라임병 스피로체테 보렐리아 부르그도르페리의 파지 매개 유전자 조작

요약

박테리아 세포 사이에서 DNA를 이동하는 박테리오파지의 능력은 박테리아 숙주의 유전자 조작에 효과적인 도구입니다. 여기에 제시된 것은 보렐리아 부르그도르페리의 박테리오파지인 φBB-1을 유도, 회수 및 사용하여 라임병 스피로체의 다른 균주 사이에서 이종 DNA를 형질도입하는 방법론입니다.

초록

스피로체테 Borrelia burgdorferi 에 외래 DNA를 도입하는 것은 거의 전적으로 전기 천공을 사용한 형질전환에 의해 이루어졌습니다. 이 과정은 라임 병 스피로 체에서 다른 더 잘 특성화 된 그람 음성 박테리아에 비해 효율성이 현저히 낮습니다. 형질전환의 성공률은 특정 배경에서 농축된 양의 고품질 DNA에 크게 의존하며 상당한 변형 간 변동성을 갖습니다. 외래 DNA (즉, 셔틀 벡터, 형광 리포터 및 항생제 내성 마커)를 B. burgdorferi 에 도입하기위한 대체 수단은 라임 병 스피로 체의 유전자 조작을위한 유용한 도구의 군비에 중요한 추가 물이 될 수 있습니다. 박테리오파지는 형질 도입이라는 과정에서 박테리아 사이에서 DNA를 이동시키는 자연적인 메커니즘으로 잘 알려져 있습니다. 이 연구에서는 유비쿼터스 보렐 리알 파지 φBB-1을 사용하여 동일하고 다른 유전 적 배경을 가진 B. burgdorferi 세포 사이에서 DNA를 형질 도입하는 방법이 개발되었습니다. 형질도입된 DNA는 보렐리알 DNA와 작은 셔틀 벡터 형태의 이종 DNA를 모두 포함한다. 이 시연은 라임 병 스피로 체의 유전자 조작을위한 전기 천공을 보완하기 위해 파지 매개 형질 도입의 잠재적 인 사용을 시사한다. 이 보고서는 B. burgdorferi로부터 파지 φBB-1의 유도 및 정제, 형질 도입 분석에서이 파지의 사용 및 잠재적 형질 도입체의 선택 및 스크리닝을 위한 방법을 설명합니다.

서문

스피로 체탈 박테리아 Borrelia burgdorferi의 유전자 조작을위한 도구의 개발은 라임 병 1,2,3,4의 본질에 대한 이해에 헤매랄 수없는 가치를 더했습니다. B. burgdorferi는 작은 선형 염색체와 선형 및 원형 플라스미드 ^5,6으로 구성된 비정상적으로 복잡한 게놈을 가지고 있습니다. 자발적인 플라스미드 손실, 유전자 내 재배열 (동일한 유기체 내에서 한 플라스미드에서 다른 플라스미드로의 유전자 이동) 및 수평 유전자 전달 (HGT, 두 유기체 간의 DNA 이동)은 B. burgdorferi 사이에 어지러운 양의 유전 적 이질성을 야기했습니다 (예를 들어, Schutzer et ^al.7 참조). 생성된 유전자형(또는 "균주")은 모두 동일한 종의 구성원이지만 다른 포유류 숙주 8,9,10,11로 전달하고 감염시키는 능력에 영향을 미치는 유전적 차이를 갖는다. 이 보고서에서 "균주"라는 용어는 자연적으로 파생 된 특정 유전 적 배경을 가진 B. burgdorferi를 지칭하는 데 사용됩니다. 용어 "클론"은 특정 목적을 위해 또는 실험적 조작의 결과로서 유전적으로 변형된 균주를 지칭하기 위해 사용될 것이다.

B. burgdorferi에서 사용할 수 있는 분자 도구 상자에는 선택 가능한 마커, 유전자 리포터, 셔틀 벡터, 트랜스포존 돌연변이 유발, 유도성 프로모터 및 역선택 마커가 포함됩니다(검토를 위해 Drektrah 및 Samuels¹² 참조). 이러한 방법론을 효과적으로 사용하려면 B. burgdorferi 관심 균주에 이종 (외래) DNA를 인위적으로 도입해야합니다. B. burgdorferi에서 이종 DNA의 도입은 거의 전적으로 전기 천공을 통해 이루어지며, 이는 전기 펄스를 사용하여 박테리아 막을 매체에 도입 된 작은 DNA 조각에 일시적으로 투과 할 수있게하는 방법입니다¹. 대부분의 세포(≥99.5%로 추정됨)는 펄스에 의해 사멸되지만, 나머지 세포는 이종성 DNA¹³을 보유하는 높은 빈도를 갖는다. DNA를 박테리아에 도입하는 가장 효율적인 방법 중 하나로 간주되지만 B. burgdorferi로의 전기 천공 빈도는 매우 낮습니다 (5 × 10⁴에서 5 × 10⁶ 세포에 1 형질 전환체에 이르기까지)¹³. 더 높은 주파수 변형을 달성하는 데 방해가되는 장벽은 기술적 인 것과 생물학적인 것 같습니다. B. burgdorferi의 성공적인 전기 천공에 대한 기술적 장벽에는 필요한 DNA (>10 μg)의 양과 스피로 체가 정확히 올바른 성장 단계 (중간 로그, 2 × 10 7 세포 · mL-1 및 7 × 10⁷ 세포 · ^mL-1)에 있어야한다는 요구 사항이 포함됩니다 전기 적격 세포^12,13. 그러나 이러한 기술적 장벽은 생물학적 장벽보다 극복하기가 더 쉬울 수 있습니다.

라임병 연구자들은 B. burgdorferi 클론이 유전적으로 조작될 수 있는 능력과 관련하여 크게 두 가지 범주로 나눌 수 있음을 인식합니다^13,14. 높은 통과, 실험실 적응 분리 물은 종종 쉽게 변형되지만 일반적으로 감염성에 필수적인 플라스미드를 잃고 생리 학적으로 비정상적인 방식으로 행동하며 포유류 숙주를 감염시킬 수 없거나 진드기 벡터^12,13 내에서 지속될 수 없습니다. 이 클론은 실험실 내에서 스피로체의 분자 생물학을 해부하는 데 유용했지만 동물주기의 생물학적 맥락에서 스피로 체를 연구하는 데는 거의 가치가 없습니다. 반면에 저계대 감염성 분리는 감염 상태를 반영하는 생리학적 방식으로 행동하고 감염 주기를 완료할 수 있지만 일반적으로 이종 DNA의 도입에 저항하므로 연구^12,13에서 조작하기 어렵습니다. 저-계대 분리물을 형질전환시키는 어려움은 적어도 두 가지 상이한 요인과 관련된다: (i) 저-통로 분리물은 특히 전기천공에 요구되는 고밀도 조건 하에서 종종 서로 단단히 응집되어, 따라서 많은 세포가 전하의 완전한 인가 또는 배지 내의 DNA에 접근하는 것을 차단한다(^{13, 15}); (ii) B. burgdorferi는 고-통로 분리물(^14,16)에서 손실될 수 있는 적어도 2개의 상이한 플라스미드 매개 제한-변형(R-M) 시스템을 암호화한다. R-M 시스템은 박테리아가 외부 DNA¹⁷을 인식하고 제거 할 수 있도록 진화했습니다. 실제로 B. burgdorferi에 대한 여러 연구에 따르면 DNA의 출처가 대장균이 아닌 B. burgdorferi 일 때 형질 전환 효율이 증가합니다 ^13,16. 불행히도 B. burgdorferi로부터 전기 천공에 필요한 고농도의 DNA를 얻는 것은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 전망입니다. 저-계대 분리물을 전기천공 및 선택할 때 또 다른 잠재적인 우려는 이 공정이 임계 병독성 관련 플라스미드 lp25^14,18,19; 따라서, 전기천공을 통해 저계대 B. burgdorferi 분리물을 유전적으로 조작하는 바로 그 행위는 동물성 주기²⁰ 내에서 생물학적으로 관련된 분석에 적합하지 않은 클론을 선택할 수 있다. 이러한 문제를 감안할 때, 이종 DNA가 높은 통로의 B. burgdorferi 클론으로 전기 변환 된 다음 전기 천공 이외의 방법으로 저 통로 감염 분리로 전달 될 수있는 시스템은 라임 병 스피로 체에 사용할 수있는 분자 도구의 증가하는 컬렉션에 환영할만한 추가 사항이 될 수 있습니다.

형질전환(알몸 DNA의 흡수) 이외에, 박테리아가 규칙적으로 이종 DNA를 흡수하는 두 가지 다른 메커니즘이 있다: 서로 직접 물리적으로 접촉하는 박테리아 사이의 DNA 교환인 접합과 박테리오파지(²¹)에 의해 매개되는 DNA의 교환인 형질도입. 실제로, HGT를 매개하는 박테리오파지의 능력은 다수의 박테리아 시스템 내에서 분자 과정을 해부하기 위한 실험 도구로서 사용되어 왔다(^22,23,24). B. burgdorferi는 네이키드 DNA의 흡수에 자연적으로 유능하지 않으며 B. burgdorferi가 성공적인 접합을 촉진하는 데 필요한 장치를 암호화한다는 증거는 거의 없습니다. 그러나 이전 보고서에서는 B. burgdorferi^25,26,27,28의 온대 박테리오파지 인 φBB-1의 식별 및 예비 특성화를 설명했습니다. φBB-1은 B. burgdorferi²⁵ 내에서 발견되는 30kb 플라스미드 계열을 패키징합니다. 이 제품군의 구성원은 CP32로 지정되었습니다. B. burgdorferi 균주 중 HGT에 참여하는 φBB-1의 역할과 일치하여, Stevenson et al. 그렇지 않으면 이질적인 cp32를 가진 두 균주에서 동일한 cp32가 발견되었다고 보고했으며, 이는 형질도입²⁹를 통해 이 두 균주 사이에서 이 cp32의 최근 공유를 시사합니다. 또한 상대적으로 안정적인 게놈^30,31,32,33에서 cp32 중 HGT를 통한 상당한 재조합의 증거가 있습니다. 마지막으로, 동일한 균주의 세포 사이 및 2개의 상이한 균주의 세포 사이에서 cp32s 및 이종 셔틀 벡터 DNA 둘 다를 형질도입하는 φBB-1의 능력은 이전에 입증되었다^27,28. 이러한 발견을 감안할 때, φBB-1은 B. burgdorferi의 분자 생물학의 해부를 위해 개발 될 또 다른 도구로 제안되었습니다.

이 보고서의 목적은 B. burgdorferi로부터 파지 φBB-1을 유도 및 정제하는 방법을 자세히 설명하고 B. burgdorferi 클론 간의 형질도입 분석을 수행하고 잠재적 형질도입체를 선택 및 스크리닝하기 위한 프로토콜을 제공하는 것입니다.

프로토콜

재조합 DNA 및 BSL-2 유기체를 사용한 모든 실험은 퀴니피악 대학 기관 생물안전 위원회에서 검토 및 승인되었습니다.

1. φBB-1 생산을 위한 B. 부르그도르페리 배양물의 제조

1. 6.6% 열 불활성화 일반 토끼 혈청(BSK)¹⁵이 보충된 바버-스토너-켈리 배지를 준비합니다. 1x BSK 1L의 경우 표 1 에 나열된 성분을 물 900mL에 혼합하고 1N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.6으로 조정한 다음 4°C에서 2-4시간 동안 천천히 혼합합니다. 혼합이 완료되면 필요한 경우 pH를 확인하고 7.6으로 다시 조정하고 물로 부피를 1L로 늘립니다. 0.22μM 필터( 재료 표 참조)를 통과하여 배지를 멸균하고 신선하게 사용하거나 4°C에서 ≤2개월 동안 보관하십시오.
2. 형질도입 프로토콜을 시작하기 3-5일 전에 150μL의 적절한 B. burgdorferi 클론을 단단히 캡핑된 멸균 원추형 원심분리 튜브의 1x BSK 15mL에 접종합니다( 재료 표 참조). B. burgdorferi 클론 내에서 이종 DNA의 선택 및 유지를 위해 적절한 농도의 항생제 또는 항생제 조합으로 배지를 보충합니다(표 2).
   참고: B. 부르그도르페리는 생물안전 레벨 2 유기체입니다. 이 유기체와 함께 작업하는 동안 모든 적절한 예방 조치를 취하십시오. 인증되고 적절하게 소독 된 클래스 II 생물 안전 캐비닛에서 B. burgdorferi의 살아있는 배양 물로 모든 작업을 수행하십시오. CDC 지침³⁴에 따라 B. burgdorferi 및 유기체 자체와 접촉하는 모든 물질을 적절하게 폐기하십시오.
3. 배양물이 ≥5 × 10⁷ 스피로체·mL-1의 밀도에 도달할 때까지 흔들지 않고 33°C에서 배양하며, 이는 약 ^3-5일이 걸립니다.

2. B. 부르그도르페리 문화의 밀도 결정(Samuels에서 수정됨)¹⁵

1. 5 × 10⁶ cells·^mL-1 이상일 것으로 예상되는 밀도의 경우 분광학을 사용하여 세포 밀도를 결정합니다.
   1. 1mL의 배양액을 1.7mL 미세 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 8,000 x g 로 원심분리합니다.
   2. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 1 mL의 인산염 완충 식염수 (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 및 1.8 mM KH2PO4)에 재현탁시킨다. 전체 세포 현탁액을 세미 마이크로 UV 투명 큐벳으로 옮깁니다.
   3. 파장 600nm(A₆₀₀)에서 재현탁된 샘플의 광학 밀도를 결정합니다. 분광 광도계( 재료 표 참조)를 PBS에 대해 영점으로 설정합니다.
   4. 원래 배양에서 스피로체·^mL-1 의 농도를 계산하려면 A₆₀₀ 의 광학 밀도에 1.4 × 10⁹를 곱합니다.
2. 5 × 10⁴ 셀·^mL-1 과 5 × 10⁶ 셀·mL-1 사이로 예상되는 밀도의 경우 ^{Petroff-Hausser} 계수 챔버( 재료 표 참조)를 사용하여 셀 밀도를 결정하여 스피로체의 수를 직접 계산합니다. 이 방법은 적절한 희석 후 더 높은 밀도에도 사용할 수 있습니다.
   참고: 살아있는 스피로체테스를 시각화하려면 암시야 콘덴서로 수정된 현미경이 필요합니다.
   1. 10μL의 샘플을 계수 챔버에 적용하고 적절한 커버 유리로 덮습니다. 1 × 10⁷보다 높은 밀도의 경우 샘플을 PBS로 희석하여 필드 당 50-100 개의 스피로 체트를 산출합니다.
   2. 암시야 현미경을 사용하여 200x-400x 배율로 세포를 계수합니다. 모든 평면에서 16 개의 작은 사각형으로 구성된 25 개 그룹의 전체 필드를 세십시오.
   3. 계산된 수에 희석 계수(있는 경우)와 5 × 10⁴ 를 곱하여 원래 배양의 세포·^mL-1 을 산출합니다.

3. B. 부르그도르페리 파지 φBB-1의 유도

알림: 모든 유리 제품과 플라스틱 제품을 오토클레이빙하여 소독하십시오. 0.22μM 필터를 통해 오토클레이브 또는 여과하여 모든 용액을 멸균합니다. 아래 단계는 15mL의 부피를 기준으로 제시되지만 이 방법은 실험의 개별 요구 사항에 따라 더 작거나 큰 부피로 확장할 수 있습니다.

1. 파지가 생산될 B. burgdorferi 배양물(공여자)의 경우 2단계에서 두 방법 중 하나로 계산된 농도를 사용하여 2 × 10^{8 스피} 로체트·^mL-1의 4mL를 생산하는 데 필요한 스타터 배양의 부피를 결정합니다. 이렇게 하면 회복 단계에서 15mL에서 5 × 10^{7 스피} 로체트·^mL-1 의 최종 농도가 생성됩니다(아래 단계 3.6).
2. 단계 3.1에서 계산된 배양량을 6,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 따라 내고 펠릿을 4mL의 신선한 BSK에 재현탁합니다. 최소한의 헤드 공간으로 샘플을 고정할 수 있는 가장 작은 멸균 튜브로 샘플을 옮깁니다.
3. 적절한 양의 유도제를 배양량 4mL 기준으로 권장농도(표 3)에 첨가하여 파지 생산을 유도한다. 튜브를 단단히 덮고 잘 섞으십시오.
4. 샘플을 33°C에서 2-4시간 동안 배양합니다.
5. 배양 후 샘플을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플을 6,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 따라 내십시오.
6. 세포 펠릿을 15mL의 1x BSK에 재현탁합니다.
   참고: 파지 유도 후, 형질도입 분석을 진행하는 두 가지 다른 방법이 있다. 이러한 방법은 그림 1 과 4단계 및 6단계에 나와 있습니다.

4. 유도제에 기증자를 노출시킨 후 공동 배양 중 형질 도입 (그림 1A)

참고: 이 프로토콜은 파지 생성 균주(공여자)가 특정 항생제에 내성이 있고 형질도입될 균주(수용자)가 다른 항생제에 내성이 있는 경우에만 사용할 수 있습니다.

1. 상기 단계 1에서 공여자 균주에 대해 설명된 바와 같이, 형질도입 분석에서 수용자로서 사용될 B. burgdorferi 배양물을 준비한다. 2단계에서 결정된 밀도를 기반으로 1 × 10^{7 스피} 로체트·^mL-1의 15mL를 산출하는 데 필요한 부피를 계산합니다.
2. 단계 4.1에서 계산된 배양량을 6,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 따라 내십시오.
3. 펠렛을 단계 3.6의 배양물 1mL에 재현탁합니다(재현탁된 파지 공여체). 재일시 중단된 수혜자를 기증자와 함께 문화권에 다시 추가합니다. 항생제를 보충하지 마십시오. 두 배양물을 모두 포함하는 총 부피는 15mL입니다.
4. 33 ° C에서 72-96 시간 동안 배양하십시오.
5. 단계 7에 설명된 대로 공동 배양 후 고체상 도금에 의한 형질전환체의 선택을 수행한다.

5. 형질도입 분석에 사용하기 위한 파지를 회수하기 위한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전

참고: 이 프로토콜은 파지 생성 균주(공여자)가 특정 항생제에 내성이 있고 형질도입될 균주(수용자)가 항생제 내성이 없거나 다른 항생제에 내성이 있는 경우에 사용할 수 있습니다.

1. 표 3.6에 표시된 농도의 적절한 항생제로 단계 2의 배양물을 보충하십시오. 샘플을 33°C에서 72-96시간 동안 배양합니다.
2. PEG 침전을위한 용액을 준비하십시오.
   1. 5M NaCl 500mL를 준비합니다. 오토클레이빙으로 소독하고 사용하기 전에 식히십시오. 실온에서 보관하십시오.
   2. 200g의 PEG8000을 400mL의 물에 용해시켜 500mL의 40% PEG를 제조하고; 용액이 잘 섞일 때까지 저으면서 부드럽게 가열합니다. 물과 함께 최대 500mL까지 가져옵니다. PEG8000을 완전히 용해시키고 용액을 멸균하려면 용액을 오토클레이브하고 사용하기 전에 식히십시오. 실온에서 보관하십시오.
   3. 100 mL의 현탁 배지 (SM; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4 및 50 mM Tris-HCl [pH 7.5])를 준비한다. 오토 클레이빙으로 소독하십시오. 4 °C에서 보관하십시오.
3. 공여체 B. burgdorferi 클론으로부터의 파지의 PEG 침전을 위해 (단계 3.6에서), 인큐베이션 72-96 h 후, 샘플을 4°C에서 20분 동안 8,000 x g 에서 원심분리한다.
4. 상청액을 깨끗한 50mL 원추형 튜브에 디캔트합니다. 셀 펠릿을 폐기하십시오. 최종 농도 1M에 5M NaCl을 추가합니다. 잘 섞는다. 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔듭니다.
5. 샘플을 8,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상청액을 깨끗한 50mL 원추형 튜브에 디캔트합니다. 펠릿이 작거나 없을 수 있습니다. 40% PEG8000 용액을 최종 농도 10%가 되도록 상청액에 첨가한다. 잘 섞어 얼음에 1시간 이상에서 밤새 둡니다.
   참고: 더 긴 시간은 파지 회수율이 크게 증가한 것과 상관관계가 없는 것 같습니다.
6. 샘플을 8,000 x g 에서 4°C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 파지 입자가 포함된 펠릿을 잃지 않고 가능한 한 많은 과잉 액체를 제거합니다.
7. SM을 사용하여 병의 측면을 씻어내고 잠재적인 파지 입자를 수집하기 위해 최소한의 SM에 펠릿을 재현탁합니다. 권장 비율은 원래 상청액 10mL당 SM 400μL이지만 펠릿의 크기에 따라 완전한 재현탁에 더 많거나 적은 SM이 필요할 수 있습니다.
8. 회수된 파지 샘플을 재현탁 부피를 기준으로 동일한 부피의 클로로포름으로 처리한다. 샘플을 잘 혼합한 다음 8,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 두꺼운 계면 층을 피하면서 깨끗한 튜브로 수성 (상단) 층을 제거하십시오.
   참고: φBB-1은 외피가 없는 박테리오파지이며 클로로포름 처리에 취약하지 않습니다(²⁵). 이 단계는 막 결합 구조 (즉, 세포 또는 블렙)를 추가로 파괴하고 잠재적 인 세포 오염 물질을 죽이기 위해 수행됩니다. 클로로포름은 휘발성 유기물이며 통풍이 잘되는 흄 후드에서만 사용해야합니다. 클로로포름을 함유 한 물질은 유기 폐기물로 폐기하십시오.
9. 첫 번째 클로로포름 처리 후 회수된 부피를 결정하고 해당 부피의 10%에 해당하는 양의 클로로포름으로 샘플을 다시 처리합니다. 잘 섞고 8,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 계면 또는 유기 층이 발생하지 않도록 주의하면서 수성(상단) 층을 제거합니다. 수성 층을 깨끗한 튜브로 옮깁니다.
10. 파지를 즉시(단계 6에 기재된 바와 같이) 사용하거나 4°C에서 보관한다.
    참고: φBB-1 파지 샘플의 동결은 권장되지 않습니다. 4 ° C에서 φBB-1의 안정성은 엄격하게 조사되지 않았지만 회수 후 최대 1 개월 동안 4 ° C에서 보관 된 샘플은 형질 도입 분석에 성공적으로 사용되었습니다.

6. φBB-1의 PEG 침전에 따른 형질도입 분석(그림 1B)

1. 위의 1단계에서 공여자균주에 대해 설명한 대로 형질도입 분석에서 수용자로 사용할 B. burgdorferi 배양물을 준비합니다. 2단계에서 결정된 밀도를 기반으로 1 × 10^{7 스} 피로체·^mL-1의 15mL를 산출하는 데 필요한 수용자의 배양량을 계산합니다.
2. 6.1단계에서 계산된 배양량을 6,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한다. 상청액을 따라 내고 펠릿을 14.5mL의 신선한 BSK에 재현탁시킵니다.
3. ≤500 μL의 PEG-침전 파지 샘플 (단계 5에서)을 수용자 클론의 배양물에 첨가한다. 잘 섞고 33 ° C에서 72-96 시간 동안 배양하십시오.
   참고: PEG 침전 동안 회수된 파지의 양은 여러 요인에 따라 가변적일 수 있습니다. 그러나, 유도된 B. 부르그도르페리 균주 CA-11.2A의 15 mL 배양물로부터, 500 μL는 전형적으로 50-1,000개의 생존 가능한 파지²⁸을 함유한다. 파지 회수 부피 ≥500 μL는 B. 부르그도르페리 성장에 부정적인 영향을 미치며, 이는 SM 대 BSK의 비율이 증가했기 때문일 수 있습니다.
4. 단계 7에 기재된 바와 같이 PEG 침강 파지와 혼합한 후 고체상 도금에 의한 형질도입체의 선택을 수행한다.

7. 형질도입제의 선택

참고: 잠재적 형질전환제의 고체상 도금은 Samuels¹⁵에 의해 처음 설명된 프로토콜의 단층 변형을 사용하여 수행됩니다. B. burgdorferi 콜로니는 한천 내에서 자라기 때문에 고체상 도금으로 형질 도입체를 선택하려면 플레이트를 붓는 동안 샘플을 매체에 추가해야합니다. 96-웰 플레이트에서 희석 방법을 사용하는 형질전환체의 선택을 위한 대안적인 방법도 이전에³⁵에 기술되었다. 이 기술은 또한 형질도입체의 선택에 효과적일 수 있지만 아직 이러한 목적으로 시도되지 않았습니다.

1. 형질도입 분석의 샘플 수와 도금할 대조군의 샘플 수를 기준으로 형질도입체를 선택하는 데 필요한 플레이트의 수를 결정합니다.
   참고: 일반적으로 샘플당 두 개의 플레이트가 부어지며, 하나는 배양 부피의 약 10%에 해당하고 다른 하나는 나머지 배양물을 포함합니다. 또한, 음성 대조군 역할을 하는 플레이트를 부어 기증자 및 수용자로서 사용된 파지 제제 및/또는 모 클론이 선택 중에 사용된 항생제(들)의 존재 하에서 성장하지 않는지 개별적으로 테스트한다. 적어도 두 개의 여분의 플레이트를위한 도금 재료를 준비하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 도금할 샘플 및 대조군의 수가 8개인 경우 플레이트 10개에 대해 충분한 도금 혼합물을 준비합니다.
2. 아래 설명 된대로 도금 용액을 준비하십시오.
   참고: 각 플레이트는 30mL이며 도금용 1.5x BSK 20mL와 2.1% 아가로오스(2:1 비율) 10mL로 구성됩니다. 이것은 최종 농도가 1x BSK 및 0.7 % 아가 로스인 플레이트를 생성합니다. 예를 들어, 10개의 플레이트에 대해, 200mL의 1.5x BSK 및 100mL의 2.1% 아가로스로 구성된 300mL의 총 도금 혼합물을 준비한다.
   1. 표 1.5x BSK에 대해 나열된 각 성분의 양을 사용하여 단계 1.1에서 1x BSK에 대해 설명된 대로 1.5x BSK 1L를 준비합니다. 1x BSK에 대해 설명된 대로 보관하십시오.
   2. 물과 오토 클레이브에 2.1 % 아가 로스를 준비하십시오. 아가 로스 용액을 신선하게 사용하거나 실온에서 보관하십시오. 실온에서 보관하는 경우 플레이하기 전에 완전히 녹을 때까지 뚜껑을 느슨하게 덮고 전자레인지에 돌리십시오.
   3. 전체 도금 혼합물을 기준으로 적절한 농도(표 2)를 달성하는 데 필요한 항생제의 양을 결정합니다.
      참고: 최종 도금액의 총 부피가 300mL인 경우 전체 300mL가 올바른 최종 항생제 농도를 갖도록 1.5x BSK 200mL와 충분한 항생제를 혼합합니다. 형질도입 분석에서 기증자와 수혜자가 서로 다른 항생제 내성 유전자를 갖는 경우, 도금 혼합물은 두 항생제를 모두 포함해야 한다. 공여체로부터의 PEG 침전된 파지(단계 5에서 제조된 바와 같이)가 항생제 내성 마커를 인코딩하고 수용자가 아무 것도 갖지 않는 경우, 도금 혼합물은 하나의 항생제만을 함유해야 한다.
3. 부을 플레이트의 수에 따라 적절한 양의 1.5x BSK와 항생제를 전체 도금 혼합물을 담을 수 있을 만큼 충분히 큰 멸균 병에 옮깁니다. 56°C의 수조에서 ≥15분 동안 평형을 이룹니다.
4. 용융된 아가로스를 오토클레이브 또는 마이크로파로부터 56°C 수조에서 ≥15분 동안 평형화시킨다.
5. 평형 후, 결정된 양의 2.1% 아가로스를 1.5x BSK(항생제 포함)로 병에 첨가하고 도금액을 42°C의 수조에 10-15분 동안 다시 넣습니다.
   참고: 더 높은 온도는 스피로체테스(³⁶)를 손상시키거나 죽일 수 있다. 위와 동일한 수조를 사용하는 경우 평형 타이머를 시작하기 전에 수조를 42-45°C로 냉각하십시오. 도금액이 42°C에서 20분 이상 평형을 이루지 않도록 하지 않으면 플레이트를 붓는 동안 응고되기 시작합니다.
6. 평형화 동안, 도금할 B. 부르그도르페리 샘플을 준비한다. 플레이팅할 양을 멸균 50mL 원뿔형 원심분리 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조).
   1. 1.5mL(최종 30mL 플레이트 부피의 <5%) 미만의 양을 플레이팅하는 경우 샘플을 새 튜브로 옮기고 도금 중에 도금 혼합물을 샘플에 직접 추가합니다.
   2. 더 큰 부피의 경우 원하는 부피의 배양액을 새 튜브로 옮긴 다음 실온에서 10분 동안 6,000 x g 로 원심분리합니다. 상청액 100-500 μL를 제외한 모든 것을 따라 내고 나머지는 도금 전에 펠릿을 완전히 재현탁하는 데 사용합니다.
   3. 공동 배양 후 대조군 플레이트의 경우 공여자나 수용자 클론의 ≥10⁷ 개 세포를 멸균 50mL 원뿔형 원심분리 튜브에 추가합니다. 부피가 1.5mL를 초과하면 7.6.2단계와 같이 펠릿을 원심분리하고 재현탁합니다. PEG-침전된 파지를 사용하여 형질도입 분석을 수행한 경우, 수용자 클론에 더하여, 100-250 μL의 파지 샘플을 멸균된 50 mL 원뿔형 튜브에 첨가하여 플레이팅한다.
7. 도금액이 42-45°C에서 10-15분 동안 평형화된 후 30mL의 도금액을 적절한 샘플이 있는 튜브에 옮깁니다. 도금 혼합물과 샘플을 라벨이 붙은 플레이트에 즉시 분배하십시오. 도금할 각 샘플에 대해 새 피펫으로 반복합니다.
8. 플레이트가 15-20 분 동안 응고되도록 한 다음 33 % CO₂가 보충 된 5 ° C 인큐베이터에 넣습니다. 부은 후 최소 48시간 동안 접시를 뒤집지 마십시오.
9. 수용자 클론의 배경에 따라 배양 10-21 일 후에 콜로니가 선택 플레이트의 아가 로스 내에 나타나는지 확인하십시오. 붕규산 피펫(재료 표 참조)에 멸균된 면으로 막힌 5.75를 사용하여 두 항생제가 있는 상태에서 플레이트에서 자라는 최소 5-10개의 콜로니를 선택하고 적절한 항생제와 함께 1.5mL의 1x BSK에 접종합니다.
10. 접종된 콜로니를 단계 1.3에서와 같이 33°C에서 3-5일 동안 또는 암시야 현미경을 사용하여 200x 배율에서 필드당 약 20-40개의 스피로체트의 밀도에 도달할 때까지 성장시킵니다.
    참고: 일단 스크리닝되면(8단계 참조), 스피로체는 0.22μm 필터를 통한 여과에 의해 멸균된 60% 글리세롤 및 40% 1x BSK의 혼합물과 동일한 부피의 배양물을 혼합하여 -80°C에서 장기 보관을 위해 냉동될 수 있습니다.

8. 잠재적 인 형질 도입체의 검증

참고: 두 가지 항생제가 있는 상태에서 플레이트에서 자라는 클론을 선별하여 예상된(수혜자) 배경에서 진정한 형질도입제를 나타내는지 확인합니다. 이들 방법은 중합효소 연쇄 반응에 의한 특정 영역의 증폭 및 잠재적으로 시퀀싱에 기초한다. B. burgdorferi 에서 PCR을 수행하는 상세한 프로토콜 및 관행은 다른 곳에 설명되어 있습니다 (최근의 예는 Seshu et ^al.37 참조). 사용된 균주에 기초하여 형질도입체를 스크리닝하는데 사용되는 프라이머를 선택한다. 형질도입체를 스크리닝하는 방법에 관한 몇 가지 제안이 아래에 설명되어 있다.

1. PCR 스크리닝을 위해 B. 부르그도르페리 용해물을 준비합니다.
   참고: 다음 프로토콜은 PCR에 의한 DNA의 즉각적인 분석을 위해 단계 7.9에서와 같이 성장한 배양 세포로부터 세척된 B. burgdorferi 용해물을 생산하는 데 사용됩니다. 이 방법은 BSK에서 잠재적 억제제의 간섭을 최소화하도록 설계되었지만 시퀀싱 또는 저장을 위한 고품질 DNA 생성에는 권장되지 않습니다. 이를 위해 전체 게놈 추출을 위한 프로토콜 또는 키트를 사용하십시오( 재료 표 참조). 모 클론(공여자와 수용자 균주 모두)의 용해물도 각 분석에 포함시키기 위해 동시에 준비하는 것이 좋습니다.
   1. 단계 7.10에서와 같이 선택되고 배양된 각각의 잠재적 형질도입체 500μL를 깨끗한 미세원심분리 튜브로 옮깁니다.
   2. 배양물을 실온에서 8,000 x g 에서 10분 동안 원심분리한다.
   3. 상청액을 제거하고, 각 펠렛을 500 μL의 TE (10 mM Tris Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH 8.0)에 재현탁시킨다. 실온에서 8,000 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
   4. 상청액을 제거하고 각 펠릿을 50μL의 PCR 품질의 물에 재현탁합니다. 샘플을 10 분 동안 끓입니다. 잠시 식힌 다음 실온에서 10분 동안 8,000 x g 로 원심분리합니다.
   5. 각 PCR에 대해 즉시 원심 분리 된 샘플의 상단에서 2 μL를 사용하십시오. 펠릿을 방해하지 마십시오.
2. PCR을 사용하여 항생제 내성을 코딩하는 특정 유전자에 대한 잠재적 형질도입체를 스크리닝합니다. 형질도입 분석에 통상적으로 사용되는 항생제 내성 마커를 스크리닝하기 위한 프라이머에 대해서는 표 4 를 참조한다.
   참고: 우리의 경험상 드물지만 B. burgdorferi 에서 이종 DNA 선택에 사용되는 아미노글리코사이드 항생제에 대한 자발적인 돌연변이가 발생할 수 있습니다.
3. 다른 균주 또는 클론 마커를 사용하여 잠재적 형질도입체를 스크리닝하여 배경이 수용자의 배경인지 확인합니다. 이러한 분석에 기증자와 수혜자 부모 클론을 모두 포함하십시오. 사용된 균주를 기반으로 한 서열과 균주 무결성을 결정하기 위한 개별 실험실 프로토콜을 사용하여 균주 특이적 마커를 스크리닝합니다.
4. 틱 벡터 또는 포유동물 숙주 내에서 사용하거나 다른 클론과 직접 비교하기 위해 독성 클론으로 형질도입을 시도하는 경우, 형질도입체 및 모 클론의 완전한 플라스미드 함량을 결정한다. 이는 비교 균주와 동일한 플라스미드 함량 또는 다른 곳에서 설명된 바와 같이 엔조틱 주기 내에서 번식에 필요한 유전 요소의 존재를 보장하기 위해 수행됩니다.^{18,19,37,38,39.}

결과

박테리오파지를 사용하여 보다 쉽게 변형 가능한 B. burgdorferi 균주 또는 전기 변형에 취약한 클론 간에 DNA를 이동하는 것은 라임병의 결정 요인에 대한 지속적인 분자 조사를 위한 또 다른 도구입니다. 본원에 기재된 형질도입 분석은 잠재적 형질도입체의 선택을 위해 하나 또는 두 개의 항생제를 사용하여 임의의 관심 클론 사이에서 DNA의 이동을 용이하게 하기 위해 필요에 따라 변형될 수 ...

토론

형질 도입의 사용은 B. burgdorferi 1,4,13,37의 전기 변환과 관련된 생물학적 및 기술적 장벽 중 적어도 일부를 극복하는 한 가지 방법을 나타낼 수 있습니다. 많은 시스템에서, 박테리오파지는 일반화 또는 특수 형질도입^{22,23,24,49,50}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)	Millipore Sigma	S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)	USA Scientific	1450-0810	holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)	USA Scientific	5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)	Millipore Sigma		CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)	USA Scientific	1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE	Dot Scientific inc.	AGLE-500
Bacto Neopeptone	Gibco	DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate	Gibco	255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)	Gemini Bio-Products	700-104P
Chloroform (for molecular biology)	Thermo Fisher Scientific	BP1145-1	CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)	US Biological	C5900-01	cell culture grade
Erythromycin	Research Products International Corp	E57000-25.0
Gentamicin reagent solution	Gibco	15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Kanamycin sulfate	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)	Millipore Sigma	SLGSM33SS	to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine	MP Biomedicals, LLC	100068
Oligonucleotides (primers for PCR)	IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)	G Biosciences	786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber	Hausser scientific	HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass	Hausser scientific	HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)	Thermo Fisher Scientific	BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)	Pel-Freez Biologicals	31119-3	heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes	USA Scientific	9750-9150
Sodium bicarbonate	Thermo Fisher Scientific	BP328-500
Sodium chloride	Thermo Fisher Scientific	BP358-1
Sodium pyruvate	Millipore Sigma	P8674-25G
Spectronic Genesys 5	Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution	Millipore Sigma	S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate	Millipore Sigma	S1804-500G	sodium citrate for BSK