Модифицированная методика поперечного сужения аорты у мышей

Резюме

В настоящем протоколе описана модифицированная и упрощенная методика с минимально инвазивной процедурой поперечного сужения аорты (TAC) с использованием самодельного ретрактора. Эта процедура может проводиться без аппарата искусственной вентиляции легких или микроскопа и приводит к перегрузке давлением, что в конечном итоге приводит к гипертрофии сердца или сердечной недостаточности.

Аннотация

Поперечное сужение аорты (TAC) является часто используемой операцией в исследованиях сердечной недостаточности и гипертрофии сердца, основанной на формировании перегрузки давлением на мышиных моделях. Основная задача этой процедуры состоит в том, чтобы четко визуализировать поперечную дугу аорты и точно перевязать целевой сосуд. Классические подходы выполняют частичную торакотомию, чтобы обнажить поперечную дугу аорты. Тем не менее, это модель с открытой грудной клеткой, которая вызывает довольно большую хирургическую травму и требует аппарата искусственной вентиляции легких во время операции. Чтобы предотвратить ненужную травму и упростить операционную процедуру, к дуге аорты подходят через проксимальную часть грудины, достигая и связывая целевой сосуд с помощью небольшого самодельного ретрактора, содержащего ловушку. Эта процедура может проводиться без входа в полость плевры и не требует аппарата искусственной вентиляции легких или микрохирургической операции, что оставляет мышей с физиологическими паттернами дыхания, упрощает процедуру и значительно сокращает время операции. Благодаря менее инвазивному подходу и меньшему времени операции мыши могут подвергаться меньшему количеству стрессовых реакций и быстро восстанавливаться.

Введение

Сердечная недостаточность является сложным клиническим симптомом, возникающим в результате нарушения структуры и функции наполнения желудочков или выброса крови¹. Стадия заболевания в основном определяется с помощью классификации функций Нью-Йоркской кардиологической ассоциации, основанной на тяжести симптомов и физической активности². У пациентов с фракцией выброса более 50% структурные и/или функциональные нарушения повышали уровень натрийуретических пептидов для подтверждения диагноза сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса (HFpEF)². Ишемическая болезнь сердца является основной причиной множественной этиологии сердечной недостаточности. Таким образом, модель инфаркта миокарда (например, постоянная перевязка коронарных артерий) часто используется для изучения патофизиологии после гипоперфузии сердца или ишемии-реперфузионного повреждения ^3,4. Помимо острого повреждения миокарда, другие факторы риска, такие как гипертония, диабет, ожирение и семейный анамнез кардиомиопатии, также способствуют развитию сердечной недостаточности. После того, как пациенты проходят стадию А (с риском сердечной недостаточности) и переходят в стадию В (предсердечная недостаточность), происходит структурная модификация¹. Например, у пациентов с артериальной гипертензией сначала проходит адаптивная гипертрофия левого желудочка, а затем постепенно развивается дезадаптивная гипертрофия сердца и переход к сердечной недостаточности через патологическое ремоделирование⁵.

Как терминальная стадия различных сердечно-сосудистых заболеваний, хроническая сердечная недостаточность изучается на протяжении десятилетий⁶. Несколько моделей мышей широко использовались в исследованиях сердечной недостаточности, включая инфузию лекарств (ангиотензин II), метаболические нарушения (диабет или высококалорийная диета) и сужение аорты⁷. Среди этих моделей перфузия ангиотензина II сопровождается различными побочными эффектами со стороны органов, таких как почка⁷. Индуцирование метаболических нарушений обычно требует довольно длительного периода времени. Считается, что сужение восходящей аорты имеет ограниченное отношение к заболеваниям человека⁷.

TAC является надежной моделью, которая увеличивает постнагрузку и вызывает гипертрофию сердца, а также сердечную недостаточность⁸. Модель TAC с открытой грудной клеткой была впервые описана Rockman et al. и использовалась во многих лабораториях по всему миру⁹. Однако эта классическая процедура TAC наносит довольно большую травму мышам и изменяет их нормальное поведение, что может занять длительное время восстановления и нарушить дальнейшее лечение¹⁰. Другие модифицированные процедуры TAC с закрытой грудной клеткой уменьшили некоторые инвазивные шаги, но потребовали микрохирургических навыков или искусственной вентиляции легких^10,11.

В настоящем протоколе подробно описан пошаговый метод с минимально инвазивным доступом к дуге аорты с использованием самодельного ретрактора через срединный разрез верхнего края грудины диаметром 3 мм. Эта модель не требует микрохирургических навыков, искусственной вентиляции легких или разрезания ребер, что обеспечивает быстрый, ограниченный хирургической травмой, несложный и недорогой способ выполнения операции TAC.

протокол

Текущий протокол одобрен комитетом по этике больницы Тунцзи, Медицинского колледжа Тунцзи, Хуачжунского университета науки и технологий, Ухань, Китай. Эта процедура проводится на взрослых самцах мышей C57/BL6 (> возрасте 10 недель). Перед операцией все хирургические инструменты были стерилизованы путем автоклавирования.

1. Подготовка хирургического инструмента

1. Подготовьте шприц объемом 5 мл и отщипните кончик иглы иглодержателем, чтобы затупить его.
2. Подготовьте иглу 27 г и затупите ее иглодержателем. Отрезание кончика иглы офтальмологическими ножницами является альтернативным способом затупления иглы.
3. Согните кончик иглы 27 G на 90°.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта игла будет использоваться в качестве прокладки для привязки к аорте для сужения сосудов.
4. Используйте коммерчески приобретенную железную проволоку (медицинскую, диаметром 0,5 мм, см. Таблицу материалов) и обвивайте иглу (рис. 1А). Сформируйте небольшую петлю или петлю на затупленном кончике иглы (рис. 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот многоразовый инструмент действует как специальный самодельный ретрактор и позволяет накладывать шелковый шов под аорту на последних этапах.
5. Перед операцией автоклавируйте все хирургические инструменты (включая специальный ретрактор, сделанный выше), чтобы стерилизовать их.

2. Подготовка животных

1. Обезболивают мышей внутрибрюшинной инъекцией раствора пентобарбитала натрия (50 мг/кг, см. Таблицу материалов) в зависимости от массы тела. Подкожно вводят 100 мкл 0,5% лидокаина локально в операционную область.
2. Убедитесь, что мышь полностью обезболивается, ущипнув палец мыши кончиком щипцов.
3. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
4. Удалите волосы с горла и верхней части груди с помощью крема для депиляции или машинки для стрижки.
5. Продезинфицируйте оголенный участок тремя чередующимися скрабами йода и 70% этанола концентрическими кругами, движущимися наружу.
6. Поместите мышь в положении лежа на спине на грелку, покрытую стерильной простыней, так, чтобы ее голова была направлена к оператору. Зафиксируйте конечности лейкопластырем и резцами швом 4-0 (рисунок 2А).
7. Вставьте ректальный зонд (см. Таблицу материалов) для контроля температуры тела во время операции. Поддерживайте температуру тела на уровне 37 °C в течение всей операции.
8. Наденьте пару стерильных перчаток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После надевания стерильных перчаток не прикасайтесь к другим нестерилизованным участкам или предметам.
9. Вырежьте отверстие (1-1,5 см в диаметре) в новой одноразовой стерильной драпировке стерилизованными офтальмологическими ножницами. Наденьте стерильную драпировку на мышь и убедитесь, что через отверстие видно непокрытое операционное поле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг позволяет оператору не прикасаться к другим нестерилизованным участкам, что помогает поддерживать стерильные условия во время операции.

3. Сужение поперечной аорты

1. Сделайте вертикальный разрез кожи 1,5 см на уровне надгрудинной выемки (рис. 2Б) лезвием скальпеля. Расширьте разрез кожи до уровня стернального угла.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Надгрудинная насечка - это выемка, расположенная на верхнем крае манубриума грудины. Это символ поверхности, который можно обнаружить при удалении волос мыши (рис. 2B). Стернальный угол - это стык между manubrium sterni и corpora sterni. Когда грудина обнажена, она представляет собой горизонтальную белую линию на грудине на том же уровне коста секунда (рис. 2C).
2. Осторожно отделите кожу и поверхностную фасцию и обнажив трахею и проксимальный отдел грудины. Аккуратно сделайте продольный срединный разрез на грудине 3-4 мм, начиная от верхнего края к стернальному углу (рис. 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез не должен превышать стернальный угол, так как существует риск возникновения острого пневмоторакса у мыши.
3. Аккуратно приподнимите щипцами грудину и тимус и дугу аорты под ней. Осторожно используйте прямые щипцы и тупо рассекайте целевой сосуд и ткани вокруг него.
4. Удерживайте ранее самодельный втягивающий шкаф (шаг 1.4), который содержал проволочную петлю на конце правой руки пользователя.
5. Осторожно проведите петлю самодельного ретрактора под аортой между левой общей сонной артерией и началом правой безымянной артерии (рис. 2Е).
6. Передайте самодельный ретрактор в левую руку, чтобы освободить правую руку для других инструментов.
7. С микроскопическим пинцетом в правой руке пропустите шелковый шов 7-0 через петлю малого барабана на конце и вытащите втягивающее устройство. Это позволит оставить шелковый шов вокруг артерии для дальнейшей перевязки (рис. 2F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны и не слишком сильно оттягивайте дугу аорты от исходного положения.
8. Поместите иглу 27 G параллельно аорте и завяжите шов вокруг иглы и аорты (рис. 2G, H).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиктивная процедура должна быть такой же, за исключением того, что перевязка аорты не проводится.
9. Держитесь за иглу 27 G с помощью глазных щипцов и других щипцов, удерживающих узел, привязанный к игле 27 G и аорте. Быстро, но аккуратно вытащите иглу 27 G из перевязки (рис. 2Н).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Узел не должен быть слишком тугим, иначе вытащить иглу будет непросто. Будьте осторожны при вытаскивании иглы в случае разрыва аорты.
10. Наложите шов на кожу синтетическим монофиламентным швом 4-0 по прерывистому шовному рисунку (рис. 2I).

4. Послеоперационный уход

1. Положите мышь на теплую подушечку (см. Таблицу материалов) и подождите, пока она оживет. Как правило, мышь оживает примерно через 60 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животное нельзя оставлять без присмотра до тех пор, пока оно не восстановит сознание, достаточное для основного лежачего положения грудины.
2. Подкожно вводят 0,5 мл теплого физиологического раствора и контролируют гомеостаз жидкости животных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг предотвращает обезвоживание животных и гиповолемическое кровообращение.
3. Наносите эритромициновую мазь на раневую поверхность каждый день в течение 3 дней.
4. Для послеоперационного лечения боли парентерально вводят 1 мг / л местного анестетика бупренорфина в место разреза (см. Таблицу материалов).
5. После операции следите за мышью на наличие признаков инфекции и нарушений (недоедание, сгорбленная осанка и взъерошенная шерсть).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, перенесшие операцию, не возвращаются в компанию других животных до полного выздоровления.

5. Ультразвуковая визуализация

1. Подтвердить успешную перевязку поперечной аорты можно путем расчета скорости кровотока с помощью ультразвуковой системы визуализации через^12,13 (24 МГц^, см. Таблицу материалов) через 28 дней после операции.
   1. Обезболивайте животное 4,5% изофлураном в 20% воздухе, обогащенном кислородом, и поддерживайте 0,5% изофлураном в 20% воздухе, обогащенном кислородом.
   2. Поместите мышь в положение лежа на спине и зафиксируйте ее конечности на электроде с помощью скотча.
   3. Используя крем для депиляции, удалите волосы на груди и нанесите ультразвуковой связующий агент на грудь.
   4. Наклоните платформу влево как можно дальше. Удерживая зонд в вертикальном положении, постепенно опускайте его вдоль правой парастернальной линии на груди так, чтобы выемка была направлена на подбородок животного.
   5. В режиме B инструмента отрегулируйте оси X и Y до тех пор, пока дуга аорты и место сужения не станут четко видны.
   6. Нажмите кнопку «Допплер пульсовой волны», чтобы переключиться в режим пульсовой волны .
   7. Отрегулируйте пунктирное поле объема образца курсора дистальнее суженного участка и найдите стенотическую струю с наибольшей скоростью.
   8. Нажмите кнопку « Допплер пульсовой волны » еще раз, чтобы получить форму волны аортального потока и измерить пиковую скорость. Рассчитайте скорость кровотока в соответствии с пиком волновых паттернов (рис. 3A, B).
   9. Переведите тепловизор в режим B. Поставьте платформу в горизонтальное положение. Поверните зонд на 30° влево от парастернальной линии.
   10. Отрегулируйте оси X и Y, чтобы получить вид короткой оси. Нажмите режим M, чтобы отобразить линию индикатора, и нажмите Cine Store, чтобы сохранить изображение для последующего измерения толщины стенки сердца, размера камеры и фракции выброса.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Формула для расчета фракции выброса: 100% * ((LV Vol;d - LV Vol;s) / LV Vol;d). Формула для расчета сердечного выброса: Ударный объем * Частота сердечных сокращений (на первом нарисованном кадре) / 1000. Большинство показателей, таких как фракция выброса и сердечный выброс, могут быть измерены автоматически с помощью программного обеспечения системы ультразвуковой визуализации. LV Vol;d: диастолический объем левого желудочка. LV Vol;s: систолический объем левого желудочка.

Результаты

После успешной операции TAC перегрузка давлением была обнаружена с помощью системы ультразвуковой визуализации. Через четыре недели после операции у мышей снижается функция сердца. В настоящем исследовании эффективность хирургии TAC была подтверждена с помощью фракции выброса (EF), ...

Обсуждение

Индукция устойчивой перегрузки давлением может постепенно вызвать сердечную гипертрофию и сердечную недостаточность. Эта модель использовалась во многих лабораториях по всему миру^14,15,16. Протокол обеспечил улучшенный метод TAC, которы...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM403	Used for suturing the skin
5 mL syringe	Haifuda Technology Co., Ltd.	BD-309628	Used for making snare containing retractor
7-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM701	Used for aorta ligation
Animal temperature monitor	Kaerwen	FT3400	Used for monitoring body temperature
Buprenorphine	Sigma	B-044	Used for post-surgical pain treatment
Depilatory cream	Veet	N/A	Used for remove body hair from the surgical area
Heating Pad	Xiaochuangxin	N/A	Used for maintaining body temperature
Ibuprofen	MCE	HY-78131	Used for post-surgical pain treatment
Iron wire (0.5 mm)	Qing Yuan	Iron wire #26	Used for making snare containing retractor
Microscopic tweezers	RWD	F12006-10	Used for penetrating and separating the tissue to open operation space
Needle holder	RWD	F12005-10	Used for pinching off the tip of gauge needle and blunting it
Ophthalmic forceps	RWD	F14012-10	Used for holding skin and other tissues
Ophthalmic scissors	RWD	S11001-08	Used for making sking incision of mouse
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	Used for mouse anesthesia
Sterile operating mat	Hale & hearty	211002	Used for placing animal during surgery
Ultra-sound imaging system	Fujifilm visualsonics	vevo1100	Used for measure the blood flow velocity, left ventricular wall thickness and ejection fraction, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100