Una tecnica modificata per la costrizione aortica trasversale nei topi

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una tecnica modificata e semplificata con una procedura di costrizione aortica trasversale mini-invasiva (TAC) utilizzando un divaricatore autocostruito. Questa procedura può essere condotta senza un ventilatore o un microscopio e introduce un sovraccarico di pressione, portando infine a ipertrofia cardiaca o insufficienza cardiaca.

Abstract

La costrizione aortica trasversa (TAC) è un intervento chirurgico frequentemente utilizzato nella ricerca sull'insufficienza cardiaca e l'ipertrofia cardiaca basata sulla formazione di sovraccarico di pressione nei modelli murini. La sfida principale di questa procedura è visualizzare chiaramente l'arco aortico trasversale e fasciare con precisione il vaso bersaglio. Gli approcci classici eseguono una toracotomia parziale per esporre l'arco aortico trasverso. Tuttavia, è un modello a torace aperto che causa un trauma chirurgico piuttosto grande e richiede un ventilatore durante l'intervento chirurgico. Per evitare traumi inutili e semplificare la procedura operativa, l'arco aortico viene avvicinato attraverso la proporzione prossimale dello sterno, raggiungendo e legando la nave bersaglio utilizzando un piccolo divaricatore autocostruito che contiene una trappola. Questa procedura può essere eseguita senza entrare nella cavità pleura e non richiede un ventilatore o un'operazione microchirurgica, che lascia i topi con schemi respiratori fisiologici, semplifica la procedura e riduce significativamente i tempi operativi. A causa dell'approccio meno invasivo e del minor tempo operativo, i topi possono subire meno reazioni di stress e recuperare rapidamente.

Introduzione

L'insufficienza cardiaca è un sintomo clinico complesso che deriva da una compromissione della struttura e della funzione del riempimento ventricolare o dell'espulsione del sangue¹. Lo stadio della malattia è definito principalmente attraverso la classificazione della funzione della New York Heart Association in base alla gravità dei sintomi e all'attività fisica². Per quei pazienti con una frazione di eiezione superiore al 50%, anomalie strutturali e/o funzionali hanno generato peptidi natriuretici per supportare la diagnosi di insufficienza cardiaca con frazione di eiezione conservata (HFpEF)². La cardiopatia ischemica è una delle principali cause tra le molteplici eziologie dell'insufficienza cardiaca. Pertanto, il modello di infarto miocardico (come la legatura coronarica permanente) viene spesso utilizzato per studiare la fisiopatologia dopo ipoperfusione cardiaca o danno da ischemia-riperfusione ^3,4. Oltre al danno miocardico acuto, altri fattori di rischio come ipertensione, diabete, obesità e una storia familiare di cardiomiopatia contribuiscono anche allo sviluppo di insufficienza cardiaca. Dopo che i pazienti superano lo stadio A (a rischio di insufficienza cardiaca) ed entrano nello stadio B (pre-insufficienza cardiaca), si verifica una modifica strutturale¹. Ad esempio, i pazienti ipertesi passano prima attraverso l'ipertrofia adattativa del ventricolo sinistro e poi gradualmente si sviluppano in ipertrofia cardiaca disadattiva e transitano verso l'insufficienza cardiaca attraverso il rimodellamento patologico⁵.

Come stadio terminale di varie malattie cardiovascolari, l'insufficienza cardiaca cronica è stata studiata per decenni⁶. Diversi modelli murini sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca sull'insufficienza cardiaca, tra cui l'infusione di farmaci (angiotensina II), i disturbi metabolici (diabete o dieta ad alto contenuto calorico) e la costrizione aortica⁷. Tra questi modelli, la perfusione dell'angiotensina II è accompagnata da vari effetti collaterali degli organi, come il rene⁷. L'induzione di disturbi metabolici di solito richiede un periodo di tempo piuttosto lungo. La costrizione aortica ascendente è stata considerata di scarsa rilevanza per la malattia umana⁷.

La TAC è un modello affidabile che aumenta il postcarico e induce ipertrofia cardiaca e insufficienza cardiaca⁸. Il modello TAC a torace aperto è stato descritto per la prima volta da Rockman et al. ed è stato utilizzato in numerosi laboratori in tutto il mondo⁹. Tuttavia, questa classica procedura TAC provoca un trauma piuttosto grande ai topi e cambia il loro comportamento normale, che può richiedere un lungo tempo di recupero e disturbare l'ulteriore trattamento¹⁰. Altre procedure TAC a torace chiuso modificate hanno ridotto alcuni passaggi invasivi, ma hanno richiesto abilità microchirurgiche o ventilazione meccanica^10,11.

Il presente protocollo descrive un metodo passo-passo con un approccio minimamente invasivo all'arco aortico utilizzando un divaricatore autocostruito tramite un'incisione della linea mediana di 3 mm del bordo superiore dello sterno. Questo modello non richiede abilità microchirurgiche, ventilazione meccanica o taglio attraverso le costole, fornendo così un modo rapido, limitato al trauma chirurgico, semplice ed economico per eseguire la chirurgia TAC.

Protocollo

L'attuale protocollo è approvato dal comitato etico del Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Cina. Questa procedura viene eseguita su topi maschi adulti C57/BL6 (>10 settimane di età). Tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati in autoclave prima dell'operazione.

1. Preparazione dello strumento chirurgico

1. Preparare una siringa da 5 mL e pizzicare la punta dell'ago con un portaago per smussarlo.
2. Preparare un ago da 27 G e smussarlo con un portaaghi. Tagliare la punta dell'ago con forbici oftalmiche è un modo alternativo per smussare l'ago.
3. Piegare la punta dell'ago da 27 G di 90°.
   NOTA: Questo ago verrà utilizzato come distanziatore per legare con l'aorta per la costrizione del vaso.
4. Utilizzare un filo di ferro ottenuto commercialmente (grado medico, 0,5 mm di diametro, vedi Tabella dei materiali) e spago attorno all'ago (Figura 1A). Formare una piccola trappola o un cappio sulla punta smussata dell'ago (Figura 1B).
   NOTA: Questo strumento riutilizzabile agisce come uno speciale divaricatore autocostruito e consente di passare la sutura di seta sotto l'aorta negli ultimi passaggi.
5. Autoclavare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'intervento chirurgico (compreso l'apposito divaricatore realizzato sopra) per sterilizzarli.

2. Preparazione degli animali

1. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di soluzione di pentobarbital sodico (50 mg/kg, vedere Tabella dei materiali) in base al peso corporeo. Per via sottocutanea iniettare localmente 100 μL di lidocaina allo 0,5% nell'area chirurgica.
2. Confermare che il mouse sia completamente anestetizzato pizzicando la punta del mouse con la punta della pinza.
3. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
4. Rimuovere i peli dalla gola e dalla parte superiore del torace con crema depilatoria o un tagliacapelli.
5. Disinfettare l'area non pelata con tre scrub alternati di iodio e etanolo al 70% in cerchi concentrici che si muovono verso l'esterno.
6. Posizionare il mouse in posizione supina su una piastra riscaldante coperta da un drappo sterile con la testa rivolta verso l'operatore. Fissare le estremità con nastro adesivo e incisivi con una sutura 4-0 (Figura 2A).
7. Inserire una sonda rettale (vedere Tabella dei materiali) per monitorare la temperatura corporea durante l'operazione. Mantenere la temperatura corporea a 37 °C durante l'intera operazione.
8. Indossare un paio di guanti sterili.
   NOTA: Una volta indossati i guanti sterili, non toccare altre aree o oggetti non sterilizzati.
9. Tagliare un foro (1-1,5 cm di diametro) in un nuovo drappo sterile monouso con forbici oftalmiche sterilizzate. Posizionare il drappo sterile sul mouse e assicurarsi che il campo operatorio non peloso sia visibile attraverso il foro.
   NOTA: Questo passaggio consente all'operatore di evitare di toccare altre aree non sterilizzate, il che aiuta a mantenere condizioni sterili durante l'intervento chirurgico.

3. Costrizione dell'aorta trasversale

1. Praticare un'incisione cutanea verticale di 1,5 cm a livello della tacca soprasternale (Figura 2B) con lama di bisturi. Espandere l'incisione cutanea fino al livello dell'angolo sternale.
   NOTA: La tacca soprasternale è una tacca situata sul bordo superiore dello sterni del manubrio. È un simbolo di superficie che può essere rilevato quando vengono rimossi i peli del topo (Figura 2B). L'angolo sternale è l'articolazione tra manubrium sterni e corpora sterni. Quando lo sterno è esposto, si presenta come una linea bianca orizzontale sullo sterno allo stesso livello della costa secunda (Figura 2C).
2. Separare accuratamente la pelle e la fascia superficiale ed esporre la trachea e la sternale prossimale. Effettuare con attenzione un'incisione longitudinale della linea mediana di 3-4 mm allo sterno partendo dal bordo superiore fino all'angolo sternale (Figura 2D).
   NOTA: Il taglio non deve superare l'angolo sternale, poiché esiste il rischio di causare pneumotorace acuto nel topo.
3. Sollevare delicatamente lo sterno con una pinza e il timo e l'arcus aortae sotto di esso. Utilizzare con attenzione una pinza dritta e sezionare senza mezzi termini la nave bersaglio e i tessuti circostanti.
4. Tenere il riavvolgitore precedentemente autocostruito (passaggio 1.4) che conteneva un laccio metallico all'estremità della mano destra dell'utente.
5. Passare con attenzione il laccio del divaricatore fatto da sé sotto l'aorta tra l'arteria carotide comune sinistra e l'origine dell'arteria innominata destra (Figura 2E).
6. Passa il divaricatore autocostruito alla mano sinistra per risparmiare la mano destra per altri strumenti.
7. Con una pinzetta microscopica nella mano destra, passare una sutura di seta 7-0 attraverso il cappio del laccio alla fine ed estrarre il divaricatore. Ciò consentirà di lasciare la sutura di seta intorno all'arteria per un'ulteriore legatura (Figura 2F).
   NOTA: Sii delicato e non trascinare troppo l'arco aortico dalla sua posizione originale.
8. Posizionare un ago da 27 G parallelamente all'aorta e legare la sutura attorno all'ago e all'aorta (Figura 2G,H).
   NOTA: La procedura fittizia dovrebbe essere la stessa, tranne per il fatto che non vi è alcuna legatura dell'aorta.
9. Tenere l'ago da 27 G con una pinza oftalmica e un'altra pinza che tiene il nodo legato all'ago da 27 G e all'aorta. Estrarre rapidamente ma delicatamente l'ago da 27 G dalla legatura (Figura 2H).
   NOTA: Il nodo non deve essere troppo stretto, altrimenti non sarà facile estrarre l'ago. Fare attenzione quando si estrae l'ago in caso di rottura dell'aorta.
10. Suturare la pelle con una sutura monofilamento sintetica 4-0 in uno schema di sutura interrotto (Figura 2I).

4. Assistenza postoperatoria

1. Posizionare il mouse su un pad caldo (vedere Tabella dei materiali) e attendere che si ravviva. Generalmente, il topo si rianima in circa 60 minuti.
   NOTA: L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando non riacquista sufficiente coscienza alla recumenza sternale principale.
2. Iniettare per via sottocutanea 0,5 ml di soluzione salina calda e monitorare l'omeostasi fluida degli animali.
   NOTA: Questo passaggio impedisce agli animali la disidratazione e lo stato di circolazione ipovolemica.
3. Applicare l'unguento eritromicina sulla superficie della ferita ogni giorno per 3 giorni.
4. Per il trattamento del dolore post-chirurgico, somministrare 1 mg/L di anestetico locale di buprenorfina per via parenterale al sito di incisione (vedere Tabella dei materiali).
5. Dopo l'intervento, monitorare il topo per segni di infezione e compromissione (malnutrizione, postura curva e pelliccia arruffata).
   NOTA: Gli animali sottoposti a intervento chirurgico non vengono restituiti alla compagnia di altri animali fino a quando non sono completamente recuperati.

5. Imaging ad ultrasuoni

1. Confermare la corretta legatura dell'aorta trasversale calcolando la velocità del flusso sanguigno tramite un sistema di imaging a ultrasuoni^12,13 (24 MHz^, vedere la tabella dei materiali) 28 giorni dopo l'intervento.
   1. Anestetizzare l'animale con isoflurano al 4,5% in aria arricchita di ossigeno al 20% e mantenere con isoflurano allo 0,5% in aria arricchita di ossigeno al 20%.
   2. Posizionare il mouse in posizione supina e fissare le estremità all'elettrodo con nastro adesivo.
   3. Utilizzando la crema depilatoria, rimuovere i peli del petto e applicare un agente di accoppiamento ad ultrasuoni sul petto.
   4. Inclinare la piattaforma verso sinistra il più lontano possibile. Mantenendo la sonda in posizione verticale, abbassarla gradualmente lungo la linea parasternale destra sul petto con la tacca rivolta verso il mento dell'animale.
   5. Sotto la modalità B dello strumento, regolare l'asse X e Y fino a quando l'arco aortico e il sito di costrizione sono chiaramente visibili.
   6. Fare clic sul pulsante Pulse Wave Doppler per passare alla modalità onda pulsata.
   7. Regolare la casella del volume del campione del cursore tratteggiato in modo distale sul sito ristretto e trovare il getto stenotico con la massima velocità.
   8. Fare nuovamente clic sul pulsante Pulse Wave Doppler per ottenere la forma d'onda del flusso aortico e misurare la velocità di picco. Calcolare la velocità del flusso sanguigno in base al picco dei modelli d'onda (Figura 3A,B).
   9. Impostare l'imager sulla modalità B. Appoggiare la piattaforma in posizione orizzontale. Ruotare la sonda di 30° rispetto alla linea parasternale sinistra.
   10. Regolate gli assi X e Y per ottenere una vista dell'asse corto. Premere la modalità M per visualizzare la linea dell'indicatore e fare clic su Cine Store per salvare l'immagine per una successiva misurazione dello spessore della parete cardiaca, della dimensione della camera e della frazione di eiezione.
       NOTA: La formula per il calcolo della frazione di eiezione: 100% * ((LV Vol;d - LV Vol;s) / LV Vol;d). La formula per il calcolo della gittata cardiaca: Volume dell'ictus * Frequenza cardiaca (al primo fotogramma disegnato) / 1000. La maggior parte degli indici come la frazione di eiezione e la gittata cardiaca possono essere misurati automaticamente tramite il software del sistema di imaging a ultrasuoni. LV Vol;d: volume diastolico del ventricolo sinistro. LV Vol;s: volume sistolico del ventricolo sinistro.

Risultati

Dopo il successo della chirurgia TAC, il sovraccarico di pressione è stato rilevato utilizzando un sistema di imaging ad ultrasuoni. Quattro settimane dopo l'intervento chirurgico, i topi sviluppano una diminuzione della funzione cardiaca. Nel presente studio, l'efficacia della chirurgia TAC è stata convalidata tramite frazione di eiezione (EF), accorciamento frazionato (FS), massa ventricolare sinistra (massa LV) e diametro interno ventricolare sinistro (LVID) di topi sottoposti a chirurgia TAC dopo 4 settima...

Discussione

L'induzione di un sovraccarico di pressione prolungato può gradualmente causare ipertrofia cardiaca e insufficienza cardiaca. Questo modello è stato utilizzato in numerosi laboratori in tutto il mondo^14,15,16. Il protocollo ha fornito un metodo TAC migliorato che non richiede competenze microchirurgiche o ventilazione meccanica.

Il passo più importante in questo protocollo è passare la sutura di s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM403	Used for suturing the skin
5 mL syringe	Haifuda Technology Co., Ltd.	BD-309628	Used for making snare containing retractor
7-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM701	Used for aorta ligation
Animal temperature monitor	Kaerwen	FT3400	Used for monitoring body temperature
Buprenorphine	Sigma	B-044	Used for post-surgical pain treatment
Depilatory cream	Veet	N/A	Used for remove body hair from the surgical area
Heating Pad	Xiaochuangxin	N/A	Used for maintaining body temperature
Ibuprofen	MCE	HY-78131	Used for post-surgical pain treatment
Iron wire (0.5 mm)	Qing Yuan	Iron wire #26	Used for making snare containing retractor
Microscopic tweezers	RWD	F12006-10	Used for penetrating and separating the tissue to open operation space
Needle holder	RWD	F12005-10	Used for pinching off the tip of gauge needle and blunting it
Ophthalmic forceps	RWD	F14012-10	Used for holding skin and other tissues
Ophthalmic scissors	RWD	S11001-08	Used for making sking incision of mouse
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	Used for mouse anesthesia
Sterile operating mat	Hale & hearty	211002	Used for placing animal during surgery
Ultra-sound imaging system	Fujifilm visualsonics	vevo1100	Used for measure the blood flow velocity, left ventricular wall thickness and ejection fraction, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100