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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La capacità dei batteriofagi di spostare il DNA tra le cellule batteriche li rende strumenti efficaci per la manipolazione genetica dei loro ospiti batterici. Presentata qui è una metodologia per indurre, recuperare e utilizzare φBB-1, un batteriofago di Borrelia burgdorferi, per trasdurre DNA eterologo tra diversi ceppi della spirocheta della malattia di Lyme.

Abstract

L'introduzione di DNA estraneo nella spirocheta Borrelia burgdorferi è stata ottenuta quasi esclusivamente mediante trasformazione mediante elettroporazione. Questo processo ha efficienze notevolmente inferiori nella spirocheta della malattia di Lyme rispetto ad altri batteri Gram-negativi meglio caratterizzati. Il tasso di successo della trasformazione dipende fortemente dall'avere quantità concentrate di DNA di alta qualità da background specifici ed è soggetto a una significativa variabilità da ceppo a ceppo. Mezzi alternativi per introdurre DNA estraneo (cioè vettori navetta, reporter fluorescenti e marcatori di resistenza agli antibiotici) in B. burgdorferi potrebbero essere un'importante aggiunta all'armamentario di strumenti utili per la manipolazione genetica della spirocheta della malattia di Lyme. I batteriofagi sono stati ben riconosciuti come meccanismi naturali per il movimento del DNA tra i batteri in un processo chiamato trasduzione. In questo studio, è stato sviluppato un metodo per utilizzare l'onnipresente fago borreliale φBB-1 per trasdurre il DNA tra cellule di B. burgdorferi dello stesso background genetico e di diversi background genetici. Il DNA trasdotto include sia DNA borreliale che DNA eterologo sotto forma di piccoli vettori navetta. Questa dimostrazione suggerisce un potenziale uso della trasduzione mediata dai fagi come complemento all'elettroporazione per la manipolazione genetica della spirocheta della malattia di Lyme. Questo rapporto descrive i metodi per l'induzione e la purificazione del fago φBB-1 da B. burgdorferi, l'uso di questo fago nei saggi di trasduzione e la selezione e lo screening di potenziali trasduttori.

Introduzione

Lo sviluppo di strumenti per la manipolazione genetica del batterio spirochetale Borrelia burgdorferi ha aggiunto un valore incommensurabile alla comprensione della natura della malattia di Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi ha un genoma insolitamente complesso composto da un piccolo cromosoma lineare e plasmidi sia lineari che circolari 5,6. La perdita spontanea di plasmidi, il riarrangiamento intragenico (spostamento di geni da un plasmide all'altro all'interno dello stesso organismo) e il trasferimento genico orizzontale (HGT, il movimento del DNA tra due organismi) hanno dato origine a una quantità vertiginosa di eterogeneità genetica tra B. burgdorferi (per un esempio, vedi Schutzer et al.7). I genotipi risultanti (o "ceppi") sono tutti membri della stessa specie, ma hanno differenze genetiche che influenzano la loro capacità di trasmettere e infettare diversi ospiti di mammiferi 8,9,10,11. In questa relazione, il termine "ceppo" sarà utilizzato per riferirsi a B. burgdorferi con un particolare background genetico di derivazione naturale; Il termine "clone" sarà utilizzato per riferirsi a un ceppo che è stato geneticamente modificato per uno scopo particolare o come risultato di manipolazione sperimentale.

La cassetta degli attrezzi molecolare disponibile per l'uso in B. burgdorferi include marcatori selezionabili, segnalatori genici, vettori shuttle, mutagenesi dei trasposoni, promotori inducibili e marcatori controselezionabili (per una revisione, vedi Drektrah e Samuels12). L'uso efficace di queste metodologie richiede l'introduzione artificiale di DNA eterologo (estraneo) in un ceppo di interesse di B. burgdorferi. In B. burgdorferi, l'introduzione del DNA eterologo è ottenuta quasi esclusivamente tramite elettroporazione, un metodo che utilizza un impulso di elettricità per rendere una membrana batterica transitoriamente permeabile a piccoli pezzi di DNA introdotti nei mezzi1. La maggior parte delle cellule (stimate in ≥99,5%) vengono uccise dall'impulso, ma le cellule rimanenti hanno un'alta frequenza di trattenere il DNA eterologo13. Sebbene sia considerato uno dei metodi più efficienti per introdurre il DNA nei batteri, la frequenza di elettroporazione in B. burgdorferi è molto bassa (che va da 1 trasformante in 5 × 104 a 5 × 106 cellule)13. Gli ostacoli al raggiungimento di frequenze di trasformazione più elevate sembrano essere sia tecnici che biologici. Gli ostacoli tecnici al successo dell'elettroporazione di B. burgdorferi includono sia la quantità di DNA (>10 μg) necessaria sia il requisito che le spirochete siano esattamente nella corretta fase di crescita (mid-log, tra 2 × 10 7 cellule·mL−1 e 7 × 107 cellule·mL−1) durante la preparazione di cellule elettrocompetenti12,13. Queste barriere tecniche, tuttavia, possono essere più facili da superare rispetto alle barriere biologiche.

I ricercatori della malattia di Lyme riconoscono che i cloni di B. burgdorferi possono essere divisi in due grandi categorie rispetto alla loro capacità di essere manipolati geneticamente13,14. Gli isolati adattati in laboratorio ad alto passaggio sono spesso facilmente trasformabili, ma di solito hanno perso i plasmidi essenziali per l'infettività, si comportano in modo fisiologicamente aberrante e non sono in grado di infettare un ospite di mammifero o persistere all'interno di un vettore zecca12,13. Mentre questi cloni sono stati utili per sezionare la biologia molecolare della spirocheta all'interno del laboratorio, sono di scarso valore per lo studio della spirocheta nel contesto biologico del ciclo enzootico. Gli isolati infettivi a basso passaggio, invece, si comportano in maniera fisiologica riflettente uno stato infettivo e possono completare il ciclo infettivo ma di solito sono recalcitranti all'introduzione di DNA eterologo e sono, quindi, difficili da manipolare per lo studio12,13. La difficoltà nel trasformare gli isolati a basso passaggio è legata ad almeno due diversi fattori: (i) gli isolati a basso passaggio spesso si raggruppano strettamente, in particolare nelle condizioni di alta densità richieste per l'elettroporazione, bloccando così molte cellule dalla piena applicazione della carica elettrica o dall'accesso al DNA nei mezzi13,15; e (ii) B. burgdorferi codifica almeno due diversi sistemi di modificazione della restrizione trasmessa da plasmidi (R-M) che possono essere persi negli isolati ad alto passaggio14,16. I sistemi R-M si sono evoluti per consentire ai batteri di riconoscere ed eliminare il DNA estraneo17. Infatti, diversi studi su B. burgdorferi hanno dimostrato che l'efficienza di trasformazione aumenta quando la fonte del DNA è B. burgdorferi piuttosto che Escherichia coli13,16. Sfortunatamente, acquisire l'alta concentrazione di DNA necessaria per l'elettroporazione da B. burgdorferi è una prospettiva costosa e dispendiosa in termini di tempo. Un'altra potenziale preoccupazione quando si elettroporano e si selezionano isolati a basso passaggio è che il processo sembra favorire i trasformanti che hanno perso il plasmide associato alla virulenza critica, lp2514,18,19; pertanto, l'atto stesso di manipolare geneticamente isolati di B. burgdorferi a basso passaggio tramite elettroporazione può selezionare cloni che non sono adatti per analisi biologicamente rilevanti all'interno del ciclo enzootico20. Dati questi problemi, un sistema in cui il DNA eterologo potrebbe essere elettrotrasformato in cloni di B. burgdorferi ad alto passaggio e quindi trasferito in isolati infettivi a basso passaggio con un metodo diverso dall'elettroporazione potrebbe essere una gradita aggiunta alla crescente collezione di strumenti molecolari disponibili per l'uso nella spirocheta della malattia di Lyme.

Oltre alla trasformazione (l'assorbimento del DNA nudo), ci sono altri due meccanismi attraverso i quali i batteri assumono regolarmente DNA eterologo: la coniugazione, che è lo scambio di DNA tra batteri in contatto fisico diretto tra loro, e la trasduzione, che è lo scambio di DNA mediato da un batteriofago21. Infatti, la capacità del batteriofago di mediare l'HGT è stata utilizzata come strumento sperimentale per sezionare i processi molecolari all'interno di un certo numero di sistemi batterici22,23,24. B. burgdorferi non è naturalmente competente per l'assorbimento del DNA nudo, e ci sono poche prove che B. burgdorferi codifichi l'apparato necessario per promuovere una coniugazione di successo. Precedenti studi hanno descritto, tuttavia, l'identificazione e la caratterizzazione preliminare di φBB-1, un batteriofago temperato di B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 racchiude una famiglia di plasmidi da 30 kb trovati in B. burgdorferi25; I membri di questa famiglia sono stati designati CP32. Coerentemente con il ruolo di φBB-1 nella partecipazione all'HGT tra i ceppi di B. burgdorferi, Stevenson et al. hanno riportato un cp32 identico trovato in due ceppi con cp32 altrimenti disparati, suggerendo una recente condivisione di questo cp32 tra questi due ceppi, probabilmente tramite trasduzione29. Ci sono anche prove di una significativa ricombinazione tramite HGT tra i cp32 in un genoma 30,31,32,33 altrimenti relativamente stabile. Infine, la capacità di φBB-1 di trasdurre sia cp32s che DNA vettoriale shuttle eterologo tra cellule dello stesso ceppo e tra cellule di due ceppi diversi è stata dimostrata in precedenza27,28. Alla luce di questi risultati, φBB-1 è stato proposto come un altro strumento da sviluppare per la dissezione della biologia molecolare di B. burgdorferi.

L'obiettivo di questo rapporto è quello di dettagliare un metodo per indurre e purificare il fago φBB-1 da B. burgdorferi, oltre a fornire un protocollo per eseguire un saggio di trasduzione tra cloni di B. burgdorferi e selezionare e selezionare potenziali trasduttori.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che utilizzano DNA ricombinante e organismi BSL-2 sono stati esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la biosicurezza dell'Università di Quinnipiac.

1. Preparazione della coltura di B. burgdorferi per la produzione di φBB-1

  1. Preparare Barbour-Stoenner-Kelly medium integrato con siero di coniglio normale inattivato dal calore (BSK)15 al 6,6%. Per 1 L di 1x BSK, unire i componenti elencati nella Tabella 1 in 900 mL di acqua, regolare il pH a 7,6 utilizzando idrossido di sodio 1 N e mescolare lentamente a 4 °C per 2-4 ore. Al termine della miscelazione, controllare e regolare nuovamente il pH a 7,6, se necessario, e aumentare il volume a 1 L con acqua. Sterilizzare il mezzo passando attraverso un filtro da 0,22 μM (vedi Tabella dei materiali) e utilizzare fresco o conservare a 4 °C per ≤2 mesi.
  2. Da tre a cinque giorni prima di iniziare il protocollo di trasduzione, inoculare 150 μL del clone o dei cloni appropriati di B. burgdorferi in 15 mL di 1x BSK in provette coniche coniche sterili ben chiuse (vedere Tabella dei materiali). Integrare il terreno con la concentrazione appropriata di antibiotici o la combinazione di antibiotici per la selezione e il mantenimento del DNA eterologo all'interno del clone o dei cloni di B. burgdorferi (Tabella 2).
    NOTA: B. burgdorferi è un organismo di livello 2 di biosicurezza. Prendere tutte le precauzioni appropriate mentre si lavora con questo organismo. Eseguire tutti i lavori con colture vive di B. burgdorferi in un armadio di biosicurezza di classe II certificato e adeguatamente disinfettato. Smaltire correttamente tutto il materiale che contatta B. burgdorferi e gli organismi stessi in base alle linee guida CDC34.
  3. Incubare le colture a 33 °C senza agitare fino a quando le colture raggiungono una densità di ≥5 × 107 spirochette·mL−1, che richiede circa 3-5 giorni.

2. Determinare la densità della/e coltura/e di B. burgdorferi (modificata da Samuels)15

  1. Per densità che si prevede siano superiori a 5 × 106 cellule·mL−1, determinare la densità cellulare mediante spettroscopia.
    1. Trasferire 1 mL di coltura in una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL e centrifugare a 8.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 e 1,8mM KH2PO4). Trasferire l'intera sospensione cellulare in una cuvetta trasparente semi-micro UV.
    3. Determinare la densità ottica del campione risospeso a una lunghezza d'onda di 600 nm (A600). Azzerare lo spettrofotometro (vedi Tabella dei materiali) rispetto al PBS.
    4. Per calcolare la concentrazione di spirochete·mL−1 nella coltura originale, moltiplicare la densità ottica a A600 per 1,4 × 109.
  2. Per densità previste comprese tra 5 × 104 celle·mL− 1 e 5 × 106 celle·mL−1, determinare la densità cellulare utilizzando una camera di conteggio di Petroff-Hausser (vedi Tabella dei materiali) per contare direttamente il numero di spirochete. Questo metodo può essere utilizzato anche per densità più elevate dopo un'appropriata diluizione.
    NOTA: La visualizzazione di spirochete vive richiede un microscopio modificato con un condensatore in campo oscuro.
    1. Applicare 10 μL di campione nella camera di conteggio e coprire con un vetro di copertura appropriato. Per densità superiori a 1 × 107, diluire il campione in PBS per ottenere 50-100 spirochete per campo.
    2. Contare le cellule usando un microscopio a campo scuro con un ingrandimento di 200x-400x. Conta l'intero campo di 25 gruppi di 16 piccoli quadrati in tutti i piani.
    3. Moltiplicare il numero contato per il fattore di diluizione (se presente) e 5 × 104 per ottenere cellule·mL−1 di coltura originale.

3. Induzione del fago di B. burgdorferi φBB-1

NOTA: Sterilizzare tutti i bicchieri e le materie plastiche in autoclave; sterilizzare tutte le soluzioni mediante autoclave o filtrazione attraverso un filtro da 0,22 μM. I passaggi seguenti sono presentati in base a volumi di 15 ml, ma il metodo è scalabile a volumi più piccoli o più grandi a seconda delle esigenze individuali dell'esperimento.

  1. Per la coltura di B. burgdorferi da cui sarà prodotto il fago (il donatore), utilizzare la concentrazione calcolata con uno dei due metodi nella fase 2 per determinare il volume di coltura starter necessario per produrre 4 ml di 2 × 108 spirochette·mL−1. Ciò produrrà una concentrazione finale di 5 × 107 spirochete·mL−1 in 15 mL durante la fase di recupero (fase 3.6 sotto).
  2. Centrifugare il volume di coltura calcolato al punto 3.1 a 6.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 4 mL di BSK fresco. Trasferire il campione nel tubo sterile più piccolo disponibile per contenere il campione con uno spazio minimo sulla testa.
  3. Aggiungere la quantità appropriata di agente induttore alla concentrazione raccomandata (Tabella 3) sulla base di un volume di coltura di 4 mL per indurre la produzione di fagi. Tappare bene il tubo e mescolare accuratamente.
  4. Incubare il campione a 33 °C per 2-4 ore.
  5. Dopo l'incubazione, trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare il campione a 6.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante.
  6. Risospendere il pellet cellulare in 15 ml di 1x BSK.
    NOTA: Dopo l'induzione del fago, ci sono due modi diversi per procedere con il saggio di trasduzione. Questi metodi sono presentati nella Figura 1 e nei passaggi 4 e 6.

4. Trasduzione durante la co-coltura in seguito all'esposizione della donatrice all'agente induttore (Figura 1A)

NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato solo quando il ceppo fagico produttore (donatore) ha resistenza a un particolare antibiotico e il ceppo da trasdurre (ricevente) ha resistenza ad un altro antibiotico.

  1. Preparare una coltura di B. burgdorferi da utilizzare come ricevente nei saggi di trasduzione, come descritto per il ceppo donatore nella fase 1 sopra. Sulla base della densità determinata come nella fase 2, calcolare il volume necessario per produrre 15 ml di 1 × 107 spirochette·mL−1.
  2. Centrifugare il volume di coltura calcolato al punto 4.1 a 6.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante.
  3. Risospendere il pellet in 1 mL di coltura dalla fase 3.6 (donatore fagico risospeso). Aggiungere nuovamente il ricevente risospeso nella coltura con il donatore. Non integrare con antibiotici. Il volume totale contenente entrambe le colture è di 15 ml.
  4. Incubare a 33 °C per 72-96 h.
  5. Eseguire la selezione dei trasduttori mediante placcatura in fase solida dopo co-coltura come descritto nella fase 7.

5. Precipitazione di polietilenglicole (PEG) per recuperare il fago da utilizzare nel saggio di trasduzione

NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato nei casi in cui il ceppo produttore di fagi (donatore) ha resistenza a un particolare antibiotico e il ceppo da trasdurre (ricevente) non ha resistenza agli antibiotici o resistenza ad un altro antibiotico.

  1. Integrare la coltura dal punto 3.6 con l'antibiotico appropriato alla concentrazione indicata nella Tabella 2. Incubare il campione a 33 °C per 72-96 h.
  2. Preparare le soluzioni per la precipitazione PEG.
    1. Preparare 500 ml di 5 m di NaCl. Sterilizzare in autoclave e lasciare raffreddare prima dell'uso. Conservare a temperatura ambiente.
    2. Preparare 500 ml di PEG al 40% sciogliendo 200 g di PEG8000 in 400 ml di acqua; Riscaldare delicatamente mescolando fino a quando la soluzione è ben miscelata. Portare il volume fino a 500 ml con acqua. Per sciogliere completamente il PEG8000 e sterilizzare la soluzione, autoclavare la soluzione e raffreddarla prima dell'uso. Conservare a temperatura ambiente.
    3. Preparare 100 mL di mezzo di sospensione (SM; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4 e 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]). Sterilizzare in autoclave. Conservare a 4 °C.
  3. Per la precipitazione PEG del fago del clone del donatore B. burgdorferi (dal punto 3.6), dopo 72-96 ore di incubazione, centrifugare i campioni a 8.000 x g per 20 minuti a 4 °C.
  4. Decantare il surnatante in un tubo conico pulito da 50 ml; Smaltire il pellet cellulare. Aggiungere 5 M NaCl ad una concentrazione finale di 1 M. Mescolare bene. Oscillare delicatamente a temperatura ambiente per 1 ora.
  5. Centrifugare i campioni a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante in un tubo conico pulito da 50 ml; Il pellet potrebbe essere piccolo o assente. Aggiungere la soluzione di PEG8000 al 40% al surnatante fino a una concentrazione finale del 10%. Mescolare bene e mettere in ghiaccio per più di 1 ora fino a tutta la notte.
    NOTA: Tempi più lunghi non sembrano essere correlati con un aumento significativo del recupero dei fagi.
  6. Centrifugare i campioni a 8.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e rimuovere quanto più liquido in eccesso possibile senza perdere alcun pellet, che contiene le particelle fagiche.
  7. Risospendere il pellet in un volume minimo di SM, utilizzando l'SM per lavare il lato della bottiglia e raccogliere eventuali particelle fagiche. Il rapporto raccomandato è di 400 μL di SM per 10 mL di surnatante originale, ma a seconda delle dimensioni del pellet, può essere necessario più o meno SM per la completa risospensione.
  8. Trattare il campione di fago recuperato con un volume uguale di cloroformio in base al volume di risospensione. Mescolare bene il campione e quindi centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti. Rimuovere lo strato acquoso (superiore) in un tubo pulito, evitando qualsiasi strato di interfaccia spesso.
    NOTA: φBB-1 è un batteriofago senza involucro e non è suscettibile al trattamento con cloroformio25. Questo passaggio viene eseguito per interrompere ulteriormente qualsiasi struttura legata alla membrana (cioè cellule o bleb) e per uccidere qualsiasi potenziale contaminante cellulare. Il cloroformio è un elemento organico volatile e deve essere utilizzato solo in una cappa aspirante ben ventilata; Eliminare il materiale contenente cloroformio come rifiuto organico.
  9. Determinare il volume recuperato dopo il primo trattamento con cloroformio e trattare nuovamente il campione con una quantità di cloroformio pari al 10% di tale volume. Mescolare bene e centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti. Rimuovere lo strato acquoso (superiore), facendo attenzione a evitare qualsiasi interfaccia o strato organico. Trasferire lo strato acquoso in un tubo pulito.
  10. Utilizzare immediatamente il fago (come descritto al punto 6) o conservare a 4 °C.
    NOTA: Il congelamento dei campioni di fago φBB-1 non è raccomandato. Sebbene la stabilità di φBB-1 a 4 °C non sia stata rigorosamente studiata, i campioni conservati a 4 °C fino a 1 mese dopo il recupero sono stati utilizzati con successo nei saggi di trasduzione.

6. Saggio di trasduzione dopo precipitazione PEG di φBB-1 (Figura 1B)

  1. Preparare colture di B. burgdorferi da utilizzare come ricevente nei saggi di trasduzione, come descritto per il ceppo donatore nella fase 1 sopra. Sulla base della densità determinata come nella fase 2, calcolare il volume di coltura del ricevente necessario per produrre 15 ml di 1 × 107 spirochete·mL−1.
  2. Centrifugare il volume di coltura calcolato al punto 6.1 a 6.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 14,5 mL di BSK fresco.
  3. Aggiungere ≤500 μL di campione di fago precipitato con PEG (dalla fase 5) alla coltura del clone ricevente. Mescolare bene e incubare a 33 °C per 72-96 h.
    NOTA: La quantità di fago recuperata durante le precipitazioni PEG può essere variabile, a seconda di una serie di fattori. Tuttavia, da 15 mL di coltura indotta di B. burgdorferi ceppo CA-11.2A, 500 μL contengono tipicamente 50-1.000 fagi vitali28. Volumi di recupero fagico ≥500 μL influenzano negativamente la crescita di B. burgdorferi , probabilmente a causa dell'aumento del rapporto tra SM e BSK.
  4. Eseguire la selezione dei trasduttori mediante placcatura in fase solida dopo miscelazione con fago precipitato con PEG come descritto al punto 7.

7. Selezione dei trasduttori

NOTA: La placcatura in fase solida di potenziali trasduttori viene eseguita utilizzando una modifica a strato singolo del protocollo descritto per la prima volta da Samuels15. Le colonie di B. burgdorferi crescono all'interno dell'agar, quindi per la selezione dei trasduttori mediante placcatura in fase solida, i campioni devono essere aggiunti al mezzo mentre le piastre vengono versate. Un metodo alternativo per la selezione dei trasformanti utilizzando un metodo di diluizione in piastre a 96 pozzetti è stato descritto in precedenza35. Questa tecnica potrebbe anche essere efficace per la selezione dei trasduttori ma non è ancora stata provata per questo scopo.

  1. Determinare il numero di piastre necessarie per la selezione dei trasduttori in base al numero di campioni dei saggi di trasduzione e dei controlli da placcare.
    NOTA: In genere, vengono versate due piastre per campione, una equivalente a circa il 10% del volume della coltura e una che include il resto della coltura. Inoltre, versare piastre che fungono da controlli negativi per verificare individualmente che la preparazione fagica e / o i cloni genitori utilizzati come donatore e ricevente non crescano in presenza degli antibiotici utilizzati durante la selezione. Si consiglia inoltre di preparare il materiale di placcatura per almeno due piastre extra. Ad esempio, se il numero di campioni e controlli da placcare è otto, preparare una miscela di placcatura sufficiente per 10 piastre.
  2. Preparare le soluzioni per la placcatura come descritto di seguito.
    NOTA: Ogni piastra sarà di 30 ml, composta da 20 ml di 1,5x BSK per la placcatura e 10 ml di agarosio al 2,1% (rapporto 2:1). Questo produrrà una piastra con concentrazioni finali di 1x BSK e 0,7% di agarosio. Ad esempio, per 10 piastre, preparare una miscela galvanica totale di 300 ml, composta da 200 ml di 1,5x BSK e 100 ml di agarosio al 2,1%.
    1. Preparare 1 L di 1,5x BSK come descritto per 1x BSK al punto 1.1 utilizzando le quantità di ciascun componente elencate per 1,5x BSK nella Tabella 1. Conservare come descritto per 1x BSK.
    2. Preparare il 2,1% di agarosio in acqua e autoclave. Utilizzare la soluzione di agarosio fresco o conservare a temperatura ambiente. Se conservato a temperatura ambiente, microonde con il coperchio liberamente fino a completa fusione prima della placcatura.
    3. Determinare il volume di antibiotici necessari per raggiungere la concentrazione appropriata (Tabella 2) in base all'intera miscela galvanica.
      NOTA: Se il volume totale della soluzione galvanica finale è di 300 ml, mescolare 200 mL di 1,5x BSK e abbastanza antibiotico per assicurarsi che l'intero 300 mL abbia la corretta concentrazione finale di antibiotico. Se sia il donatore che il ricevente nel test di trasduzione hanno geni di resistenza agli antibiotici diversi, la miscela galvanica deve contenere entrambi gli antibiotici. Se il fago precipitato PEG dal donatore (come preparato nella fase 5) codifica un marcatore di resistenza agli antibiotici e il ricevente non ne ha, la miscela galvanica deve contenere solo un antibiotico.
  3. In base al numero di piastre da versare, trasferire la quantità appropriata di 1,5 volte BSK e antibiotici in un flacone sterile abbastanza grande da contenere l'intera miscela galvanica. Equilibrare a bagnomaria a 56 °C per ≥15 min.
  4. Equilibrare l'agarosio fuso dall'autoclave o dal microonde a bagnomaria a 56 °C per ≥15 min.
  5. Dopo l'equilibratura, aggiungere la quantità determinata di 2,1% di agarosio al flacone con BSK 1,5x (con antibiotico) e rimettere la soluzione galvanica a bagnomaria a 42 °C per 10-15 minuti.
    NOTA: temperature più elevate possono danneggiare o uccidere le spirochete36. Se si utilizza lo stesso bagnomaria di cui sopra, raffreddare il bagno d'acqua a 42-45 °C prima di avviare il timer per l'equilibratura. Non lasciare che la soluzione galvanica si integri a 42 °C per più di 20 minuti o inizierà a solidificare mentre si versano le piastre.
  6. Durante l'equilibratura, preparare i campioni di B. burgdorferi da placcare. Trasferire la quantità da placcare in una provetta conica sterile da 50 mL (vedere Tabella dei materiali).
    1. Se si placca una quantità inferiore a 1,5 ml (<5% del volume finale della piastra di 30 ml), trasferire il campione nella nuova provetta e aggiungere la miscela galvanica direttamente al campione durante la placcatura.
    2. Per volumi maggiori, trasferire il volume desiderato di coltura nella nuova provetta e quindi centrifugare a 6.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Decantare tutti tranne 100-500 μL del surnatante e utilizzare il resto per risospendere completamente il pellet prima della placcatura.
    3. Per le piastre di controllo dopo co-coltura, aggiungere ≥107 cellule dei cloni donatori o riceventi alle provette coniche sterili da 50 mL. Se il volume è superiore a 1,5 ml, centrifugare e risospendere il pellet come al punto 7.6.2. Se è stato eseguito un test di trasduzione utilizzando il fago precipitato con PEG, oltre al clone ricevente, aggiungere 100-250 μL del campione fagico in un tubo conico sterile da 50 mL per la placcatura.
  7. Dopo che la soluzione galvanica si è equilibrata a 42-45 °C per 10-15 minuti, trasferire 30 mL della soluzione galvanica in un tubo con il campione appropriato; Erogare immediatamente la miscela galvanica e prelevare il campione in una piastra etichettata. Ripetere con una nuova pipetta per ogni campione da placcare.
  8. Lasciare solidificare le piastre per 15-20 minuti e poi metterle in un incubatore a 33 °C integrato con il 5% di CO2. Non capovolgere le piastre per almeno 48 ore dopo essere state versate.
  9. A seconda del background del clone ricevente, controllare che le colonie appaiano all'interno dell'agarosio sulle piastre di selezione dopo 10-21 giorni di incubazione. Prelevare almeno 5-10 colonie che crescono sulla piastra in presenza di entrambi gli antibiotici usando una pipetta sterilizzata in cotone 5,75 in borosilicato (vedi Tabella dei materiali) e inocularle in 1,5 ml di 1x BSK con l'antibiotico o gli antibiotici appropriati.
  10. Coltivare le colonie inoculate a 33 °C come nella fase 1.3 per 3-5 giorni o fino a raggiungere una densità di circa 20-40 spirochete per campo con ingrandimento 200x utilizzando la microscopia in campo oscuro.
    NOTA: Una volta sottoposte a screening (vedere punto 8), le spirochete possono essere congelate per la conservazione a lungo termine a -80 °C mescolando un uguale volume di coltura con una miscela di glicerolo al 60% e 1x BSK al 40% sterilizzata mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,22 μm.

8. Verifica dei potenziali trasduttori

NOTA: Esaminare i cloni che crescono su piastre in presenza di due antibiotici per verificare che rappresentino veri trasduttori nello sfondo previsto (ricevente). Questi metodi si basano sull'amplificazione, e potenzialmente sul sequenziamento, di regioni specifiche mediante la reazione a catena della polimerasi. Protocolli dettagliati e pratiche di esecuzione della PCR in B. burgdorferi sono descritti altrove (per un esempio recente, vedi Seshu et al.37). Selezionare i primer utilizzati per vagliare i trasduttori in base ai ceppi utilizzati. Alcuni suggerimenti su come affrontare lo screening dei trasduttori sono descritti di seguito.

  1. Preparare i lisati di B. burgdorferi per lo screening PCR.
    NOTA: Il seguente protocollo viene utilizzato per produrre lisati di B. burgdorferi lavati da cellule in coltura coltivate come nella fase 7.9 per l'analisi immediata del DNA mediante PCR. Questo metodo è progettato per ridurre al minimo l'interferenza di potenziali inibitori nella BSK, ma non è raccomandato per la produzione di DNA di alta qualità per il sequenziamento o la conservazione. A tale scopo, utilizzare un protocollo o un kit per l'estrazione totale del genoma (vedi Tabella dei materiali). Si raccomanda vivamente di preparare contemporaneamente anche i lisati dei cloni progenitori (ceppi sia donatori che riceventi) da includere in ciascuna analisi.
    1. Trasferire 500 μL di ciascun potenziale trasduttore selezionato e coltivato come al punto 7.10 in una provetta di microcentrifuga pulita.
    2. Centrifugare le colture per 10 minuti a 8.000 x g a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet in 500 μL di TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). Centrifugare per 5 minuti a 8.000 x g a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet in 50 μL di acqua di qualità PCR. Far bollire i campioni per 10 minuti. Lasciarli raffreddare brevemente, quindi centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    5. Per ogni PCR, utilizzare immediatamente 2 μL dalla parte superiore del campione centrifugato; Evitare di disturbare il pellet.
  2. Esaminare i potenziali trasduttori per i geni specifici che codificano la resistenza agli antibiotici mediante PCR. Vedere la Tabella 4 per i primer per lo screening dei marcatori di resistenza agli antibiotici comunemente usati nei saggi di trasduzione.
    NOTA: Sebbene rara nella nostra esperienza, può verificarsi una mutazione spontanea degli antibiotici aminoglicosidi utilizzati per la selezione del DNA eterologo in B. burgdorferi.
  3. Schermare i potenziali trasduttori utilizzando anche un altro ceppo o marcatore clone per confermare che lo sfondo è quello del ricevente. Includere in queste analisi sia il clone genitore donatore che quello genitore ricevente. Screening dei marcatori specifici del ceppo utilizzando sequenze basate sui ceppi utilizzati e sui singoli protocolli di laboratorio per determinare l'integrità del ceppo.
  4. Se si tenta di trasdursi in cloni virulenti da utilizzare all'interno del vettore zecca o dell'ospite di mammifero o per il confronto diretto con un altro clone, determinare il contenuto plasmidico completo dei trasduttori e dei cloni genitori. Ciò avviene per garantire lo stesso contenuto plasmidico del ceppo comparativo o la presenza degli elementi genetici necessari per la propagazione all'interno del ciclo enzootico, come descritto altrove 18,19,37,38,39.

Risultati

L'uso del batteriofago per spostare il DNA tra ceppi di B. burgdorferi più facilmente trasformabili o cloni che sono recalcitranti all'elettrotrasformazione rappresenta un altro strumento per la continua indagine molecolare dei determinanti della malattia di Lyme. Il saggio di trasduzione qui descritto può essere modificato secondo necessità per facilitare il movimento del DNA tra eventuali cloni di interesse utilizzando uno o due antibiotici per la selezione di potenziali trasduttori. La trasduzione sia del ...

Discussione

L'uso della trasduzione potrebbe rappresentare un metodo per superare almeno alcune delle barriere biologiche e tecniche associate all'elettrotrasformazione di B. burgdorferi 1,4,13,37. In molti sistemi, il batteriofago può spostare il DNA dell'ospite (non profago) tra le cellule batteriche mediante trasduzione generalizzata o specializzata 22,23,24,49,50....

Divulgazioni

L'autore non ha nulla da rivelare.

Riconoscimenti

L'autore desidera ringraziare Shawna Reed, D. Scott Samuels e Patrick Secor per la loro utile discussione e Vareeon (Pam) Chonweerawong per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Scienze Biomediche e dalle borse di ricerca della facoltà a Christian H. Eggers della School of Health Sciences della Quinnipiac University.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)Millipore SigmaS2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)USA Scientific1450-0810holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)Millipore SigmaCAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)Thermo Fisher Scientific13-678-8Aautoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LEDot Scientific inc.AGLE-500
Bacto NeopeptoneGibcoDF0119-17-9
Bacto TC YeastolateGibco255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)Gemini Bio-Products700-104P
Chloroform (for molecular biology)Thermo Fisher ScientificBP1145-1CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)US BiologicalC5900-01cell culture grade
ErythromycinResearch Products International CorpE57000-25.0
Gentamicin reagent solutionGibco15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)Thermo Fisher ScientificBP350-500
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-500
Kanamycin sulfateThermo Fisher Scientific25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)Millipore SigmaSLGSM33SSto filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin CThermo Fisher ScientificBP25312CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamineMP Biomedicals, LLC100068
Oligonucleotides (primers for PCR)IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)G Biosciences786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)Thermo Fisher ScientificFB0875712
Petroff-Hausser counting chamberHausser scientificHS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glassHausser scientificHS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)Thermo Fisher ScientificBP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)Pel-Freez Biologicals31119-3heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettesUSA Scientific9750-9150
Sodium bicarbonateThermo Fisher ScientificBP328-500
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificBP358-1
Sodium pyruvateMillipore SigmaP8674-25G
Spectronic Genesys 5Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solutionMillipore SigmaS6501-50G
Trisodium citrate dihydrateMillipore SigmaS1804-500Gsodium citrate for BSK

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