Técnica Modificada para Constrição Aórtica Transversa em Camundongos

Resumo

O presente protocolo descreve uma técnica modificada e simplificada com procedimento minimamente invasivo de constrição transversa da aorta (TAC) utilizando um afastador de fabricação própria. Esse procedimento pode ser realizado sem ventilador ou microscópio e introduz sobrecarga pressórica, eventualmente levando à hipertrofia cardíaca ou insuficiência cardíaca.

Resumo

A constrição aórtica transversa (TAC) é uma cirurgia frequentemente utilizada em pesquisas sobre insuficiência cardíaca e hipertrofia cardíaca baseada na formação de sobrecarga pressórica em modelos murinos. O principal desafio desse procedimento é visualizar claramente o arco aórtico transverso e bandear com precisão o vaso-alvo. As abordagens clássicas realizam toracotomia parcial para exposição do arco aórtico transverso. No entanto, é um modelo de tórax aberto que causa um trauma cirúrgico bastante grande e requer um ventilador durante a cirurgia. Para evitar traumas desnecessários e simplificar o procedimento operatório, o arco aórtico é abordado pela proporção proximal do esterno, atingindo e ligando o vaso-alvo com um pequeno afastador de fabricação própria que contém uma alça. Este procedimento pode ser realizado sem entrar na cavidade pleura e não precisa de um ventilador ou operação microcirúrgica, o que deixa os ratos com padrões respiratórios fisiológicos, simplifica o procedimento e reduz significativamente o tempo de operação. Devido à abordagem menos invasiva e menor tempo de operação, os camundongos podem sofrer menos reações de estresse e se recuperar rapidamente.

Introdução

A insuficiência cardíaca é um sintoma clínico complexo que resulta do comprometimento da estrutura e função do enchimento ventricular ou ejeção de sangue¹. O estágio da doença é definido principalmente pela classificação de função da New York Heart Association baseada na gravidade dos sintomas e na atividade^física2. Para aqueles pacientes com fração de ejeção acima de 50%, anormalidades estruturais e/ou funcionais elevaram peptídeos natriuréticos para apoiar o diagnóstico de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (ICFEP)². A cardiopatia isquêmica é uma das principais causas entre as múltiplas etiologias da insuficiência cardíaca. Assim, o modelo de infarto do miocárdio (como a ligadura coronária permanente) é frequentemente utilizado para estudar a fisiopatologia após hipoperfusão cardíaca ou lesão de isquemia-reperfusão ^3,4. Além da lesão miocárdica aguda, outros fatores de risco como hipertensão, diabetes, obesidade e história familiar de cardiomiopatia também contribuem para o desenvolvimento de insuficiência cardíaca. Após o paciente passar do estágio A (risco de insuficiência cardíaca) e entrar no estágio B (pré-insuficiência cardíaca), ocorre a modificação estrutural¹. Por exemplo, pacientes hipertensos passam primeiro por hipertrofia adaptativa do ventrículo esquerdo e, em seguida, gradualmente evoluem para hipertrofia cardíaca desadaptativa e transitam para insuficiência cardíaca por meio do remodelamento patológico⁵.

Como estágio terminal de várias doenças cardiovasculares, a insuficiência cardíaca crônica vem sendo estudada há^décadas6. Múltiplos modelos murinos têm sido amplamente utilizados em pesquisas sobre insuficiência cardíaca, incluindo infusão de drogas (angiotensina II), distúrbios metabólicos (diabetes ou dieta hipercalórica) e constrição aórtica⁷. Dentre esses modelos, a perfusão da angiotensina II é acompanhada de vários efeitos colaterais em órgãos, como nos^rins7. Induzir distúrbios metabólicos geralmente requer um período bastante longo de tempo. A constrição da aorta ascendente tem sido considerada de relevância limitada para a doença humana⁷.

O TAC é um modelo confiável que aumenta a pós-carga e induz hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca⁸. O modelo de TAC de tórax aberto foi descrito pela primeira vez por Rockman e col. e foi utilizado em inúmeros laboratórios ao redor do mundo⁹. No entanto, esse procedimento clássico de TAC causa um trauma bastante grande em camundongos e altera seu comportamento normal, o que pode levar um longo tempo de recuperação e atrapalhar o tratamento^posterior10. Outros procedimentos modificados de TAC de tórax fechado reduziram alguns passos invasivos, mas exigiram habilidades microcirúrgicas ou ventilação mecânica^10,11.

O presente protocolo detalha um passo a passo com abordagem minimamente invasiva do arco aórtico utilizando afastador autoconfeccionado através de incisão mediana de 3 mm na borda superior do esterno. Esse modelo não necessita de habilidade microcirúrgica, ventilação mecânica ou corte das costelas, proporcionando uma maneira rápida, limitada ao trauma cirúrgico, descomplicada e barata de realizar a cirurgia de TAC.

Protocolo

O protocolo atual é aprovado pelo comitê de ética do Hospital Tongji, Faculdade de Medicina de Tongji, Universidade de Ciência e Tecnologia de Huazhong, Wuhan, China. Este procedimento é realizado em camundongos adultos machos C57/BL6 (>10 semanas de idade). Todos os instrumentais cirúrgicos foram esterilizados em autoclave no pré-operatório.

1. Preparo do instrumental cirúrgico

1. Prepare uma seringa de 5 mL e aperte a ponta da agulha com um suporte para agulha para embotá-la.
2. Prepare uma agulha de 27 G e embote-a com um suporte para agulhas. Cortar a ponta da agulha com tesoura oftálmica é uma maneira alternativa de embotar a agulha.
3. Dobre a ponta da agulha de 27 G 90°.
   OBS: Esta agulha será utilizada como espaçador para amarração com a aorta para constrição do vaso.
4. Use um fio de ferro obtido comercialmente (grau médico, 0,5 mm de diâmetro, ver Tabela de Materiais) e um fio ao redor da agulha (Figura 1A). Formar uma pequena alça ou laço na ponta romba da agulha (Figura 1B).
   NOTA: Este instrumento reutilizável atua como um afastador especial de fabricação própria e permite passar sutura de seda sob a aorta nos últimos passos.
5. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia (incluindo o afastador especial feito acima) para esterilizá-los.

2. Preparação dos animais

1. Anestesiar o rato através de injeção intraperitoneal de solução de pentobarbital sódico (50 mg/kg, ver Tabela de Materiais) de acordo com o peso corporal. Injetar localmente 100 μL de lidocaína a 0,5% por via subcutânea na área cirúrgica.
2. Confirme se o rato está totalmente anestesiado apertando o dedo do rato com a ponta da pinça.
3. Aplique pomada oftálmica em ambos os olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia.
4. Retire os pelos da garganta e parte superior do peito com creme depilatório ou um cortador.
5. Desinfetar a área sem pelos com três esfoliantes alternados de iodo e etanol 70% em círculos concêntricos movendo-se para fora.
6. Coloque o rato na posição supina sobre uma almofada de aquecimento coberta com um pano estéril com a cabeça apontada para o operador. Fixar as extremidades com fita adesiva e incisivos com sutura 4-0 (Figura 2A).
7. Insira uma sonda retal (consulte Tabela de Materiais) para monitorar a temperatura corporal durante a operação. Manter a temperatura corporal em 37 °C durante toda a operação.
8. Coloque um par de luvas estéreis.
   NOTA: Uma vez colocadas as luvas estéreis, não toque em outras áreas ou objetos não esterilizados.
9. Corte um orifício (1-1,5 cm de diâmetro) em um novo pano estéril descartável com tesoura oftálmica esterilizada. Coloque o pano estéril sobre o mouse e certifique-se de que o campo de operação sem pelos seja visível através do orifício.
   NOTA: Esta etapa permite que o operador evite tocar em outras áreas não esterilizadas, o que ajuda a manter as condições estéreis durante a cirurgia.

3. Constrição da aorta transversa

1. Realizar incisão vertical de 1,5 cm na pele ao nível da incisura esternal (Figura 2B) com lâmina de bisturi. Expandir a incisão da pele até o nível do ângulo esternal.
   NOTA: A incisura supraesternal é uma incisura localizada na borda superior do manúbrio esternal. É um símbolo de superfície que pode ser detectado quando os pelos de camundongos são removidos (Figura 2B). O ângulo esternal é a articulação entre o manúbrio esterno e os corpos esternos. Quando exposto o esterno, apresenta-se como uma linha branca horizontal sobre o esterno no mesmo nível da costa secunda (Figura 2C).
2. Separe cuidadosamente a pele e a fáscia superficial e exponha a traqueia e o esterno proximal. Realizar cuidadosamente uma incisão longitudinal longitudinal de 3-4 mm na linha média do esterno a partir da borda superior até o ângulo esternal (Figura 2D).
   NOTA: O corte não deve exceder o ângulo esternal, pois há risco de causar pneumotórax agudo no camundongo.
3. Levante suavemente o esterno com pinça e o timo e arco aórtico abaixo dele. Use cuidadosamente pinças retas e disseque sem rodeios o vaso-alvo e os tecidos ao seu redor.
4. Segure o afastador de fabricação própria (passo 1.4) que continha uma alça de arame na extremidade da mão direita do usuário.
5. Passar cuidadosamente a armadilha do afastador autoconfeccionado sob a aorta entre a artéria carótida comum esquerda e a origem da artéria inominada direita (Figura 2E).
6. Passe o afastador de fabricação própria para a mão esquerda para poupar a mão direita para outros instrumentos.
7. Com uma pinça microscópica na mão direita, passe uma sutura de seda 7-0 através da alça da alça na extremidade e puxe o afastador. Isso permitirá deixar a sutura de seda ao redor da artéria para posterior ligadura (Figura 2F).
   NOTA: Seja gentil e não arraste muito o arco aórtico de sua posição original.
8. Coloque uma agulha 27G paralela à aorta e amarre a sutura ao redor da agulha e da aorta (Figura 2G,H).
   NOTA: O procedimento simulado deve ser o mesmo, exceto que não há ligadura da aorta.
9. Segure a agulha 27 G com pinça oftálmica e outra pinça segurando o nó amarrado à agulha 27 G e à aorta. Retire a agulha 27 G da ligadura de forma rápida, mas suave (Figura 2H).
   NOTA: O nó não deve ser muito apertado, ou não será fácil puxar a agulha. Tenha cuidado ao puxar a agulha em caso de ruptura da aorta.
10. Sutura da pele com fio sintético monofilamentar 4-0 em padrão de sutura interrompida (Figura 2I).

4. Cuidados pós-operatórios

1. Coloque o mouse em uma almofada quente (consulte Tabela de Materiais) e aguarde até que ele reaviva. Geralmente, o rato revive em cerca de 60 min.
   NOTA: O animal não deve ser deixado sozinho até que recupere a consciência suficiente para o decúbito esternal principal.
2. Injetar 0,5 mL de solução salina aquecida por via subcutânea e monitorar a homeostase hídrica dos animais.
   NOTA: Esta etapa evita que os animais sofram desidratação e estado de circulação hipovolêmico.
3. Aplique pomada de eritromicina na superfície da ferida todos os dias por 3 dias.
4. Para o tratamento da dor pós-cirúrgica, administrar 1 mg/L de anestésico local de buprenorfina por via parenteral no local da incisão (ver Tabela de Materiais).
5. No pós-operatório, monitore o camundongo em busca de sinais de infecção e comprometimento (desnutrição, postura curvada e pelos babados).
   OBS: Os animais que passaram por cirurgia não são devolvidos à companhia de outros animais até que estejam totalmente recuperados.

5. Ultrassonografia

1. Confirmar o sucesso da ligadura da aorta transversa calculando a velocidade do fluxo sanguíneo através de um sistema de imagem de ultrassom^12,13 (24 MHz^, ver Tabela de Materiais) 28 dias após a cirurgia.
   1. Anestesiar o animal com isoflurano a 4,5% em ar enriquecido com oxigênio a 20% e manter com isoflurano a 0,5% em ar enriquecido com oxigênio a 20%.
   2. Coloque o mouse em decúbito dorsal e fixe suas extremidades ao eletrodo com fita adesiva.
   3. Usando creme depilatório, remova os pelos do peito e aplique um agente de acoplamento ultra-sônico no peito.
   4. Incline a plataforma para a esquerda o mais longe possível. Ao manter a sonda na posição vertical, abaixe-a gradualmente ao longo da linha paraesternal direita no tórax com o entalhe apontando para o queixo do animal.
   5. No modo B do instrumento, ajuste os eixos X e Y até que o arco aórtico e o local de constrição estejam claramente visíveis.
   6. Clique no botão Pulse Wave Doppler para alternar para o modo de onda de pulso.
   7. Ajuste a caixa de volume de amostra do cursor tracejado distal ao local contraído e encontre o jato estenótico com a maior velocidade.
   8. Clique no botão Doppler de onda de pulso novamente para obter a forma de onda do fluxo aórtico e medir a velocidade de pico. Calcular a velocidade do fluxo sanguíneo de acordo com o pico dos padrões de onda (Figura 3A,B).
   9. Defina o imageador para o modo B. Repouse a plataforma na posição horizontal. Gire a sonda 30° para a linha paraesternal esquerda.
   10. Ajuste os eixos X e Y para obter uma visualização de eixo curto. Pressione o modo M para mostrar a linha do indicador e clique em Cine Store para salvar a imagem para posterior medição da espessura da parede cardíaca, dimensão da câmara e fração de ejeção.
       NOTA: A fórmula para calcular a fração de ejeção: 100% * ((LV Vol;d - LV Vol;s) / LV Vol;d). A fórmula para calcular o débito cardíaco: Volume sistólico * Frequência cardíaca (no primeiro quadro desenhado) / 1000. A maioria dos índices, como fração de ejeção e débito cardíaco, pode ser medida automaticamente através do software do sistema de imagem ultrassônico. Vol;d do VE: volume diastólico do ventrículo esquerdo. Vol;s do VE: volume sistólico do ventrículo esquerdo.

Resultados

Após cirurgia de TAC com sucesso, a sobrecarga de pressão foi detectada usando um sistema de imagem de ultrassom. Quatro semanas após a cirurgia, os ratos desenvolvem diminuição da função cardíaca. No presente estudo, a eficácia da cirurgia de TAC foi validada por meio da fração de ejeção (FE), fração de encurtamento (EF), massa ventricular esquerda (massa do VE) e diâmetro interno do ventrículo esquerdo (LVID) de camundongos submetidos à cirurgia de TAC após 4 semanas. A FE foi significativam...

Discussão

A indução de sobrecarga pressórica sustentada pode gradualmente causar hipertrofia cardíaca e insuficiência cardíaca. Esse modelo tem sido utilizado em inúmeros laboratórios ao redor do mundo^14,15,16. O protocolo proporcionou um método de TAC aprimorado que não necessita de habilidades microcirúrgicas ou ventilação mecânica.

O passo mais importante nesse protocolo é a passagem da sutura...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM403	Used for suturing the skin
5 mL syringe	Haifuda Technology Co., Ltd.	BD-309628	Used for making snare containing retractor
7-0 nonabsorbable suture	Jinhuan	HM701	Used for aorta ligation
Animal temperature monitor	Kaerwen	FT3400	Used for monitoring body temperature
Buprenorphine	Sigma	B-044	Used for post-surgical pain treatment
Depilatory cream	Veet	N/A	Used for remove body hair from the surgical area
Heating Pad	Xiaochuangxin	N/A	Used for maintaining body temperature
Ibuprofen	MCE	HY-78131	Used for post-surgical pain treatment
Iron wire (0.5 mm)	Qing Yuan	Iron wire #26	Used for making snare containing retractor
Microscopic tweezers	RWD	F12006-10	Used for penetrating and separating the tissue to open operation space
Needle holder	RWD	F12005-10	Used for pinching off the tip of gauge needle and blunting it
Ophthalmic forceps	RWD	F14012-10	Used for holding skin and other tissues
Ophthalmic scissors	RWD	S11001-08	Used for making sking incision of mouse
Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	Used for mouse anesthesia
Sterile operating mat	Hale & hearty	211002	Used for placing animal during surgery
Ultra-sound imaging system	Fujifilm visualsonics	vevo1100	Used for measure the blood flow velocity, left ventricular wall thickness and ejection fraction, https://www.visualsonics.com/product/imaging-systems/vevo-1100