A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
إن قدرة البكتيريا على نقل الحمض النووي بين الخلايا البكتيرية تجعلها أدوات فعالة للتلاعب الجيني بمضيفيها البكتيريين. تظهر هنا منهجية لتحريض واستعادة واستخدام φBB-1 ، وهي بكتيريا من Borrelia burgdorferi ، لتحويل الحمض النووي غير المتجانس بين سلالات مختلفة من مرض لايم spirochete.
تم إنجاز إدخال الحمض النووي الأجنبي في اللولبية Borrelia burgdorferi بشكل حصري تقريبا عن طريق التحويل باستخدام التثقيب الكهربائي. هذه العملية لها كفاءة أقل بشكل ملحوظ في مرض لايم spirochete مقارنة بالبكتيريا الأخرى سالبة الجرام ذات الخصائص الأفضل. يعتمد معدل نجاح التحول بشكل كبير على وجود كميات مركزة من الحمض النووي عالي الجودة من خلفيات محددة ويخضع لتباين كبير من سلالة إلى سلالة. يمكن أن تكون الوسائل البديلة لإدخال الحمض النووي الأجنبي (أي ناقلات المكوك ، ومراسلي الفلورسنت ، وعلامات مقاومة المضادات الحيوية) في B. burgdorferi إضافة مهمة إلى تسليح الأدوات المفيدة للتلاعب الجيني لمرض لايم spirochete. تم التعرف على البكتيريا جيدا كآليات طبيعية لحركة الحمض النووي بين البكتيريا في عملية تسمى النقل. في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة لاستخدام العاثية البورلية في كل مكان φBB-1 لتحويل الحمض النووي بين خلايا B. burgdorferi من نفس الخلفيات الجينية والمختلفة. يتضمن الحمض النووي المحول كلا من الحمض النووي المحول والحمض النووي غير المتجانس في شكل نواقل مكوكية صغيرة. يشير هذا العرض التوضيحي إلى استخدام محتمل للنقل بوساطة العاثيات كمكمل للتثقيب الكهربائي للتلاعب الجيني لمرض لايم spirochete. يصف هذا التقرير طرق تحريض وتنقية العاثية φBB-1 من B. burgdorferi ، واستخدام هذه العاثية في مقايسات النقل ، واختيار وفحص المحولات المحتملة.
أضاف تطوير أدوات للتلاعب الجيني للبكتيريا اللولبية Borrelia burgdorferi قيمة لا حصر لها لفهم طبيعة مرض لايم1،2،3،4. يحتوي B. burgdorferi على جينوم معقد بشكل غير عادي يتكون من كروموسوم خطي صغير وبلازميدات خطية ودائرية 5,6. أدى فقدان البلازميد التلقائي ، وإعادة الترتيب داخل الجينات (حركة الجينات من بلازميد إلى آخر داخل نفس الكائن الحي) ، ونقل الجينات الأفقي (HGT ، حركة الحمض النووي بين كائنين) إلى ظهور كمية مذهلة من عدم التجانس الجيني بين B. burgdorferi (على سبيل المثال ، انظر Schutzer et al.7). الأنماط الجينية الناتجة (أو "السلالات") كلها أعضاء في نفس النوع ولكن لها اختلافات وراثية تؤثر على قدرتها على الانتقال إلى وإصابة مضيفات الثدييات المختلفة8،9،10،11. وفي هذا التقرير، سيستخدم مصطلح "سلالة" للإشارة إلى B. burgdorferi ذات الخلفية الجينية المشتقة طبيعيا؛ سيتم استخدام مصطلح "استنساخ" للإشارة إلى سلالة تم تعديلها وراثيا لغرض معين أو نتيجة للتلاعب التجريبي.
يتضمن صندوق الأدوات الجزيئية المتاح للاستخدام في B. burgdorferi علامات قابلة للاختيار ، ومراسلين جينيين ، ونواقل مكوكية ، وطفرات transposon ، ومروجين محرضان ، وعلامات قابلة للاختيار المضاد (للمراجعة ، انظر Drektrah and Samuels12). يتطلب الاستخدام الفعال لهذه المنهجيات الإدخال الاصطناعي للحمض النووي غير المتجانس (الأجنبي) في سلالة B. burgdorferi ذات الأهمية. في B. burgdorferi ، يتم إدخال الحمض النووي غير المتجانس بشكل حصري تقريبا عن طريق التثقيب الكهربائي ، وهي طريقة تستخدم نبضة من الكهرباء لجعل الغشاء البكتيري قابلا للنفاذ بشكل عابر لقطع صغيرة من الحمض النووي يتم إدخالها في الوسائط1. يتم قتل غالبية الخلايا (المقدرة ب ≥99.5٪) بواسطة النبض ، لكن الخلايا المتبقية لديها تردد عال للاحتفاظ بالحمض النووي غير المتجانس13. على الرغم من أنها تعتبر من بين أكثر الطرق كفاءة لإدخال الحمض النووي في البكتيريا ، إلا أن تواتر التثقيب الكهربائي في B. burgdorferi منخفض جدا (يتراوح من محول واحد في 5 × 104 إلى 5 × 106 خلايا)13. يبدو أن الحواجز التي تحول دون تحقيق ترددات أعلى للتحويل هي حواجز تقنية وبيولوجية على حد سواء. تشمل العوائق التقنية أمام التثقيب الكهربائي الناجح ل B. burgdorferi كلا من كمية الحمض النووي (>10 ميكروغرام) الضرورية ومتطلبات اللولبيات لتكون في مرحلة النمو الصحيحة تماما (منتصف السجل ، بين 2 × 10 7 خلايا · مل − 1 و 7 × 107 خلايا · مل − 1) عند تحضير الخلايا الكهربائيةالمختصة 12,13. ومع ذلك ، قد يكون التغلب على هذه الحواجز التقنية أسهل من التغلب على الحواجز البيولوجية.
يدرك باحثو مرض لايم أنه يمكن تقسيم استنساخ B. burgdorferi إلى فئتين عريضتين فيما يتعلق بقدرتها على التلاعب بها وراثيا13,14. غالبا ما تتحول العزلات عالية المرور والمتكيفة في المختبر بسهولة ولكنها عادة ما تفقد البلازميدات الضرورية للعدوى ، وتتصرف بطريقة شاذة من الناحية الفسيولوجية ، ولا يمكنها إصابة مضيف الثدييات أو الاستمرار داخل ناقل القراد12,13. في حين أن هذه الحيوانات المستنسخة كانت مفيدة لتشريح البيولوجيا الجزيئية لل spirochete داخل المختبر ، إلا أنها ذات قيمة قليلة لدراسة spirochete في السياق البيولوجي للدورة enzootic. من ناحية أخرى ، تتصرف العزلات المعدية ذات المرور المنخفض بطريقة فسيولوجية تعكس حالة معدية ويمكن أن تكمل الدورة المعدية ولكنها عادة ما تكون متمردة على إدخال الحمض النووي غير المتجانس ، وبالتالي يصعب التلاعب بها للدراسة12,13. ترتبط صعوبة تحويل عزلات الممر المنخفض بعاملين مختلفين على الأقل: (أ) غالبا ما تتجمع العزلات ذات الممر المنخفض بإحكام معا ، لا سيما في ظل الظروف عالية الكثافة المطلوبة للتثقيب الكهربائي ، وبالتالي تمنع العديد من الخلايا من التطبيق الكامل للشحنة الكهربائية أو الوصول إلى الحمض النووي في الوسائط13,15 ؛ و (ii) يشفر B. burgdorferi نظامين مختلفين على الأقل لتعديل التقييد (R-M) اللذين قد يضعان في عزلات الممر العالي14,16. تطورت أنظمة R-M للسماح للبكتيريا بالتعرف على الحمض النوويالأجنبي 17 والقضاء عليه. في الواقع ، أظهرت العديد من الدراسات في B. burgdorferi أن كفاءات التحول تزداد عندما يكون مصدر الحمض النووي هو B. burgdorferi بدلا من Escherichia coli13,16. لسوء الحظ ، فإن الحصول على التركيز العالي المطلوب من الحمض النووي للتثقيب الكهربائي من B. burgdorferi هو احتمال مكلف ويستغرق وقتا طويلا. مصدر قلق محتمل آخر عند التوصيل الكهربائي واختيار العزلات ذات المرور المنخفض هو أن العملية يبدو أنها تفضل المحولات التي فقدت البلازميد المرتبط بالفوعة الحرجة ، lp2514،18،19 ؛ وبالتالي ، فإن فعل التلاعب الجيني بعزلات B. burgdorferi ذات الممر المنخفض عن طريق التثقيب الكهربائي قد يختار الحيوانات المستنسخة غير المناسبة للتحليل ذي الصلة بيولوجيا ضمن الدورة الحيوانية20. بالنظر إلى هذه المشكلات ، فإن النظام الذي يمكن فيه تحويل الحمض النووي غير المتجانس كهربائيا إلى استنساخ B. burgdorferi عالي المرور ثم نقله إلى عزلات معدية منخفضة المرور بطريقة أخرى غير التثقيب الكهربائي يمكن أن يكون إضافة مرحب بها إلى المجموعة المتزايدة من الأدوات الجزيئية المتاحة للاستخدام في مرض لايم spirochete.
بالإضافة إلى التحول (امتصاص الحمض النووي العاري) ، هناك آليتان أخريان تأخذ من خلالهما البكتيريا بانتظام الحمض النووي غير المتجانس: الاقتران ، وهو تبادل الحمض النووي بين البكتيريا في اتصال جسدي مباشر مع بعضها البعض ، والنقل ، وهو تبادل الحمض النووي بوساطة البكتيريا21. في الواقع ، تم استخدام قدرة البكتيريا على التوسط HGT كأداة تجريبية لتشريح العمليات الجزيئية داخل عدد من الأنظمة البكتيرية22،23،24. B. burgdorferi ليست مؤهلة بشكل طبيعي لامتصاص الحمض النووي العاري ، وهناك القليل من الأدلة على أن B. burgdorferi يشفر الجهاز اللازم لتعزيز الاقتران الناجح. ومع ذلك ، فقد وصفت التقارير السابقة التحديد والتوصيف الأولي ل φBB-1 ، وهي بكتيريا معتدلة من B. burgdorferi25،26،27،28. φBB-1 حزم عائلة من 30 كيلو بايت البلازميدات الموجودة داخل B. burgdorferi25 ؛ تم تعيين أفراد هذه العائلة CP32S. تمشيا مع دور φBB-1 في المشاركة في HGT بين سلالات B. burgdorferi ، أبلغ Stevenson et al. عن وجود cp32 متطابق في سلالتين مع cp32s متباينة ، مما يشير إلى مشاركة حديثة لهذا cp32 بين هاتين السلالتين ، على الأرجح عن طريق النقل29. هناك أيضا دليل على إعادة تركيب كبيرة عبر HGT بين cp32s في جينوم مستقر نسبيا30،31،32،33. أخيرا ، تم إثبات قدرة φBB-1 على تحويل كل من cp32s والحمض النووي المتجه للمكوك غير المتجانس بين خلايا نفس السلالة وبين خلايا سلالتين مختلفتين سابقا27,28. بالنظر إلى هذه النتائج ، تم اقتراح φBB-1 كأداة أخرى يتم تطويرها لتشريح البيولوجيا الجزيئية ل B. burgdorferi.
الهدف من هذا التقرير هو تفصيل طريقة لتحفيز وتنقية العاثية φBB-1 من B. burgdorferi ، بالإضافة إلى توفير بروتوكول لإجراء اختبار نقل بين استنساخ B. burgdorferi واختيار وفحص المحولات المحتملة.
تمت مراجعة جميع التجارب التي تستخدم الحمض النووي المؤتلف والكائنات الحية BSL-2 والموافقة عليها من قبل لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة كوينيبياك.
1. إعداد ثقافة B. burgdorferi لإنتاج φBB-1
2. تحديد كثافة ثقافة (ثقافات) B. burgdorferi (معدلة من Samuels)15
3. تحريض B. بورغدورفيري فاج φBB-1
ملاحظة: تعقيم جميع الأواني الزجاجية والبلاستيكية عن طريق التعقيم ؛ تعقيم جميع الحلول عن طريق التعقيم أو الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يتم تقديم الخطوات أدناه بناء على أحجام 15 مل ، ولكن الطريقة قابلة للتطوير إلى أحجام أصغر أو أكبر اعتمادا على الاحتياجات الفردية للتجربة.
4. النقل أثناء الاستزراع المشترك بعد تعرض المتبرع للعامل المحرض (الشكل 1 أ)
ملاحظة: لا يمكن استخدام هذا البروتوكول إلا عندما تكون السلالة المنتجة للعاثيات (المتبرع) مقاومة لمضاد حيوي معين والسلالة المراد تحويلها (المتلقي) لديها مقاومة لمضاد حيوي آخر.
5. ترسيب البولي إيثيلين جلايكول (PEG) لاستعادة العاثية لاستخدامها في مقايسة النقل
ملاحظة: يمكن استخدام هذا البروتوكول في الحالات التي يكون فيها للسلالة المنتجة للعاثيات (المانح) مقاومة لمضاد حيوي معين والسلالة المراد تحويلها (المتلقي) إما ليس لديها مقاومة للمضادات الحيوية أو مقاومة لمضاد حيوي آخر.
6. مقايسة النقل بعد هطول الأمطار PEG من φBB-1 (الشكل 1B)
7. اختيار المحولات
ملاحظة: يتم إجراء طلاء الطور الصلب للمحولات المحتملة باستخدام تعديل أحادي الطبقة للبروتوكول الذي وصفه صموئيل15 لأول مرة. تنمو مستعمرات B. burgdorferi داخل أجار ، لذلك لاختيار المحولات عن طريق الطلاء في المرحلة الصلبة ، يجب إضافة العينات إلى الوسائط أثناء سكب الألواح. كما تم وصف طريقة بديلة لاختيار المحولات باستخدام طريقة التخفيف في 96 لوحة بئر سابقا35. قد تكون هذه التقنية فعالة أيضا في اختيار أجهزة التحويل ولكن لم يتم تجربتها بعد لهذا الغرض.
8. التحقق من المحولات المحتملة
ملاحظة: فحص الحيوانات المستنسخة التي تنمو على لوحات في وجود اثنين من المضادات الحيوية للتحقق من أنها تمثل ناقلات حقيقية في الخلفية المتوقعة (المتلقي). تعتمد هذه الطرق على تضخيم مناطق محددة ، وربما تسلسلها ، بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل. تم وصف البروتوكولات والممارسات التفصيلية لأداء تفاعل البوليميراز المتسلسل في B. burgdorferi في مكان آخر (للحصول على مثال حديث ، انظر Seshu et al.37). حدد البادئات المستخدمة لفحص المحولات بناء على السلالات المستخدمة. فيما يلي بعض الاقتراحات حول كيفية التعامل مع فحص أجهزة التحويل.
يمثل استخدام البكتيريا لنقل الحمض النووي بين سلالات B. burgdorferi القابلة للتحويل بسهولة أكبر أو الحيوانات المستنسخة المتمردة على التحول الكهربائي أداة أخرى للتحقيق الجزيئي المستمر لمحددات مرض لايم. يمكن تعديل مقايسة النقل الموصوفة هنا حسب الحاجة لتسهيل حركة الحمض النووي بين أي مستنسخا...
يمكن أن يمثل استخدام النقل طريقة واحدة للتغلب على الأقل على بعض الحواجز البيولوجية والتقنية المرتبطة بالتحويل الكهربائي ل B. burgdorferi1،4،13،37. في العديد من الأنظمة ، يمكن للبكتيريا نقل الحمض النووي المضيف (غير التكهني...
ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.
يود المؤلف أن يشكر شونا ريد ود. سكوت صامويلز وباتريك سيكور على مناقشتهم المفيدة وفاريون (بام) تشونوييراونغ على مساعدتهم التقنية. تم دعم هذا العمل من قبل قسم العلوم الطبية الحيوية ومنح أبحاث أعضاء هيئة التدريس إلى كريستيان إتش إيجرز من كلية العلوم الصحية بجامعة كوينيبياك.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) | USA Scientific | 1450-0810 | holds 4 mL with low void volume (for induction) |
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 5618-8271 | |
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | Millipore Sigma | CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute | |
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | autoclave prior to use |
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 1500-1211 | |
Absolute ethanol | |||
Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
Bovine serum albumin (serum replacement grade) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
Chloroform (for molecular biology) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood |
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) | US Biological | C5900-01 | cell culture grade |
Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
Gentamicin reagent solution | Gibco | 15750-060 | |
Glucose (Dextrose Anhydrous) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
Kanamycin sulfate | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
Millex-GS (0.22 µM pore size) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions |
Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood |
N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
Oligonucleotides (primers for PCR) | IDT DNA | ||
OmniPrep (total genomic extraction kit) | G Biosciences | 786-136 | |
Petri Dish (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | HS-3900 | |
Petroff-Hausser counting chamber cover glass | Hausser scientific | HS-5051 | |
Polyethylene glycol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | heat inactivate as per manufacturer's instructions |
Semi-micro UV transparent cuvettes | USA Scientific | 9750-9150 | |
Sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P8674-25G | |
Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
Streptomycin sulfate solution | Millipore Sigma | S6501-50G | |
Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804-500G | sodium citrate for BSK |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved