظ على الظروف المعقمة أثناء الجراحة.

3. انقباض الشريان الأورطي المستعرض

1. قم بعمل شق جلدي عمودي بطول 1.5 سم على مستوى الشق فوق القصي (الشكل 2 ب) بشفرة مشرط. قم بتوسيع شق الجلد وصولا إلى مستوى الزاوية القصية.
   ملاحظة: الشق فوق القصي هو شق يقع على الحافة العلوية من القص manubrium. إنه رمز سطحي يمكن اكتشافه عند إزالة شعر الفأر (الشكل 2 ب). الزاوية القصية هي المفصل بين manubrium sterni و corpora sterni. عندما يتعرض القص ، فإنه يظهر كخط أبيض أفقي على القص عند نفس المستوى من كوستا سيكوندا (الشكل 2C).
2. افصل بعناية الجلد واللفافة السطحية وفضح القصبة الهوائية والقص القريب. قم بعمل شق طولي في خط الوسط مقاس 3-4 مم بعناية إلى القص بدءا من الحافة العلوية إلى الزاوية القصية (الشكل 2 د).
   ملاحظة: يجب ألا يتجاوز القطع الزاوية القصية ، لأن هناك خطر التسبب في استرواح الصدر الحاد في الماوس.
3. ارفع القص برفق باستخدام الملقط والغدة الصعترية والشريان الأورطي القوسي تحته. استخدم ملقط مستقيم بعناية وقم بتشريح الوعاء المستهدف والأنسجة المحيطة به بصراحة.
4. أمسك الضامد الذي سبق صنعه ذاتيا (الخطوة 1.4) والذي يحتوي على فخ سلكي في نهاية اليد اليمنى للمستخدم.
5. مرر بعناية فخ المبعدة العصامي تحت الشريان الأورطي بين الشريان السباتي المشترك الأيسر وأصل الشريان السباتي الأيمن (الشكل 2E).
6. مرر المبعثر العصامي إلى اليد اليسرى لتجنيب اليد اليمنى للأدوات الأخرى.
7. مع ملاقط مجهرية في اليد اليمنى ، مرر خياطة حريرية 7-0 عبر حلقة الفخ في النهاية واسحب المبتور. سيسمح ذلك بترك خياطة الحرير حول الشريان لمزيد من الربط (الشكل 2F).
   ملاحظة: كن لطيفا ولا تسحب قوس الأبهر كثيرا من موضعه الأصلي.
8. ضع إبرة 27 جم موازية للشريان الأورطي واربط الخيط حول الإبرة والشريان الأورطي (الشكل 2G ، H).
   ملاحظة: يجب أن يكون الإجراء الوهمي هو نفسه ، باستثناء عدم وجود ربط الشريان الأورطي.
9. تمسك بإبرة 27 G باستخدام ملقط عيني وملقط آخر يحمل العقدة المربوطة بإبرة 27 G والشريان الأورطي. اسحب إبرة 27 G بسرعة ولكن برفق من الربط (الشكل 2H).
   ملاحظة: يجب ألا تكون العقدة ضيقة جدا ، وإلا فلن يكون من السهل سحب الإبرة. كن حذرا عند سحب الإبرة في حالة تمزق الشريان الأورطي.
10. خياطة الجلد مع 4-0 خياطة حيدة الاصطناعية في نمط خياطة متقطعة (الشكل 2I).

4. رعاية ما بعد الجراحة

1. ضع الماوس على وسادة دافئة (انظر جدول المواد) وانتظر حتى ينتعش. بشكل عام ، ينعش الماوس في حوالي 60 دقيقة.
   ملاحظة: يجب عدم ترك الحيوان دون مراقبة حتى يستعيد وعيه الكافي للاستلقاء القصي الرئيسي.
2. حقن 0.5 مل من المحلول الملحي الدافئ تحت الجلد ومراقبة توازن السوائل للحيوانات.
   ملاحظة: هذه الخطوة تمنع الحيوانات من الجفاف وحالة الدورة الدموية نقص حجم الدم.
3. ضع مرهم الاريثروميسين على سطح الجرح كل يوم لمدة 3 أيام.
4. لعلاج الألم بعد الجراحة، يتم تطبيق 1 ملغ/لتر من مخدر البوبرينورفين الموضعي بالحقن في موقع الشق (انظر جدول المواد).
5. بعد الجراحة ، راقب الفأر بحثا عن علامات العدوى والضعف (سوء التغذية ، والموقف المنحني ، والفراء المكشكش).
   ملاحظة: لا يتم إرجاع الحيوانات التي خضعت لعملية جراحية إلى صحبة الحيوانات الأخرى حتى تتعافى تماما.

5. التصوير بالموجات فوق الصوتية

1. تأكد من الربط الناجح للشريان الأورطي المستعرض عن طريق حساب سرعة تدفق الدم عبر نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية^12,13 (24 ميجاهرتز ، انظر جدول المواد) بعد 28 يوما من الجراحة.
   1. تخدير الحيوان بنسبة 4.5٪ إيزوفلوران في 20٪ هواء غني بالأكسجين والحفاظ على 0.5٪ إيزوفلوران في 20٪ هواء غني بالأكسجين.
   2. ضع الماوس في وضع ضعيف وقم بتثبيت أطرافه على القطب بشريط لاصق.
   3. باستخدام كريم مزيل الشعر ، قم بإزالة شعر الصدر وتطبيق عامل اقتران بالموجات فوق الصوتية على الصدر.
   4. قم بإمالة المنصة إلى اليسار قدر الإمكان. مع الحفاظ على المسبار في الوضع الرأسي ، قم بخفضه تدريجيا على طول الخط شبه القصي الأيمن على الصدر مع الإشارة إلى ذقن الحيوان.
   5. تحت الوضع B للجهاز ، اضبط المحور X و Y حتى يصبح قوس الأبهر وموقع الانقباض مرئيين بوضوح.
   6. انقر فوق الزر دوبلر بموجة النبض للتبديل إلى وضع موجة النبض.
   7. اضبط مربع حجم عينة المؤشر المتقطع البعيد عن الموقع الضيق وابحث عن النفاثة التضيقية بأعلى سرعة.
   8. انقر على زر دوبلر بموجة النبض مرة أخرى للحصول على الشكل الموجي لتدفق الأبهر وقياس سرعة الذروة. احسب سرعة تدفق الدم وفقا لذروة أنماط الموجة (الشكل 3 أ ، ب).
   9. اضبط جهاز التصوير على الوضع B. ضع المنصة في الوضع الأفقي. قم بتدوير المسبار 30 درجة إلى خط القص الأيسر.
   10. اضبط المحور X و Y للحصول على عرض محور قصير. اضغط على الوضع M لإظهار خط المؤشر وانقر على Cine Store لحفظ الصورة للقياس اللاحق لسمك جدار القلب وأبعاد الغرفة والكسر القذفي.
       ملاحظة: صيغة حساب الكسر القذفي: 100٪ * ((LV Vol ؛ d - LV Vol ؛ s) / LV Vol ؛ d). صيغة حساب النتاج القلبي: حجم السكتة الدماغية * معدل ضربات القلب (في الإطار الأول المرسوم) / 1000. يمكن قياس معظم المؤشرات مثل الكسر القذفي والنتاج القلبي تلقائيا عبر برنامج نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية. LV Vol ؛ d: الحجم الانبساطي للبطين الأيسر. LV Vol;s: الحجم الانقباضي للبطين الأيسر.

النتائج

بعد جراحة TAC الناجحة ، تم الكشف عن الحمل الزائد للضغط باستخدام نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية. بعد أربعة أسابيع من الجراحة ، تصاب الفئران بانخفاض وظائف القلب. في الدراسة الحالية ، تم التحقق من فعالية جراحة TAC عن طريق الكسر القذفي (EF) ، والتقصير الجزئي (FS) ، وكتلة البطين الأيسر (كتلة LV) ...

Discussion

يمكن أن يؤدي تحريض الحمل الزائد المستمر للضغط تدريجيا إلى تضخم القلب وفشل القلب. تم استخدام هذا النموذج في العديد من المختبرات حول العالم¹⁴،^15،16. قدم البروتوكول طريقة TAC محسنة لا تحتاج إلى مهارات جراحية مجهرية أو تهوية ميكانيكية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM403	Used for suturing the skin
5 mL syringe	Haifuda Technology Co., Ltd.	BD-309628	Used for making snare containing retractor
7-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM701	Used for aorta ligation
Animal temperature monitor	Kaerwen	FT3400	Used for monitoring body temperature
Buprenorphine	Sigma	B-044	Used for post-surgical pain treatment
Depilatory cream	Veet	N/A	Used for remove body hair from the surgical area
Heating Pad	Xiaochuangxin	N/A	Used for maintaining body temperature
Ibuprofen	MCE	HY-78131	Used for post-surgical pain treatment
Iron wire (0.5 mm)	Qing Yuan	Iron wire #26	Used for making snare containing retractor
Microscopic tweezers	RWD	F12006-10	Used for penetrating and separating the tissue to open operation space
Needle holder	RWD	F12005-10	Used for pinching off the tip of gauge needle and blunting it
Ophthalmic forceps	RWD	F14012-10	Used for holding skin and other tissues
Ophthalmic scissors	RWD	S11001-08	Used for making sking incision of mouse
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	Used for mouse anesthesia
Sterile operating mat	Hale & hearty	211002	Used for placing animal during surgery
Ultra-sound imaging system	Fujifilm visualsonics	vevo1100	Used for measure the blood flow velocity, left ventricular wall thickness and ejection fraction, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100