Una técnica modificada para la constricción aórtica transversa en ratones

Resumen

El presente protocolo describe una técnica modificada y simplificada con un procedimiento de constricción aórtica transversa (TAC) mínimamente invasivo utilizando un retractor de fabricación propia. Este procedimiento se puede realizar sin un ventilador o microscopio e introduce sobrecarga de presión, lo que eventualmente conduce a hipertrofia cardíaca o insuficiencia cardíaca.

Resumen

La constricción aórtica transversa (TAC) es una cirugía de uso frecuente en la investigación sobre insuficiencia cardíaca e hipertrofia cardíaca basada en la formación de sobrecarga de presión en modelos de ratón. El principal desafío de este procedimiento es visualizar claramente el arco aórtico transversal y colocar con precisión la banda del vaso objetivo. Los abordajes clásicos realizan una toracotomía parcial para exponer el arco aórtico transverso. Sin embargo, es un modelo de tórax abierto que causa un trauma quirúrgico bastante grande y requiere un ventilador durante la cirugía. Para evitar traumatismos innecesarios y simplificar el procedimiento operativo, el arco aórtico se aborda a través de la proporción proximal del esternón, alcanzando y uniendo el vaso objetivo utilizando un pequeño retractor de fabricación propia que contiene una trampa . Este procedimiento se puede realizar sin entrar en la cavidad de la pleura y no necesita un ventilador o una operación microquirúrgica, lo que deja a los ratones con patrones de respiración fisiológicos, simplifica el procedimiento y reduce significativamente el tiempo de operación. Debido al enfoque menos invasivo y menos tiempo de operación, los ratones pueden sufrir menos reacciones de estrés y recuperarse rápidamente.

Introducción

La insuficiencia cardíaca es un síntoma clínico complejo que resulta de la alteración de la estructura y función del llenado ventricular o la expulsión de sangre¹. El estadio de la enfermedad se define principalmente a través de la clasificación de funciones de la New York Heart Association basada en la gravedad de los síntomas y la actividad física². Para aquellos pacientes con una fracción de eyección superior al 50%, las anomalías estructurales y/o funcionales elevaron péptidos natriuréticos para apoyar el diagnóstico de insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF)². La cardiopatía isquémica es una de las principales causas entre múltiples etiologías de insuficiencia cardíaca. Así, el modelo de infarto de miocardio (como la ligadura coronaria permanente) se utiliza a menudo para estudiar la fisiopatología después de la hipoperfusión cardíaca o la lesión por isquemia-reperfusión ^3,4. Además de la lesión miocárdica aguda, otros factores de riesgo como la hipertensión, la diabetes, la obesidad y los antecedentes familiares de miocardiopatía también contribuyen al desarrollo de insuficiencia cardíaca. Después de que los pacientes pasan la etapa A (en riesgo de insuficiencia cardíaca) y entran en la etapa B (insuficiencia cardíaca previa), se produce una modificación estructural¹. Por ejemplo, los pacientes hipertensos primero pasan por hipertrofia adaptativa del ventrículo izquierdo, y luego gradualmente se convierten en hipertrofia cardíaca desadaptativa y tránsito a insuficiencia cardíaca a través de la remodelación patológica⁵.

Como etapa terminal de diversas enfermedades cardiovasculares, la insuficiencia cardíaca crónica ha sido estudiada durante décadas⁶. Múltiples modelos de ratón han sido ampliamente utilizados en la investigación de la insuficiencia cardíaca, incluyendo la infusión de fármacos (angiotensina II), trastornos metabólicos (diabetes o dieta alta en calorías) y constricción aórtica⁷. Entre estos modelos, la perfusión de angiotensina II se acompaña de diversos efectos secundarios en los órganos, como el riñón⁷. La inducción de trastornos metabólicos generalmente requiere un período de tiempo bastante largo. Se ha considerado que la constricción aórtica ascendente tiene una relevancia limitada para la enfermedad humana⁷.

El TAC es un modelo confiable que aumenta la poscarga e induce hipertrofia cardíaca e insuficiencia cardíaca⁸. El modelo TAC de pecho abierto fue descrito por primera vez por Rockman et al. y fue utilizado en numerosos laboratorios de todo el mundo⁹. Sin embargo, este procedimiento clásico de TAC causa un trauma bastante grande a los ratones y cambia su comportamiento normal, lo que puede tomar un largo tiempo de recuperación y perturbar el tratamiento adicional¹⁰. Otros procedimientos modificados de TAC de tórax cerrado redujeron algunos pasos invasivos, pero requirieron habilidades microquirúrgicas o ventilación mecánica^10,11.

El presente protocolo detalla un método paso a paso con un enfoque mínimamente invasivo para el arco aórtico utilizando un retractor de fabricación propia a través de una incisión de 3 mm en la línea media del borde superior del esternón. Este modelo no necesita habilidad microquirúrgica, ventilación mecánica o corte a través de las costillas, lo que proporciona una forma rápida, quirúrgica limitada por trauma, sin complicaciones y económica de realizar la cirugía TAC.

Protocolo

El protocolo actual está aprobado por el comité de ética del Hospital Tongji, Tongji Medical College, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, Wuhan, China. Este procedimiento se realiza en ratones adultos machos C57/BL6 (>10 semanas de edad). Todos los instrumentos quirúrgicos fueron esterilizados en autoclave antes de la operación.

1. Preparación del instrumento quirúrgico

1. Prepare una jeringa de 5 ml y pellizque la punta de la aguja con un soporte para embotarla.
2. Prepare una aguja de 27 G y embote con un soporte para agujas. Cortar la punta de la aguja con tijeras oftálmicas es una forma alternativa de embotar la aguja.
3. Doblar la punta de la aguja de 27 G 90°.
   NOTA: Esta aguja se usará como espaciador para atar con la aorta para la constricción de los vasos.
4. Use un alambre de hierro obtenido comercialmente (grado médico, 0.5 mm de diámetro, consulte la Tabla de materiales) y haga un cordel alrededor de la aguja (Figura 1A). Formar una pequeña trampa o bucle en la punta embotada de la aguja (Figura 1B).
   NOTA: Este instrumento reutilizable actúa como un retractor especial de fabricación propia y permite pasar la sutura de seda debajo de la aorta en los últimos pasos.
5. Autoclave todas las herramientas quirúrgicas antes de la cirugía (incluido el retractor especial hecho anteriormente) para esterilizarlas.

2. Preparación animal

1. Anestesiar al ratón mediante inyección intraperitoneal de solución de pentobarbital sódico (50 mg/kg, ver Tabla de materiales) según el peso corporal. Inyecte por vía subcutánea 100 μL de lidocaína al 0,5% localmente en el área quirúrgica.
2. Confirme que el ratón está completamente anestesiado pellizcando el dedo del ratón con la punta de los fórceps.
3. Aplique ungüento oftálmico en ambos ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
4. Retire el vello de la garganta y la parte superior del pecho con crema depilatoria o un cortatiempos.
5. Desinfecte el área sin pelo con tres exfoliantes alternos de yodo y etanol al 70% en círculos concéntricos que se muevan hacia afuera.
6. Coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla térmica cubierta con una cortina estéril con la cabeza apuntando hacia el operador. Fijar las extremidades con cinta adhesiva e incisivos con una sutura 4-0 (Figura 2A).
7. Inserte una sonda rectal (consulte la Tabla de materiales) para controlar la temperatura corporal durante la operación. Mantener la temperatura corporal a 37 °C durante toda la operación.
8. Póngase un par de guantes estériles.
   NOTA: Una vez que se coloquen los guantes estériles, no toque otras áreas u objetos no esterilizados.
9. Corte un agujero (1-1.5 cm de diámetro) en una nueva cortina estéril desechable con tijeras oftálmicas esterilizadas. Coloque la cortina estéril sobre el ratón y asegúrese de que el campo de operación sin pelo sea visible a través del orificio.
   NOTA: Este paso permite al operador evitar tocar otras áreas no esterilizadas, lo que ayuda a mantener las condiciones estériles durante la cirugía.

3. Constricción de la aorta transversa

1. Haga una incisión vertical de 1,5 cm en la piel a nivel de la muesca supraesternal (Figura 2B) con hoja de bisturí. Expanda la incisión de la piel hasta el nivel del ángulo esternal.
   NOTA: La muesca supraesternal es una muesca ubicada en el borde superior del manubrio esterni. Es un símbolo de superficie que se puede detectar cuando se elimina el pelo del ratón (Figura 2B). El ángulo esternal es la articulación entre manubrio esterni y cuerpos esterinos. Cuando el esternón está expuesto, se presenta como una línea blanca horizontal en el esternón al mismo nivel de costa secunda (Figura 2C).
2. Separe cuidadosamente la piel y la fascia superficial y exponga la tráquea y el esternón proximal. Haga con cuidado una incisión longitudinal de 3-4 mm en la línea media del esternón comenzando desde el borde superior hasta el ángulo esternal (Figura 2D).
   NOTA: El corte no debe exceder el ángulo esternal, ya que existe el riesgo de causar neumotórax agudo en el ratón.
3. Levante suavemente el esternón con fórceps y el timo y el arco aortae debajo de él. Use cuidadosamente fórceps rectos y disecte sin rodeos el vaso objetivo y los tejidos a su alrededor.
4. Sostenga el retractor previamente hecho por él mismo (paso 1.4) que contenía una trampa de alambre en el extremo de la mano derecha del usuario.
5. Pase cuidadosamente la trampa del retractor de fabricación propia debajo de la aorta entre la arteria carótida común izquierda y el origen de la arteria innominada derecha (Figura 2E).
6. Pase el retractor hecho por él mismo a la mano izquierda para ahorrar la mano derecha para otros instrumentos.
7. Con pinzas microscópicas en la mano derecha, pase una sutura de seda 7-0 a través del lazo de la trampa en el extremo y saque el retractor. Esto permitirá dejar la sutura de seda alrededor de la arteria para una mayor ligadura (Figura 2F).
   NOTA: Sea suave y no arrastre demasiado el arco aórtico de su posición original.
8. Coloque una aguja de 27 G paralela a la aorta y ate la sutura alrededor de la aguja y la aorta (Figura 2G, H).
   NOTA: El procedimiento simulado debe ser el mismo, excepto que no hay ligadura de aorta.
9. Sujete la aguja 27 G con fórceps oftálmicos y otra pinza que sujete el nudo atado a la aguja 27 G y la aorta. Rápida pero suavemente extraiga la aguja de 27 G de la ligadura (Figura 2H).
   NOTA: El nudo no debe estar demasiado apretado, o no será fácil sacar la aguja. Tenga cuidado al sacar la aguja en caso de ruptura de la aorta.
10. Suturar la piel con sutura de monofilamento sintético 4-0 en un patrón de sutura interrumpida (Figura 2I).

4. Cuidados postoperatorios

1. Coloque el mouse en una almohadilla caliente (consulte Tabla de materiales) y espere a que reviva. Generalmente, el ratón revive en unos 60 minutos.
   NOTA: El animal no debe dejarse desatendido hasta que recupere suficiente conciencia de la decúbito esternal principal.
2. Inyecte por vía subcutánea 0,5 ml de solución salina tibia y controle la homeostasis fluida de los animales.
   NOTA: Este paso evita que los animales se deshidraten y el estado de circulación hipovolémica.
3. Aplique ungüento de eritromicina en la superficie de la herida todos los días durante 3 días.
4. Para el tratamiento postquirúrgico del dolor, administrar 1 mg/L de buprenorfina anestésico local por vía parenteral en el sitio de la incisión (ver Tabla de materiales).
5. Después de la operación, controle al ratón para detectar signos de infección y deterioro (desnutrición, postura encorvada y pelaje erizado).
   NOTA: Los animales que se sometieron a cirugía no son devueltos a la compañía de otros animales hasta que estén completamente recuperados.

5. Imágenes de ultrasonido

1. Confirmar el éxito de la ligadura de la aorta transversa mediante el cálculo de la velocidad del flujo sanguíneo a través de un sistema de imágenes de ultrasonido^12,13 (24 MHz^, ver Tabla de materiales) 28 días después de la cirugía.
   1. Anestesiar al animal con isoflurano al 4,5% en aire enriquecido con oxígeno al 20% y mantener con isoflurano al 0,5% en aire enriquecido con oxígeno al 20%.
   2. Coloque el ratón en posición supina y fije sus extremidades al electrodo con cinta adhesiva.
   3. Usando crema depilatoria, retire el vello del pecho y aplique un agente de acoplamiento ultrasónico en el pecho.
   4. Incline la plataforma hacia la izquierda lo más lejos posible. Mientras mantiene la sonda en posición vertical, bájela gradualmente a lo largo de la línea paraesternal derecha en el pecho con la muesca apuntando a la barbilla del animal.
   5. En el modo B del instrumento, ajuste los ejes X e Y hasta que el arco aórtico y el sitio de constricción sean claramente visibles.
   6. Haga clic en el botón Doppler de onda de pulso para cambiar al modo de onda de pulso.
   7. Ajuste el cuadro de volumen de muestra del cursor discontinuo distal al sitio constreñido y encuentre el chorro estenótico con la velocidad más alta.
   8. Haga clic en el botón Doppler de onda de pulso nuevamente para obtener la forma de onda del flujo aórtico y medir la velocidad máxima. Calcule la velocidad del flujo sanguíneo de acuerdo con el pico de los patrones de onda (Figura 3A, B).
   9. Establezca el generador de imágenes en modo B. Apoye la plataforma en posición horizontal. Gire la sonda 30° hacia la línea paraesternal izquierda.
   10. Ajuste los ejes X e Y para obtener una vista corta del eje. Pulse el modo M para mostrar la línea indicadora y haga clic en Cine Store para guardar la imagen para su posterior medición del grosor de la pared cardíaca, la dimensión de la cámara y la fracción de eyección.
       NOTA: La fórmula para calcular la fracción de eyección: 100% * ((LV Vol;d - LV Vol;s) / LV Vol;d). La fórmula para calcular el gasto cardíaco: Volumen sistólico * Frecuencia cardíaca (en el primer cuadro dibujado) / 1000. La mayoría de los índices, como la fracción de eyección y el gasto cardíaco, se pueden medir automáticamente a través del software del sistema de imágenes ultrasónicas. VI Vol;d: volumen diastólico del ventrículo izquierdo. VI Vol;s: volumen sistólico del ventrículo izquierdo.

Resultados

Después de una cirugía TAC exitosa, se detectó una sobrecarga de presión utilizando un sistema de imágenes de ultrasonido. Cuatro semanas después de la cirugía, los ratones desarrollan una disminución de la función cardíaca. En el presente estudio, la eficacia de la cirugía TAC se validó a través de la fracción de eyección (FE), el acortamiento fraccional (FS), la masa ventricular izquierda (masa del VI) y el diámetro interno del ventrículo izquierdo (LVID) de ratones que se sometieron a cirugí...

Discusión

La inducción de una sobrecarga de presión sostenida puede causar gradualmente hipertrofia cardíaca e insuficiencia cardíaca. Este modelo ha sido utilizado en numerosos laboratorios de todo el mundo^14,15,16. El protocolo proporcionó un método TAC mejorado que no necesita habilidades microquirúrgicas ni ventilación mecánica.

El paso más importante en este protocolo es pasar la sutura de seda d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM403	Used for suturing the skin
5 mL syringe	Haifuda Technology Co., Ltd.	BD-309628	Used for making snare containing retractor
7-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM701	Used for aorta ligation
Animal temperature monitor	Kaerwen	FT3400	Used for monitoring body temperature
Buprenorphine	Sigma	B-044	Used for post-surgical pain treatment
Depilatory cream	Veet	N/A	Used for remove body hair from the surgical area
Heating Pad	Xiaochuangxin	N/A	Used for maintaining body temperature
Ibuprofen	MCE	HY-78131	Used for post-surgical pain treatment
Iron wire (0.5 mm)	Qing Yuan	Iron wire #26	Used for making snare containing retractor
Microscopic tweezers	RWD	F12006-10	Used for penetrating and separating the tissue to open operation space
Needle holder	RWD	F12005-10	Used for pinching off the tip of gauge needle and blunting it
Ophthalmic forceps	RWD	F14012-10	Used for holding skin and other tissues
Ophthalmic scissors	RWD	S11001-08	Used for making sking incision of mouse
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	Used for mouse anesthesia
Sterile operating mat	Hale & hearty	211002	Used for placing animal during surgery
Ultra-sound imaging system	Fujifilm visualsonics	vevo1100	Used for measure the blood flow velocity, left ventricular wall thickness and ejection fraction, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100