טכניקה שונה להתכווצות רוחבית של אבי העורקים בעכברים

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקה שונה ופשוטה עם הליך היצרות אבי העורקים הרוחבי (TAC) זעיר פולשני באמצעות retractor מתוצרת עצמית. הליך זה יכול להתבצע ללא מכונת הנשמה או מיקרוסקופ ומציג עומס לחץ, המוביל בסופו של דבר היפרטרופיה לבבית או אי ספיקת לב.

Abstract

התכווצות אבי העורקים הרוחבית (TAC) הוא ניתוח נפוץ במחקר על אי ספיקת לב והיפרטרופיה לבבית המבוסס על היווצרות עומס יתר במודלים של עכברים. האתגר העיקרי של הליך זה הוא לדמיין בבירור את קשת אבי העורקים הרוחבית ואת להקה מדויקת את כלי המטרה. גישות קלאסיות מבצעות ניתוח חלקי של בית החזה כדי לחשוף את קשת אבי העורקים הרוחבית. עם זאת, זהו מודל חזה פתוח שגורם לטראומה כירורגית גדולה למדי ודורש מכונת הנשמה במהלך הניתוח. כדי למנוע טראומה מיותרת ולפשט את הליך הניתוח, קשת אבי העורקים מתקרבת דרך החלק הפרוקסימלי של עצם החזה, להגיע ולקשור את כלי המטרה באמצעות retractor קטן מתוצרת עצמית המכיל snare. הליך זה יכול להתבצע מבלי להיכנס לחלל הצדר ואינו זקוק למכונת הנשמה או ניתוח מיקרוכירורגי, מה שמשאיר את העכברים עם דפוסי נשימה פיזיולוגיים, מפשט את ההליך ומקצר משמעותית את זמן הניתוח. בשל הגישה הפחות פולשנית ופחות זמן ניתוח, עכברים יכולים לחוות פחות תגובות לחץ ולהתאושש במהירות.

Introduction

אי ספיקת לב היא סימפטום קליני מורכב הנובע מפגיעה במבנה ובתפקוד של מילוי או פליטת דם¹. שלב המחלה מוגדר בעיקר באמצעות סיווג תפקודי איגוד הלב של ניו יורק בהתבסס על חומרת הסימפטומים ופעילות גופנית². עבור חולים עם מקטע פליטה של מעל 50%, הפרעות מבניות ו / או תפקודיות העלו פפטידים נטריאורטיים כדי לתמוך באבחנה של אי ספיקת לב עם מקטע פליטה שמור (HFpEF)². מחלת לב איסכמית היא גורם מוביל בקרב אטיולוגיות מרובות של אי ספיקת לב. לפיכך, מודל אוטם שריר הלב (כגון קשירה כלילית קבועה) משמש לעתים קרובות לחקר פתופיזיולוגיה לאחר היפופרפוזיה לבבית או פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה ^3,4. מלבד פגיעה חריפה בשריר הלב, גורמי סיכון אחרים כגון יתר לחץ דם, סוכרת, השמנת יתר והיסטוריה משפחתית של קרדיומיופתיה תורמים גם הם להתפתחות אי ספיקת לב. לאחר שהחולים עוברים את שלב A (בסיכון לאי ספיקת לב) ונכנסים לשלב B (טרום אי ספיקת לב), מתרחש שינוי מבני¹. לדוגמה, חולים עם יתר לחץ דם עוברים תחילה היפרטרופיה אדפטיבית של החדר השמאלי, ולאחר מכן מתפתחים בהדרגה להיפרטרופיה לבבית לא אדפטיבית ועוברים לאי ספיקת לב באמצעות שיפוץ פתולוגי⁵.

כשלב הסופני של מחלות לב וכלי דם שונות, אי ספיקת לב כרונית נחקרה במשך עשרות שנים⁶. מודלים עכבריים מרובים נמצאים בשימוש נרחב במחקר אי ספיקת לב, כולל עירוי תרופות (אנגיוטנסין II), הפרעות מטבוליות (סוכרת או תזונה עתירת קלוריות), והתכווצות אבי העורקים⁷. בין מודלים אלה, זילוח אנגיוטנסין II מלווה בתופעות לוואי שונות של איברים, כגון כליה⁷. גרימת הפרעות מטבוליות בדרך כלל דורשים תקופה ארוכה למדי של זמן. התכווצות אבי העורקים העולה נחשבת כבעלת רלוונטיות מוגבלת למחלה אנושית⁷.

TAC הוא מודל אמין המגדיל עומס לאחר מכן וגורם להיפרטרופיה לבבית, כמו גם אי ספיקת לב⁸. מודל TAC פתוח חזה תואר לראשונה על ידי Rockman et al. והיה בשימוש במעבדות רבות ברחבי העולם⁹. עם זאת, הליך TAC קלאסי זה גורם טראומה גדולה למדי לעכברים ומשנה את התנהגותם הרגילה, אשר עשויה לקחת זמן התאוששות ארוך להפריע לטיפול נוסף¹⁰. הליכי TAC אחרים עם חזה סגור אכן הפחיתו כמה צעדים פולשניים, אך דרשו מיומנויות מיקרוכירורגיות או הנשמה מכנית^10,11.

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה שלב אחר שלב עם גישה זעיר פולשנית לקשת אבי העורקים באמצעות retractor מתוצרת עצמית דרך חתך קו אמצע 3 מ"מ של הקצה העליון של עצם החזה. מודל זה אינו זקוק למיומנות מיקרוכירורגית, אוורור מכני או חיתוך דרך הצלעות, ובכך מספק דרך מהירה, מוגבלת טראומה כירורגית, לא מסובכת וזולה לביצוע ניתוח TAC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי מאושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים טונג'י, המכללה הרפואית טונג'י, אוניברסיטת חואז'ונג למדע וטכנולוגיה, ווהאן, סין. הליך זה מבוצע על עכברים בוגרים זכרים C57 / BL6 (>10 שבועות של גיל). כל כלי הניתוח עוקרו על ידי autoclaving לפני הניתוח.

1. הכנת כלי ניתוח

1. הכינו מזרק 5 מ"ל וצבטו את קצה המחט עם מחזיק מחט כדי להקהות אותו.
2. הכינו מחט 27 גרם והקהו אותה עם מחזיק מחט. חיתוך קצה המחט עם מספריים אופתלמיים היא דרך חלופית להקהות את המחט.
3. כופפו את קצה המחט 27 G ב-90°.
   הערה: מחט זו תשמש כספייסר לקשירה עם אבי העורקים לצורך כיווץ כלי דם.
4. השתמשו בחוט ברזל מסחרי (דרגה רפואית, קוטר 0.5 מ"מ, ראו טבלת חומרים) וקשרו חוט סביב המחט (איור 1A). יוצרים חוטם קטן או לולאה בקצה הקהה של המחט (איור 1B).
   הערה: מכשיר רב פעמי זה פועל כמשחזר מיוחד מתוצרת עצמית ומאפשר להעביר תפר משי מתחת לאבי העורקים בשלבים האחרונים.
5. Autoclave כל הכלים הכירורגיים לפני הניתוח (כולל retractor מיוחד עשה לעיל) כדי לעקר אותם.

2. הכנת בעלי חיים

1. להרדים את העכבר באמצעות הזרקה תוך צפקית של תמיסת נתרן pentobarbital (50 מ"ג / ק"ג, ראה טבלה של חומרים) בהתאם למשקל הגוף. תת עורית להזריק 100 μL של 0.5% לידוקאין באופן מקומי לאזור הניתוח.
2. ודא שהעכבר מורדם לחלוטין על ידי צביטת בוהן העכבר עם קצה המלקחיים.
3. יש למרוח משחה אופתלמית על שתי העיניים כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
4. הסר את השיער מהגרון והחזה העליון עם קרם depilatory או קוצץ.
5. יש לחטא את האזור ללא שיער בשלושה קרצוף יוד ואתנול 70% לסירוגין במעגלים קונצנטריים הנעים כלפי חוץ.
6. הניחו את העכבר במצב שכיבה על כרית חימום מכוסה בוילון סטרילי כשראשו מצביע על המפעיל. תקנו את הגפיים בעזרת סרט הדבקה וחותכות בתפר 4-0 (איור 2A).
7. הכנס בדיקה רקטלית (ראה טבלת חומרים) כדי לפקח על טמפרטורת הגוף במהלך הניתוח. שמור על טמפרטורת הגוף ב 37 °C במהלך כל הפעולה.
8. לבשו זוג כפפות סטריליות.
   הערה: לאחר לבישת הכפפות הסטריליות, אין לגעת באזורים או חפצים לא מעוקרים אחרים.
9. חותכים חור (בקוטר 1-1.5 ס"מ) בוילון סטרילי חד פעמי חדש עם מספריים אופתלמיים מעוקרים. הניחו את הווילון הסטרילי מעל העכבר וודאו ששדה ההפעלה ללא שיער נראה דרך החור.
   הערה: שלב זה מאפשר למפעיל להימנע מלגעת באזורים לא מעוקרים אחרים, מה שעוזר לשמור על תנאים סטריליים במהלך הניתוח.

3. התכווצות של אבי העורקים הרוחבי

1. בצעו חתך עור אנכי בקוטר 1.5 ס"מ ברמת החריץ העל-סטרנלי (איור 2B) עם להב אזמל. יש להרחיב את חתך העור עד לגובה זווית עצם החזה.
   הערה: החריץ העל-סטרנלי הוא חריץ הממוקם בקצה העליון של החריץ המנובריום. זהו סמל משטח שניתן לזהות כשמסירים שיער עכבר (איור 2B). זווית עצם החזה היא המפרק בין manubrium sterni ו corpora sterni. כאשר עצם החזה נחשפת, היא מופיעה כקו לבן אופקי על עצם החזה באותה רמה של קוסטה סקונדה (איור 2C).
2. מפרידים בזהירות את העור ואת הפאשיה השטחית וחושפים את קנה הנשימה ואת עצם החזה הפרוקסימלית. בצעו בזהירות חתך קו אמצע אורכי בקוטר 3-4 מ"מ עד עצם החזה החל מהקצה העליון ועד לזווית עצם החזה (איור 2D).
   הערה: אסור שהחתך יחרוג מזווית עצם החזה, שכן קיים סיכון לגרימת דלקת ריאות חריפה בעכבר.
3. הרימו בעדינות את עצם החזה בעזרת מלקחיים ואת בלוטת התימוס ואבי העורקים מתחתיה. בזהירות להשתמש מלקחיים ישר לנתח בבוטות את כלי המטרה ואת הרקמות סביבו.
4. החזק את המשענת הקודמת מתוצרת עצמית (שלב 1.4) שהכילה חוט חוט בקצה ידו הימנית של המשתמש.
5. העבירו בזהירות את החוטם של המחזיר מתוצרת עצמית מתחת לאבי העורקים בין עורק התרדמה המשותף השמאלי לבין המקור של העורק הנומיננטי הימני (איור 2E).
6. העבירו את המשענת מתוצרת עצמית ליד שמאל כדי לחסוך את יד ימין למכשירים אחרים.
7. עם פינצטה מיקרוסקופית ביד ימין, מעבירים תפר משי 7-0 דרך הלולאה של החוטם בסוף ומוציאים את המשליפה. זה יאפשר להשאיר את תפר המשי סביב העורק לקשירה נוספת (איור 2F).
   הערה: היו עדינים ואל תגררו את קשת אבי העורקים יותר מדי ממקומה המקורי.
8. הניחו מחט 27G במקביל לאבי העורקים וקשרו את התפר סביב המחט ואבי העורקים (איור 2G,H).
   הערה: הליך הדמה צריך להיות זהה, אלא שאין קשירת אבי העורקים.
9. אחזו במחט 27 G עם מלקחיים אופתלמיים ומלקחיים נוספים המחזיקים את הקשר קשור למחט 27 G ולאבי העורקים. שלפו במהירות אך בעדינות את מחט 27 גרם מהקשירה (איור 2H).
   הערה: אסור שהקשר יהיה הדוק מדי, אחרת לא יהיה קל לשלוף את המחט. היזהר בעת משיכת המחט במקרה של קרע אבי העורקים.
10. תפרו את העור בתפר מונופילמנט סינתטי 4-0 בתבנית תפר קטוע (איור 2I).

4. טיפול לאחר הניתוח

1. הניחו את העכבר על משטח חם (ראו טבלת חומרים) והמתינו להחייאתו. בדרך כלל, העכבר מתעורר לחיים תוך כ -60 דקות.
   הערה: אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חוזר להכרה מספקת לשכיבה העיקרית של עצם החזה.
2. תת עורית להזריק 0.5 מ"ל של מלח חם לפקח על הומאוסטזיס נוזל של בעלי חיים.
   הערה: שלב זה מונע התייבשות של בעלי חיים ומצב של זרימת דם היפו-וולמית.
3. החל משחה אריתרומיצין על פני השטח הפצע כל יום במשך 3 ימים.
4. לטיפול בכאב לאחר הניתוח, יש לתת 1 מ"ג/ליטר של בופרנורפין בהרדמה מקומית באופן פרנטרלי לאתר החתך (ראה טבלת חומרים).
5. לאחר הניתוח, לפקח על העכבר עבור סימנים של זיהום וליקוי (תת תזונה, יציבה כפופה, פרווה פרועה).
   הערה: בעלי חיים שעברו ניתוח אינם מוחזרים לחברתם של בעלי חיים אחרים עד להחלמה מלאה.

5. הדמיית אולטרסאונד

1. יש לאשר קשירה מוצלחת של אבי העורקים הרוחבי על ידי חישוב מהירות זרימת הדם באמצעות מערכת הדמיה אולטרסאונד^12,13 (24 MHz, ראה טבלת חומרים) 28 ימים לאחר הניתוח.
   1. יש להרדים את בעל החיים עם 4.5% איזופלורן ב-20% אוויר מועשר בחמצן ולשמור עם 0.5% איזופלורן ב-20% אוויר מועשר בחמצן.
   2. הניחו את העכבר במצב שכיבה וקיבעו את הגפיים שלו לאלקטרודה בעזרת סרט הדבקה.
   3. באמצעות קרם depilatory, להסיר את שיער החזה ולהחיל סוכן צימוד קולי על החזה.
   4. הטה את הפלטפורמה שמאלה ככל האפשר. תוך שמירה על הגשושית במצב אנכי, הורידו אותה בהדרגה לאורך קו החזה הימני על החזה כאשר החריץ מצביע על סנטר החיה.
   5. במצב B של המכשיר, כוונן את ציר X ו- Y עד שקשת אבי העורקים ואתר ההתכווצות נראים בבירור.
   6. לחץ על כפתור דופלר גל הדופק כדי לעבור למצב גל דופק .
   7. התאם את תיבת נפח הדגימה של הסמן המקווקו דיסטלית לאתר המכווץ ומצא את הסילון הסטנוטי במהירות הגבוהה ביותר.
   8. לחץ שוב על כפתור דופלר גל הדופק כדי לקבל את צורת הגל של זרימת אבי העורקים ולמדוד את מהירות השיא. חשבו את מהירות זרימת הדם בהתאם לשיא דפוסי הגלים (איור 3A,B).
   9. הגדר את מכונת הצילום למצב B. הנח את הפלטפורמה במצב אופקי. סובב את הגשושית 30° לקו הפרסטרנלי השמאלי.
   10. התאימו את ציר X וציר Y לקבלת תצוגת ציר קצר. לחץ על מצב M כדי להציג את קו החיווי ולחץ על Cine Store כדי לשמור את התמונה למדידה מאוחרת יותר של עובי דופן הלב, ממד התא ומקטע ההוצאה.
       הערה: הנוסחה לחישוב מקטע פליטה: 100% * ((LV Vol;d - LV Vol;s) / LV Vol;d). הנוסחה לחישוב תפוקת הלב: נפח שבץ * דופק (בפריים הראשון שצויר) / 1000. רוב המדדים כגון מקטע פליטה ותפוקת הלב ניתנים למדידה אוטומטית באמצעות תוכנת מערכת ההדמיה העל-קולית. LV Vol;d: נפח דיאסטולי של החדר השמאלי. LV Vol;s: נפח סיסטולי של החדר השמאלי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לאחר ניתוח TAC מוצלח, זוהה עומס לחץ באמצעות מערכת הדמיה אולטרסאונד. ארבעה שבועות לאחר הניתוח, עכברים מפתחים ירידה בתפקוד הלב. במחקר הנוכחי, היעילות של ניתוח TAC אומתה באמצעות מקטע פליטה (EF), קיצור שבר (FS), מסת חדר שמאל (מסת LV) וקוטר פנימי של החדר השמאלי (LVID) של עכברים שעברו ניתוח TAC לאחר 4 שבועו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

השראת עומס לחץ מתמשך עלולה לגרום בהדרגה להיפרטרופיה לבבית ואי ספיקת לב. מודל זה שימש במעבדות רבות ברחבי העולם^14,15,16. הפרוטוקול סיפק שיטת TAC משופרת שאינה דורשת מיומנויות מיקרוכירורגיות או אוורור מכני.

השלב החשוב ביותר בפרוטו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM403	Used for suturing the skin
5 mL syringe	Haifuda Technology Co., Ltd.	BD-309628	Used for making snare containing retractor
7-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM701	Used for aorta ligation
Animal temperature monitor	Kaerwen	FT3400	Used for monitoring body temperature
Buprenorphine	Sigma	B-044	Used for post-surgical pain treatment
Depilatory cream	Veet	N/A	Used for remove body hair from the surgical area
Heating Pad	Xiaochuangxin	N/A	Used for maintaining body temperature
Ibuprofen	MCE	HY-78131	Used for post-surgical pain treatment
Iron wire (0.5 mm)	Qing Yuan	Iron wire #26	Used for making snare containing retractor
Microscopic tweezers	RWD	F12006-10	Used for penetrating and separating the tissue to open operation space
Needle holder	RWD	F12005-10	Used for pinching off the tip of gauge needle and blunting it
Ophthalmic forceps	RWD	F14012-10	Used for holding skin and other tissues
Ophthalmic scissors	RWD	S11001-08	Used for making sking incision of mouse
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	Used for mouse anesthesia
Sterile operating mat	Hale & hearty	211002	Used for placing animal during surgery
Ultra-sound imaging system	Fujifilm visualsonics	vevo1100	Used for measure the blood flow velocity, left ventricular wall thickness and ejection fraction, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100