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Method Article
La capacità dei batteriofagi di spostare il DNA tra le cellule batteriche li rende strumenti efficaci per la manipolazione genetica dei loro ospiti batterici. Presentata qui è una metodologia per indurre, recuperare e utilizzare φBB-1, un batteriofago di Borrelia burgdorferi, per trasdurre DNA eterologo tra diversi ceppi della spirocheta della malattia di Lyme.
L'introduzione di DNA estraneo nella spirocheta Borrelia burgdorferi è stata ottenuta quasi esclusivamente mediante trasformazione mediante elettroporazione. Questo processo ha efficienze notevolmente inferiori nella spirocheta della malattia di Lyme rispetto ad altri batteri Gram-negativi meglio caratterizzati. Il tasso di successo della trasformazione dipende fortemente dall'avere quantità concentrate di DNA di alta qualità da background specifici ed è soggetto a una significativa variabilità da ceppo a ceppo. Mezzi alternativi per introdurre DNA estraneo (cioè vettori navetta, reporter fluorescenti e marcatori di resistenza agli antibiotici) in B. burgdorferi potrebbero essere un'importante aggiunta all'armamentario di strumenti utili per la manipolazione genetica della spirocheta della malattia di Lyme. I batteriofagi sono stati ben riconosciuti come meccanismi naturali per il movimento del DNA tra i batteri in un processo chiamato trasduzione. In questo studio, è stato sviluppato un metodo per utilizzare l'onnipresente fago borreliale φBB-1 per trasdurre il DNA tra cellule di B. burgdorferi dello stesso background genetico e di diversi background genetici. Il DNA trasdotto include sia DNA borreliale che DNA eterologo sotto forma di piccoli vettori navetta. Questa dimostrazione suggerisce un potenziale uso della trasduzione mediata dai fagi come complemento all'elettroporazione per la manipolazione genetica della spirocheta della malattia di Lyme. Questo rapporto descrive i metodi per l'induzione e la purificazione del fago φBB-1 da B. burgdorferi, l'uso di questo fago nei saggi di trasduzione e la selezione e lo screening di potenziali trasduttori.
Lo sviluppo di strumenti per la manipolazione genetica del batterio spirochetale Borrelia burgdorferi ha aggiunto un valore incommensurabile alla comprensione della natura della malattia di Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi ha un genoma insolitamente complesso composto da un piccolo cromosoma lineare e plasmidi sia lineari che circolari 5,6. La perdita spontanea di plasmidi, il riarrangiamento intragenico (spostamento di geni da un plasmide all'altro all'interno dello stesso organismo) e il trasferimento genico orizzontale (HGT, il movimento del DNA tra due organismi) hanno dato origine a una quantità vertiginosa di eterogeneità genetica tra B. burgdorferi (per un esempio, vedi Schutzer et al.7). I genotipi risultanti (o "ceppi") sono tutti membri della stessa specie, ma hanno differenze genetiche che influenzano la loro capacità di trasmettere e infettare diversi ospiti di mammiferi 8,9,10,11. In questa relazione, il termine "ceppo" sarà utilizzato per riferirsi a B. burgdorferi con un particolare background genetico di derivazione naturale; Il termine "clone" sarà utilizzato per riferirsi a un ceppo che è stato geneticamente modificato per uno scopo particolare o come risultato di manipolazione sperimentale.
La cassetta degli attrezzi molecolare disponibile per l'uso in B. burgdorferi include marcatori selezionabili, segnalatori genici, vettori shuttle, mutagenesi dei trasposoni, promotori inducibili e marcatori controselezionabili (per una revisione, vedi Drektrah e Samuels12). L'uso efficace di queste metodologie richiede l'introduzione artificiale di DNA eterologo (estraneo) in un ceppo di interesse di B. burgdorferi. In B. burgdorferi, l'introduzione del DNA eterologo è ottenuta quasi esclusivamente tramite elettroporazione, un metodo che utilizza un impulso di elettricità per rendere una membrana batterica transitoriamente permeabile a piccoli pezzi di DNA introdotti nei mezzi1. La maggior parte delle cellule (stimate in ≥99,5%) vengono uccise dall'impulso, ma le cellule rimanenti hanno un'alta frequenza di trattenere il DNA eterologo13. Sebbene sia considerato uno dei metodi più efficienti per introdurre il DNA nei batteri, la frequenza di elettroporazione in B. burgdorferi è molto bassa (che va da 1 trasformante in 5 × 104 a 5 × 106 cellule)13. Gli ostacoli al raggiungimento di frequenze di trasformazione più elevate sembrano essere sia tecnici che biologici. Gli ostacoli tecnici al successo dell'elettroporazione di B. burgdorferi includono sia la quantità di DNA (>10 μg) necessaria sia il requisito che le spirochete siano esattamente nella corretta fase di crescita (mid-log, tra 2 × 10 7 cellule·mL−1 e 7 × 107 cellule·mL−1) durante la preparazione di cellule elettrocompetenti12,13. Queste barriere tecniche, tuttavia, possono essere più facili da superare rispetto alle barriere biologiche.
I ricercatori della malattia di Lyme riconoscono che i cloni di B. burgdorferi possono essere divisi in due grandi categorie rispetto alla loro capacità di essere manipolati geneticamente13,14. Gli isolati adattati in laboratorio ad alto passaggio sono spesso facilmente trasformabili, ma di solito hanno perso i plasmidi essenziali per l'infettività, si comportano in modo fisiologicamente aberrante e non sono in grado di infettare un ospite di mammifero o persistere all'interno di un vettore zecca12,13. Mentre questi cloni sono stati utili per sezionare la biologia molecolare della spirocheta all'interno del laboratorio, sono di scarso valore per lo studio della spirocheta nel contesto biologico del ciclo enzootico. Gli isolati infettivi a basso passaggio, invece, si comportano in maniera fisiologica riflettente uno stato infettivo e possono completare il ciclo infettivo ma di solito sono recalcitranti all'introduzione di DNA eterologo e sono, quindi, difficili da manipolare per lo studio12,13. La difficoltà nel trasformare gli isolati a basso passaggio è legata ad almeno due diversi fattori: (i) gli isolati a basso passaggio spesso si raggruppano strettamente, in particolare nelle condizioni di alta densità richieste per l'elettroporazione, bloccando così molte cellule dalla piena applicazione della carica elettrica o dall'accesso al DNA nei mezzi13,15; e (ii) B. burgdorferi codifica almeno due diversi sistemi di modificazione della restrizione trasmessa da plasmidi (R-M) che possono essere persi negli isolati ad alto passaggio14,16. I sistemi R-M si sono evoluti per consentire ai batteri di riconoscere ed eliminare il DNA estraneo17. Infatti, diversi studi su B. burgdorferi hanno dimostrato che l'efficienza di trasformazione aumenta quando la fonte del DNA è B. burgdorferi piuttosto che Escherichia coli13,16. Sfortunatamente, acquisire l'alta concentrazione di DNA necessaria per l'elettroporazione da B. burgdorferi è una prospettiva costosa e dispendiosa in termini di tempo. Un'altra potenziale preoccupazione quando si elettroporano e si selezionano isolati a basso passaggio è che il processo sembra favorire i trasformanti che hanno perso il plasmide associato alla virulenza critica, lp2514,18,19; pertanto, l'atto stesso di manipolare geneticamente isolati di B. burgdorferi a basso passaggio tramite elettroporazione può selezionare cloni che non sono adatti per analisi biologicamente rilevanti all'interno del ciclo enzootico20. Dati questi problemi, un sistema in cui il DNA eterologo potrebbe essere elettrotrasformato in cloni di B. burgdorferi ad alto passaggio e quindi trasferito in isolati infettivi a basso passaggio con un metodo diverso dall'elettroporazione potrebbe essere una gradita aggiunta alla crescente collezione di strumenti molecolari disponibili per l'uso nella spirocheta della malattia di Lyme.
Oltre alla trasformazione (l'assorbimento del DNA nudo), ci sono altri due meccanismi attraverso i quali i batteri assumono regolarmente DNA eterologo: la coniugazione, che è lo scambio di DNA tra batteri in contatto fisico diretto tra loro, e la trasduzione, che è lo scambio di DNA mediato da un batteriofago21. Infatti, la capacità del batteriofago di mediare l'HGT è stata utilizzata come strumento sperimentale per sezionare i processi molecolari all'interno di un certo numero di sistemi batterici22,23,24. B. burgdorferi non è naturalmente competente per l'assorbimento del DNA nudo, e ci sono poche prove che B. burgdorferi codifichi l'apparato necessario per promuovere una coniugazione di successo. Precedenti studi hanno descritto, tuttavia, l'identificazione e la caratterizzazione preliminare di φBB-1, un batteriofago temperato di B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 racchiude una famiglia di plasmidi da 30 kb trovati in B. burgdorferi25; I membri di questa famiglia sono stati designati CP32. Coerentemente con il ruolo di φBB-1 nella partecipazione all'HGT tra i ceppi di B. burgdorferi, Stevenson et al. hanno riportato un cp32 identico trovato in due ceppi con cp32 altrimenti disparati, suggerendo una recente condivisione di questo cp32 tra questi due ceppi, probabilmente tramite trasduzione29. Ci sono anche prove di una significativa ricombinazione tramite HGT tra i cp32 in un genoma 30,31,32,33 altrimenti relativamente stabile. Infine, la capacità di φBB-1 di trasdurre sia cp32s che DNA vettoriale shuttle eterologo tra cellule dello stesso ceppo e tra cellule di due ceppi diversi è stata dimostrata in precedenza27,28. Alla luce di questi risultati, φBB-1 è stato proposto come un altro strumento da sviluppare per la dissezione della biologia molecolare di B. burgdorferi.
L'obiettivo di questo rapporto è quello di dettagliare un metodo per indurre e purificare il fago φBB-1 da B. burgdorferi, oltre a fornire un protocollo per eseguire un saggio di trasduzione tra cloni di B. burgdorferi e selezionare e selezionare potenziali trasduttori.
Tutti gli esperimenti che utilizzano DNA ricombinante e organismi BSL-2 sono stati esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la biosicurezza dell'Università di Quinnipiac.
1. Preparazione della coltura di B. burgdorferi per la produzione di φBB-1
2. Determinare la densità della/e coltura/e di B. burgdorferi (modificata da Samuels)15
3. Induzione del fago di B. burgdorferi φBB-1
NOTA: Sterilizzare tutti i bicchieri e le materie plastiche in autoclave; sterilizzare tutte le soluzioni mediante autoclave o filtrazione attraverso un filtro da 0,22 μM. I passaggi seguenti sono presentati in base a volumi di 15 ml, ma il metodo è scalabile a volumi più piccoli o più grandi a seconda delle esigenze individuali dell'esperimento.
4. Trasduzione durante la co-coltura in seguito all'esposizione della donatrice all'agente induttore (Figura 1A)
NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato solo quando il ceppo fagico produttore (donatore) ha resistenza a un particolare antibiotico e il ceppo da trasdurre (ricevente) ha resistenza ad un altro antibiotico.
5. Precipitazione di polietilenglicole (PEG) per recuperare il fago da utilizzare nel saggio di trasduzione
NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato nei casi in cui il ceppo produttore di fagi (donatore) ha resistenza a un particolare antibiotico e il ceppo da trasdurre (ricevente) non ha resistenza agli antibiotici o resistenza ad un altro antibiotico.
6. Saggio di trasduzione dopo precipitazione PEG di φBB-1 (Figura 1B)
7. Selezione dei trasduttori
NOTA: La placcatura in fase solida di potenziali trasduttori viene eseguita utilizzando una modifica a strato singolo del protocollo descritto per la prima volta da Samuels15. Le colonie di B. burgdorferi crescono all'interno dell'agar, quindi per la selezione dei trasduttori mediante placcatura in fase solida, i campioni devono essere aggiunti al mezzo mentre le piastre vengono versate. Un metodo alternativo per la selezione dei trasformanti utilizzando un metodo di diluizione in piastre a 96 pozzetti è stato descritto in precedenza35. Questa tecnica potrebbe anche essere efficace per la selezione dei trasduttori ma non è ancora stata provata per questo scopo.
8. Verifica dei potenziali trasduttori
NOTA: Esaminare i cloni che crescono su piastre in presenza di due antibiotici per verificare che rappresentino veri trasduttori nello sfondo previsto (ricevente). Questi metodi si basano sull'amplificazione, e potenzialmente sul sequenziamento, di regioni specifiche mediante la reazione a catena della polimerasi. Protocolli dettagliati e pratiche di esecuzione della PCR in B. burgdorferi sono descritti altrove (per un esempio recente, vedi Seshu et al.37). Selezionare i primer utilizzati per vagliare i trasduttori in base ai ceppi utilizzati. Alcuni suggerimenti su come affrontare lo screening dei trasduttori sono descritti di seguito.
L'uso del batteriofago per spostare il DNA tra ceppi di B. burgdorferi più facilmente trasformabili o cloni che sono recalcitranti all'elettrotrasformazione rappresenta un altro strumento per la continua indagine molecolare dei determinanti della malattia di Lyme. Il saggio di trasduzione qui descritto può essere modificato secondo necessità per facilitare il movimento del DNA tra eventuali cloni di interesse utilizzando uno o due antibiotici per la selezione di potenziali trasduttori. La trasduzione sia del ...
L'uso della trasduzione potrebbe rappresentare un metodo per superare almeno alcune delle barriere biologiche e tecniche associate all'elettrotrasformazione di B. burgdorferi 1,4,13,37. In molti sistemi, il batteriofago può spostare il DNA dell'ospite (non profago) tra le cellule batteriche mediante trasduzione generalizzata o specializzata 22,23,24,49,50....
L'autore non ha nulla da rivelare.
L'autore desidera ringraziare Shawna Reed, D. Scott Samuels e Patrick Secor per la loro utile discussione e Vareeon (Pam) Chonweerawong per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Scienze Biomediche e dalle borse di ricerca della facoltà a Christian H. Eggers della School of Health Sciences della Quinnipiac University.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) | USA Scientific | 1450-0810 | holds 4 mL with low void volume (for induction) |
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 5618-8271 | |
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) | Millipore Sigma | CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute | |
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | autoclave prior to use |
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) | USA Scientific | 1500-1211 | |
Absolute ethanol | |||
Agarose LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
Bacto Neopeptone | Gibco | DF0119-17-9 | |
Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
Bovine serum albumin (serum replacement grade) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
Chloroform (for molecular biology) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood |
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) | US Biological | C5900-01 | cell culture grade |
Erythromycin | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
Gentamicin reagent solution | Gibco | 15750-060 | |
Glucose (Dextrose Anhydrous) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
Kanamycin sulfate | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
Millex-GS (0.22 µM pore size) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions |
Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood |
N-acetyl-D-glucosamine | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
Oligonucleotides (primers for PCR) | IDT DNA | ||
OmniPrep (total genomic extraction kit) | G Biosciences | 786-136 | |
Petri Dish (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | HS-3900 | |
Petroff-Hausser counting chamber cover glass | Hausser scientific | HS-5051 | |
Polyethylene glycol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | heat inactivate as per manufacturer's instructions |
Semi-micro UV transparent cuvettes | USA Scientific | 9750-9150 | |
Sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
Sodium pyruvate | Millipore Sigma | P8674-25G | |
Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
Streptomycin sulfate solution | Millipore Sigma | S6501-50G | |
Trisodium citrate dihydrate | Millipore Sigma | S1804-500G | sodium citrate for BSK |
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