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Resumo

A capacidade dos bacteriófagos de mover o DNA entre as células bacterianas os torna ferramentas eficazes para a manipulação genética de seus hospedeiros bacterianos. Apresenta-se aqui uma metodologia para induzir, recuperar e utilizar φBB-1, um bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transduzir DNA heterólogo entre diferentes cepas da espiroqueta da doença de Lyme.

Resumo

A introdução de DNA estranho na espiroqueta Borrelia burgdorferi foi quase exclusivamente realizada por transformação usando eletroporação. Este processo tem eficiências notavelmente mais baixas na espiroqueta da doença de Lyme em relação a outras bactérias Gram-negativas melhor caracterizadas. A taxa de sucesso da transformação é altamente dependente de ter concentrado quantidades de DNA de alta qualidade de origens específicas e está sujeita a uma variabilidade significativa de cepa para cepa. Meios alternativos para a introdução de DNA estranho (ou seja, vetores de transporte, repórteres fluorescentes e marcadores de resistência a antibióticos) em B. burgdorferi poderiam ser uma adição importante ao arsenal de ferramentas úteis para a manipulação genética da espiroqueta da doença de Lyme. Os bacteriófagos têm sido bem reconhecidos como mecanismos naturais para o movimento do DNA entre bactérias em um processo chamado transdução. Neste estudo, um método foi desenvolvido para usar o onipresente fago borrelial φBB-1 para transduzir DNA entre células de B. burgdorferi de origens genéticas iguais e diferentes. O DNA transduzido inclui DNA borrelial e DNA heterólogo na forma de pequenos vetores de transporte. Esta demonstração sugere um uso potencial de transdução mediada por fagos como complemento à eletroporação para a manipulação genética da espiroqueta da doença de Lyme. Este relato descreve métodos para a indução e purificação do fago φBB-1 de B. burgdorferi, o uso deste fago em ensaios de transdução e a seleção e triagem de potenciais transdutores.

Introdução

O desenvolvimento de ferramentas para a manipulação genética da bactéria espiroqueta Borrelia burgdorferi tem acrescentado um valor imensurável à compreensão da natureza da doença de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi tem um genoma extraordinariamente complexo, composto por um pequeno cromossomo linear e plasmídeos lineares e circulares 5,6. A perda espontânea de plasmídeos, o rearranjo intragênico (movimento de genes de um plasmídeo para outro dentro do mesmo organismo) e a transferência horizontal de genes (HGT, o movimento do DNA entre dois organismos) deram origem a uma quantidade estonteante de heterogeneidade genética entre B. burgdorferi (por exemplo, ver Schutzer et al.7). Os genótipos resultantes (ou "cepas") são todos membros da mesma espécie, mas apresentam diferenças genéticas que influenciam sua capacidade de transmitir e infectar diferentes hospedeiros mamíferos 8,9,10,11. Neste relatório, o termo "estirpe" será utilizado para se referir a B. burgdorferi com um fundo genético derivado naturalmente particular; o termo "clone" será utilizado para se referir a uma estirpe que tenha sido geneticamente modificada para um fim específico ou em resultado de manipulação experimental.

A caixa de ferramentas moleculares disponível para uso em B. burgdorferi inclui marcadores selecionáveis, repórteres de genes, vetores de transporte, mutagênese de transposon, promotores induzíveis e marcadores contra-selecionáveis (para uma revisão, ver Drektrah e Samuels12). O uso efetivo dessas metodologias requer a introdução artificial de DNA heterólogo (estranho) em uma cepa de B. burgdorferi de interesse. Em B. burgdorferi, a introdução do DNA heterólogo é realizada quase que exclusivamente por eletroporação, método que utiliza um pulso de eletricidade para tornar uma membrana bacteriana transitoriamente permeável a pequenos pedaços de DNA introduzidos no meio1. A maioria das células (estimada em ≥99,5%) é morta pelo pulso, mas as células restantes têm alta frequência de retenção do DNA heterólogo13. Embora considerado um dos métodos mais eficientes de introdução de DNA em bactérias, a frequência de eletroporação em B. burgdorferi é muito baixa (variando de 1 transformador em 5 × 104 a 5 × 106 células)13. As barreiras para alcançar frequências mais altas de transformação parecem ser técnicas e biológicas. As barreiras técnicas para o sucesso da eletroporação de B. burgdorferi incluem tanto a quantidade de DNA (>10 μg) que é necessária quanto a exigência de que as espiroquetas estejam exatamente na fase correta de crescimento (meio de bordo, entre 2 × 10 7 células·mL−1 e 7 × 107 células·mL−1) ao preparar células eletrocompetentes 12,13. Essas barreiras técnicas, no entanto, podem ser mais fáceis de superar do que as barreiras biológicas.

Pesquisadores da doença de Lyme reconhecem que os clones de B. burgdorferi podem ser divididos em duas grandes categorias no que diz respeito à sua capacidade de serem manipulados geneticamente13,14. Isolados de alta passagem, adaptados ao laboratório, são frequentemente facilmente transformados, mas geralmente perdem os plasmídeos essenciais para a infectividade, comportam-se de maneira fisiologicamente aberrante e não são capazes de infectar um hospedeiro mamífero ou persistir dentro de um vetor de carrapato12,13. Embora esses clones tenham sido úteis para dissecar a biologia molecular da espiroqueta dentro do laboratório, eles são de pouco valor para estudar a espiroqueta dentro do contexto biológico do ciclo enzoótico. Isolados infecciosos de baixa passagem, por outro lado, comportam-se de maneira fisiológica reflexiva de um estado infeccioso e podem completar o ciclo infeccioso, mas geralmente são recalcitrantes à introdução de DNA heterólogo e, portanto, de difícil manipulação para estudo12,13. A dificuldade em transformar isolados de baixa passagem está relacionada a pelo menos dois fatores diferentes: (i) isolados de baixa passagem muitas vezes se aglutinam firmemente, particularmente sob as condições de alta densidade necessárias para a eletroporação, bloqueando assim muitas células da aplicação completa da carga elétrica ou do acesso ao DNA no meio13,15; e (ii) B. burgdorferi codifica pelo menos dois diferentes sistemas de restrição e modificação (R-M) transmitidos por plasmídeos que podem ser perdidos em isolados de alta passagem14,16. Os sistemas R-M evoluíram para permitir que as bactérias reconheçam e eliminem o DNA estranho17. De fato, vários estudos em B. burgdorferi demonstraram que as eficiências de transformação aumentam quando a fonte do DNA é B. burgdorferi e não Escherichia coli13,16. Infelizmente, adquirir a alta concentração necessária de DNA para eletroporação de B. burgdorferi é uma perspectiva cara e demorada. Outra preocupação potencial ao eletroporar e selecionar isolados de baixa passagem é que o processo parece favorecer transformadores que perderam o plasmídeo crítico associado à virulência, lp2514,18,19; assim, o próprio ato de manipular geneticamente isolados de B. burgdorferi de baixa passagem via eletroporação pode selecionar clones que não são adequados para análise biologicamente relevante dentro do ciclo enzoótico20. Dadas essas questões, um sistema no qual o DNA heterólogo poderia ser eletrotransformado em clones de B. burgdorferi de alta passagem e, em seguida, transferido para isolados infecciosos de baixa passagem por um método diferente da eletroporação poderia ser uma adição bem-vinda à crescente coleção de ferramentas moleculares disponíveis para uso na espiroqueta da doença de Lyme.

Além da transformação (a absorção de DNA nu), existem dois outros mecanismos pelos quais as bactérias absorvem regularmente o DNA heterólogo: a conjugação, que é a troca de DNA entre bactérias em contato físico direto entre si, e a transdução, que é a troca de DNA mediada por um bacteriófago21. De fato, a capacidade do bacteriófago de mediar a HGT tem sido utilizada como ferramenta experimental para dissecar os processos moleculares dentro de vários sistemas bacterianos22,23,24. B. burgdorferi não é naturalmente competente para a absorção de DNA nu, e há pouca evidência de que B. burgdorferi codifica o aparato necessário para promover a conjugação bem-sucedida. Relatos prévios descreveram, no entanto, a identificação e caracterização preliminar do φBB-1, um bacteriófago temperado de B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 empacota uma família de plasmídeos de 30 kb encontrados em B. burgdorferi25; os membros desta família foram designados cp32s. Consistente com um papel para φBB-1 na participação em HGT entre cepas de B. burgdorferi, Stevenson et al. relataram uma cp32 idêntica encontrada em duas cepas com cp32s de outra forma díspares, sugerindo um compartilhamento recente dessa cp32 entre essas duas cepas, provavelmente via transdução29. Há também evidências de recombinação significativa via HGT entre os cp32s em um genoma relativamente estável30,31,32,33. Finalmente, a capacidade do φBB-1 de transduzir tanto cp32s quanto DNA vetorial heterólogo entre células da mesma cepa e entre células de duas cepas diferentes foi demonstrada anteriormente27,28. Diante desses achados, o φBB-1 tem sido proposto como outra ferramenta a ser desenvolvida para a dissecação da biologia molecular de B. burgdorferi.

O objetivo deste relato é detalhar um método para induzir e purificar o fago φBB-1 de B. burgdorferi, bem como fornecer um protocolo para a realização de um ensaio de transdução entre clones de B. burgdorferi e seleção e triagem de potenciais transdutores.

Protocolo

Todos os experimentos usando DNA recombinante e organismos BSL-2 foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Universidade de Quinnipiac.

1. Preparação da cultura de B. burgdorferi para a produção de φBB-1

  1. Preparar o meio Barbour-Stoenner-Kelly suplementado com soro de coelho normal (BSK) inativado pelo calor a 6,6%15. Para 1 L de 1x BSK, combinar os componentes listados na Tabela 1 em 900 mL de água, ajustar o pH para 7,6 usando hidróxido de sódio 1 N e misturar lentamente a 4 °C por 2-4 h. Após a conclusão da mistura, verifique e reajuste o pH para 7,6, se necessário, e aumente o volume para 1 L com água. Esterilizar o meio passando por um filtro de 0,22 μM (ver Tabela de Materiais) e utilizar fresco ou armazenar a 4 °C durante ≤2 meses.
  2. Três a cinco dias antes do início do protocolo de transdução, inocular 150 μL do(s) clone(s) apropriado(s) de B. burgdorferi em 15 mL de 1x BSK em tubos de centrífuga cônica estéreis bem tampados (ver Tabela de Materiais). Complementar o meio com a concentração apropriada de antibióticos ou combinação de antibióticos para a seleção e manutenção de DNA heterólogo dentro do(s) clone(s) de B. burgdorferi (Tabela 2).
    NOTA: B. burgdorferi é um organismo de nível 2 de biossegurança. Tome todas as precauções apropriadas ao trabalhar com este organismo. Realizar todo o trabalho com culturas vivas de B. burgdorferi em um gabinete de biossegurança certificado e devidamente desinfetado classe II. Descarte adequadamente todo o material que entre em contato com B. burgdorferi e os próprios organismos com base nas diretrizes do CDC34.
  3. Incubar as culturas a 33 °C sem agitar até que as culturas atinjam uma densidade de ≥5 × 107 espiroquetas·mL−1, o que leva aproximadamente 3-5 dias.

2. Determinar a densidade da(s) cultura(s) de B. burgdorferi (modificada(s) a partir de Samuels)15

  1. Para densidades previstas acima de 5 × 106 células·mL−1, determine a densidade celular usando espectroscopia.
    1. Transfira 1 mL de cultura para um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL e centrífuga a 8.000 x g por 5 min à temperatura ambiente.
    2. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 e1,8 mM KH2PO4). Transfira toda a suspensão celular para uma cubeta transparente semi-micro UV.
    3. Determinar a densidade óptica da amostra ressuspensa a um comprimento de onda de 600 nm (A600). Zerar o espectrofotômetro (ver Tabela de Materiais) contra PBS.
    4. Para calcular a concentração de espiroquetas·mL−1 na cultura original, multiplique a densidade óptica em A600 por 1,4 × 109.
  2. Para densidades previstas entre 5 × 104 células·mL−1 e 5 × 106 células·mL−1, determine a densidade celular usando uma câmara de contagem de Petroff-Hausser (ver Tabela de Materiais) para contar diretamente o número de espiroquetas. Este método também pode ser usado para densidades mais altas após a diluição apropriada.
    NOTA: A visualização de espiroquetas vivas requer um microscópio modificado com um condensador de campo escuro.
    1. Aplicar 10 μL de amostra na câmara de contagem e cobrir com um vidro de cobertura adequado. Para densidades superiores a 1 × 107, diluir a amostra em PBS para produzir 50-100 espiroquetas por campo.
    2. Conte as células usando um microscópio de campo escuro a uma ampliação de 200x-400x. Conte todo o campo de 25 grupos de 16 pequenos quadrados em todos os planos.
    3. Multiplique o número contado pelo fator de diluição (se houver) e 5 × 104 para produzir células·mL−1 de cultura original.

3. Indução do fago B. burgdorferi φBB-1

NOTA: Esterilizar todos os artigos de vidro e plasticware por autoclavagem; esterilizar todas as soluções por autoclave ou filtração através de um filtro de 0,22 μM. As etapas abaixo são apresentadas com base em volumes de 15 mL, mas o método é escalável para volumes menores ou maiores, dependendo das necessidades individuais do experimento.

  1. Para a cultura de B. burgdorferi a partir da qual o fago será produzido (o doador), use a concentração calculada por qualquer um dos métodos na etapa 2 para determinar o volume de cultura inicial necessário para produzir 4 mL de 2 × 108 espiroquetas·mL−1. Isso produzirá uma concentração final de 5 × 107 espiroquetas·mL−1 em 15 mL durante o estágio de recuperação (etapa 3.6 abaixo).
  2. Centrifugar o volume de cultura calculado no passo 3.1 a 6.000 x g durante 10 min. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 4 mL de BSK fresco. Transfira a amostra para o menor tubo estéril disponível para manter a amostra com o mínimo de espaço na cabeça.
  3. Adicionar a quantidade apropriada de agente indutor à concentração recomendada (Tabela 3) com base em um volume de cultura de 4 mL para induzir a produção de fagos. Tampe o tubo bem e misture bem.
  4. Incubar a amostra a 33 °C durante 2-4 h.
  5. Após a incubação, transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a amostra a 6.000 x g durante 10 minutos. Decantar o sobrenadante.
  6. Ressuspeite o pellet celular em 15 mL de 1x BSK.
    NOTA: Após a indução do fago, existem duas maneiras diferentes de proceder com o ensaio de transdução. Esses métodos são apresentados na Figura 1 e nas etapas 4 e 6.

4. Transdução durante a cocultura após exposição do dador ao agente indutor (Figura 1A)

NOTA: Este protocolo só pode ser usado quando a cepa produtora de fagos (doador) tem resistência a um antibiótico específico e a cepa a ser transduzida (receptora) tem resistência a outro antibiótico.

  1. Preparar uma cultura de B. burgdorferi para ser utilizada como receptora em ensaios de transdução, conforme descrito para a estirpe dadora no passo 1 acima. Com base na densidade determinada como na etapa 2, calcule o volume necessário para produzir 15 mL de 1 × 107 espiroquetas·mL−1.
  2. Centrifugar o volume de cultura calculado na etapa 4.1 a 6.000 x g por 10 min. Decantar o sobrenadante.
  3. Ressuspender o pellet em 1 mL de cultura a partir da etapa 3.6 (doador de fago ressuspenso). Adicione o receptor ressuspenso de volta à cultura com o doador. Não complemente com antibiótico. O volume total contendo ambas as culturas é de 15 mL.
  4. Incubar a 33 °C durante 72-96 h.
  5. Realizar a seleção de transdutores por chapeamento em fase sólida após co-cultura, conforme descrito na etapa 7.

5. Precipitação de polietilenoglicol (PEG) para recuperação de fago para uso em ensaio de transdução

NOTA: Este protocolo pode ser usado nos casos em que a cepa produtora de fagos (doador) tem resistência a um antibiótico específico e a cepa a ser transduzida (receptora) não tem resistência a antibióticos ou resistência a outro antibiótico.

  1. Complementar a cultura da etapa 3.6 com o antibiótico apropriado na concentração indicada na Tabela 2. Incubar a amostra a 33 °C durante 72-96 h.
  2. Preparar soluções para a precipitação de PEG.
    1. Preparar 500 mL de NaCl 5 M. Esterilizar por autoclave e deixar arrefecer antes de utilizar. Armazenar à temperatura ambiente.
    2. Preparar 500 mL de PEG a 40% dissolvendo 200 g de PEG8000 em 400 mL de água; aqueça suavemente enquanto mexe até que a solução esteja bem misturada. Traga o volume até 500 mL com água. Para dissolver completamente o PEG8000 e esterilizar a solução, autoclave a solução e arrefeça antes de utilizar. Armazenar à temperatura ambiente.
    3. Preparar 100 mL de meio de suspensão (SM; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4 e 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]). Esterilizar por autoclavagem. Conservar a 4 °C.
  3. Para a precipitação de PEG do fago do clone doador de B. burgdorferi (a partir do passo 3.6), após 72-96 h de incubação, centrifugar as amostras a 8.000 x g durante 20 min a 4 °C.
  4. Decantar o sobrenadante em um tubo cônico limpo de 50 mL; descarte o pellet celular. Adicione 5 M de NaCl a uma concentração final de 1 M. Misture bem. Agite suavemente à temperatura ambiente durante 1 h.
  5. Centrifugar as amostras a 8.000 x g durante 10 min a 4 °C. Decantar o sobrenadante em um tubo cônico limpo de 50 mL; o pellet pode ser pequeno ou ausente. Adicionar a 40% de solução de PEG8000 ao sobrenadante até uma concentração final de 10%. Misture bem e coloque no gelo por mais de 1 h até a noite.
    NOTA: Tempos mais longos não parecem se correlacionar com o aumento significativo da recuperação do fago.
  6. Centrifugar as amostras a 8.000 x g durante 20 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e remova o máximo de líquido possível sem perder nenhum pellet, que contém as partículas do fago.
  7. Ressuspenda o pellet em um volume mínimo de SM, usando o SM para lavar o lado da garrafa e coletar quaisquer partículas potenciais de fago. A proporção recomendada é de 400 μL de SM por 10 mL de sobrenadante original, mas dependendo do tamanho do pellet, mais ou menos SM pode ser necessário para a ressuspensão completa.
  8. Trate a amostra de fago recuperada com um volume igual de clorofórmio com base no volume de ressuspensão. Misture bem a amostra e, em seguida, centrifugar a 8.000 x g por 10 min. Remova a camada aquosa (superior) para um tubo limpo, evitando qualquer uma das camadas de interface espessas.
    NOTA: φBB-1 é um bacteriófago não envelopado e não é suscetível ao tratamento com clorofórmio25. Este passo é feito para interromper ainda mais quaisquer estruturas ligadas à membrana (ou seja, células ou bolhas) e para matar quaisquer contaminantes celulares potenciais. O clorofórmio é um orgânico volátil e deve ser usado apenas em um exaustor bem ventilado; Rejeitar material que contenha clorofórmio como resíduo orgânico.
  9. Determinar o volume recuperado após o primeiro tratamento com clorofórmio e tratar novamente a amostra com uma quantidade de clorofórmio igual a 10% desse volume. Misture bem e centrifugar a 8.000 x g por 10 min. Remova a camada aquosa (superior), tomando cuidado para evitar qualquer interface ou camada orgânica. Transfira a camada aquosa para um tubo limpo.
  10. Utilizar o fago imediatamente (conforme descrito no passo 6) ou conservar a 4 °C.
    NOTA: O congelamento de amostras de fagos φBB-1 não é recomendado. Embora a estabilidade do φBB-1 a 4 °C não tenha sido rigorosamente investigada, amostras armazenadas a 4 °C por até 1 mês após a recuperação têm sido usadas com sucesso em ensaios de transdução.

6. Ensaio de transdução após precipitação PEG de φBB-1 (Figura 1B)

  1. Preparar culturas de B. burgdorferi para serem utilizadas como receptoras em ensaios de transdução, conforme descrito para a estirpe dadora no passo 1 acima. Com base na densidade determinada como na etapa 2, calcule o volume de cultura do receptor necessário para produzir 15 mL de 1 × 107 espiroquetas·mL−1.
  2. Centrifugar o volume de cultura calculado na etapa 6.1 a 6.000 x g por 10 min. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 14,5 mL de BSK fresco.
  3. Adicionar ≤500 μL de amostra de fago precipitado por PEG (a partir do passo 5) à cultura do clone receptor. Misturar bem e incubar a 33 °C durante 72-96 h.
    NOTA: A quantidade de fago recuperada durante a precipitação de PEG pode ser variável, dependendo de uma série de fatores. No entanto, a partir de 15 mL de cultura da cepa CA-11.2A induzida de B. burgdorferi , 500 μL normalmente contém 50-1.000 fagos viáveis28. Os volumes de recuperação do fago ≥500 μL afetam negativamente o crescimento de B. burgdorferi , provavelmente devido ao aumento da proporção de SM para BSK.
  4. Realizar a seleção de transdutores por chapeamento em fase sólida após mistura com fago precipitado por PEG, conforme descrito na etapa 7.

7. Seleção de transdutores

NOTA: O revestimento em fase sólida de potenciais transdutores é realizado usando uma modificação de camada única do protocolo descrito pela primeira vez por Samuels15. As colônias de B. burgdorferi crescem dentro do ágar, portanto, para a seleção de transdutores por revestimento em fase sólida, as amostras devem ser adicionadas ao meio enquanto as placas são derramadas. Um método alternativo para a seleção de transformadores utilizando um método de diluição em placas de 96 poços também foi descrito anteriormente35. Esta técnica também pode ser eficaz para a seleção de transdutores, mas ainda não foi tentada para este fim.

  1. Determinar o número de placas necessárias para a seleção de transdutores com base no número de amostras dos ensaios e controles de transdução a serem chapeados.
    NOTA: Normalmente, duas placas são derramadas por amostra, uma equivalente a aproximadamente 10% do volume de cultura e outra que inclui o restante da cultura. Além disso, despeje placas que servem como controles negativos para testar individualmente que a preparação do fago e / ou clones pais usados como doador e receptor não crescem na presença do(s) antibiótico(s) usado(s) durante a seleção. A preparação de material de revestimento para pelo menos duas placas extras também é recomendada. Por exemplo, se o número de amostras e controles a serem chapeados for oito, prepare uma mistura de chapeamento suficiente para 10 placas.
  2. Preparar soluções para chapeamento conforme descrito abaixo.
    NOTA: Cada placa será de 30 mL, consistindo de 20 mL de 1,5x BSK para chapeamento e 10 mL de agarose a 2,1% (proporção de 2:1). Isso produzirá uma placa com concentrações finais de 1x BSK e 0,7% de agarose. Por exemplo, para 10 placas, prepare uma mistura total de chapeamento de 300 mL, consistindo de 200 mL de 1,5x BSK e 100 mL de agarose a 2,1%.
    1. Prepare 1 L de 1,5x BSK conforme descrito para 1x BSK na etapa 1.1 usando as quantidades de cada componente listadas para 1,5x BSK na Tabela 1. Armazene conforme descrito para 1x BSK.
    2. Preparar 2,1% de agarose em água e autoclave. Utilize a solução de agarose fresca ou guarde à temperatura ambiente. Se armazenado à temperatura ambiente, leve ao micro-ondas com a tampa frouxamente até que fique completamente derretido antes do revestimento.
    3. Determinar o volume de antibiótico(s) necessário(s) para atingir a concentração adequada (Tabela 2) com base em toda a mistura de chapeamento.
      NOTA: Se o volume total da solução de revestimento final for de 300 mL, misture 200 mL de 1,5x BSK e antibiótico suficiente para garantir que todos os 300 mL tenham a concentração final correta de antibiótico. Se tanto o doador quanto o receptor no ensaio de transdução tiverem genes diferentes de resistência a antibióticos, a mistura de revestimento deve conter ambos os antibióticos. Se o fago precipitado por PEG do doador (conforme preparado na etapa 5) codificar um marcador de resistência a antibióticos e o receptor não tiver nenhum, a mistura de revestimento deve conter apenas um antibiótico.
  3. Com base no número de placas a serem derramadas, transfira a quantidade apropriada de 1,5x BSK e antibiótico(s) para uma garrafa estéril grande o suficiente para conter toda a mistura de chapeamento. Equilibrar-se em banho-maria a 56 °C durante ≥15 min.
  4. Equilibre a agarose derretida da autoclave ou do micro-ondas em banho-maria a 56 °C durante ≥15 min.
  5. Após o equilíbrio, adicionar a quantidade determinada de agarose a 2,1% ao frasco com o BSK 1,5x (com antibiótico) e voltar a colocar a solução de revestimento em banho-maria a 42 °C durante 10-15 min.
    NOTA: Temperaturas mais altas podem danificar ou matar as espiroquetas36. Se estiver a utilizar o mesmo banho-maria que acima, arrefecer o banho-maria a 42-45 °C antes de iniciar o temporizador para o equilíbrio. Não deixe a solução de chapeamento equilibrar-se a 42 °C durante mais de 20 minutos ou começará a solidificar enquanto derrama as placas.
  6. Durante o equilíbrio, preparar as amostras de B. burgdorferi para serem chapeadas. Transfira a quantidade a ser chapeada para um tubo de centrífuga cônica estéril de 50 mL (ver Tabela de Materiais).
    1. Se chapear uma quantidade inferior a 1,5 mL (<5% do volume final da placa de 30 mL), transfira a amostra para o novo tubo e adicione a mistura de chapeamento diretamente à amostra durante o chapeamento.
    2. Para volumes maiores, transfira o volume desejado de cultura para o novo tubo e, em seguida, centrifugar a 6.000 x g por 10 min à temperatura ambiente. Decantar todos, exceto 100-500 μL do sobrenadante e usar o restante para ressuspender o pellet completamente antes do revestimento.
    3. Para placas de controle após cocultura, adicione ≥107 células dos clones doadores ou receptores a tubos de centrífuga cônicos estéreis de 50 mL. Se o volume for superior a 1,5 ml, centrifugar e ressuspender o pellet como indicado no passo 7.6.2. Se um ensaio de transdução foi realizado usando o fago precipitado por PEG, além do clone receptor, adicione 100-250 μL da amostra de fago em um tubo cônico estéril de 50 mL para revestimento.
  7. Após o equilíbrio da solução de chapeamento a 42-45 °C durante 10-15 min, transferir 30 ml da solução de chapeamento para um tubo com a amostra adequada; dispensar imediatamente a mistura de chapeamento e a amostra numa placa rotulada. Repetir com uma pipeta fresca para cada amostra a revestir.
  8. Deixe as placas solidificarem por 15-20 min e, em seguida, coloque-as em uma incubadora de 33 °C suplementada com 5% de CO2. Não inverta as placas durante pelo menos 48 h após terem sido derramadas.
  9. Dependendo do histórico do clone receptor, verifique se as colônias aparecem dentro da agarose nas placas de seleção após 10-21 dias de incubação. Escolha pelo menos 5-10 colônias que crescem na placa na presença de ambos os antibióticos usando um 5,75 com tampão de algodão esterilizado em pipeta de borossilicato (ver Tabela de Materiais) e inocular-as em 1,5 mL de 1x BSK com o(s) antibiótico(s) apropriado(s).
  10. Cultivar as colónias inoculadas a 33 °C como no passo 1.3 durante 3-5 dias ou até atingirem uma densidade de aproximadamente 20-40 espiroquetas por campo a uma ampliação de 200x utilizando microscopia de campo escuro.
    NOTA: Uma vez rastreadas (ver passo 8), as espiroquetas podem ser congeladas para armazenamento a longo prazo a -80 °C, misturando um volume igual de cultura com uma mistura de 60% de glicerol e 40% 1x BSK esterilizado por filtração através de um filtro de 0,22 μm.

8. Verificação de potenciais transdutores

NOTA: Examine os clones que crescem em placas na presença de dois antibióticos para verificar se eles representam transdutores verdadeiros no plano de fundo antecipado (receptor). Esses métodos são baseados na amplificação, e potencialmente sequenciamento, de regiões específicas pela reação em cadeia da polimerase. Protocolos e práticas detalhadas de realização de PCR em B. burgdorferi são descritos em outro lugar (para um exemplo recente, ver Seshu et al.37). Selecione os primers utilizados para a triagem dos transdutores com base nas cepas utilizadas. Algumas sugestões de como abordar a triagem dos transdutores são descritas a seguir.

  1. Preparar lisados de B. burgdorferi para triagem por PCR.
    NOTA: O seguinte protocolo é utilizado para produzir lisados de B. burgdorferi lavados a partir de células cultivadas como no passo 7.9 para análise imediata do ADN por PCR. Este método é projetado para minimizar a interferência de potenciais inibidores em BSK, mas não é recomendado para a produção de DNA de alta qualidade para sequenciamento ou armazenamento. Para esse fim, use um protocolo ou kit para extração total do genoma (consulte Tabela de Materiais). É altamente recomendável que os lisados dos clones pais (cepas doadoras e receptoras) também sejam preparados ao mesmo tempo para serem incluídos em cada análise.
    1. Transferir 500 μL de cada transdutor potencial selecionado e cultivado como na etapa 7.10 para um tubo de microcentrífuga limpo.
    2. Centrifugar as culturas por 10 min a 8.000 x g à temperatura ambiente.
    3. Remova o sobrenadante e ressuspenda cada pellet em 500 μL de TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). Centrífuga por 5 min a 8.000 x g à temperatura ambiente.
    4. Remova o sobrenadante e ressuspenda cada pellet em 50 μL de água com qualidade de PCR. Ferva as amostras por 10 min. Deixe-os esfriar brevemente e, em seguida, centrifugar a 8.000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente.
    5. Para cada PCR, utilizar imediatamente 2 μL a partir da parte superior da amostra centrifugada; evite perturbar o pellet.
  2. Rastreie os transdutores potenciais para os genes específicos que codificam a resistência aos antibióticos usando PCR. Veja a Tabela 4 para os primers para triagem de marcadores de resistência a antibióticos comumente usados em ensaios de transdução.
    NOTA: Embora rara em nossa experiência, pode ocorrer mutação espontânea nos antibióticos aminoglicosídeos usados para a seleção de DNA heterólogo em B. burgdorferi.
  3. Filtre os transdutores potenciais também usando outro marcador de cepa ou clone para confirmar que o plano de fundo é o do receptor. Incluir os clones progenitores do dador e do progenitor recetor nestas análises. Triagem de marcadores específicos de cepas usando sequências baseadas nas cepas usadas e protocolos laboratoriais individuais para determinar a integridade da cepa.
  4. Se tentar transduzi-los em clones virulentos para uso dentro do vetor de carrapato ou hospedeiro de mamíferos ou para comparação direta com outro clone, determine o conteúdo plasmídico completo dos transdutores e dos clones pais. Isso é feito para garantir o mesmo teor plasmídico que o da cepa comparativa ou a presença dos elementos genéticos necessários para a propagação dentro do ciclo enzoótico, como é descrito em outro lugar 18,19,37,38,39.

Resultados

O uso de bacteriófagos para mover o DNA entre cepas de B. burgdorferi mais facilmente transformáveis ou clones que são recalcitrantes à eletrotransformação representa outra ferramenta para a investigação molecular contínua dos determinantes da doença de Lyme. O ensaio de transdução aqui descrito pode ser modificado conforme necessário para facilitar o movimento do DNA entre quaisquer clones de interesse usando um ou dois antibióticos para a seleção de transdutores potenciais. A transdução do DN...

Discussão

O uso da transdução poderia representar um método de superação de pelo menos algumas das barreiras biológicas e técnicas associadas à eletrotransformação de B. burgdorferi 1,4,13,37. Em muitos sistemas, o bacteriófago pode mover o DNA do hospedeiro (não prófago) entre células bacterianas por transdução generalizada ou especializada 22,23,24,49,50.

Divulgações

O autor não tem nada a revelar.

Agradecimentos

O autor deseja agradecer a Shawna Reed, D. Scott Samuels e Patrick Secor por sua discussão útil e Vareeon (Pam) Chonweerawong por sua assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Ciências Biomédicas e bolsas de pesquisa do corpo docente para Christian H. Eggers da Escola de Ciências da Saúde da Universidade de Quinnipiac.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)Millipore SigmaS2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)USA Scientific1450-0810holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)Millipore SigmaCAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)Thermo Fisher Scientific13-678-8Aautoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LEDot Scientific inc.AGLE-500
Bacto NeopeptoneGibcoDF0119-17-9
Bacto TC YeastolateGibco255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)Gemini Bio-Products700-104P
Chloroform (for molecular biology)Thermo Fisher ScientificBP1145-1CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)US BiologicalC5900-01cell culture grade
ErythromycinResearch Products International CorpE57000-25.0
Gentamicin reagent solutionGibco15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)Thermo Fisher ScientificBP350-500
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-500
Kanamycin sulfateThermo Fisher Scientific25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)Millipore SigmaSLGSM33SSto filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin CThermo Fisher ScientificBP25312CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamineMP Biomedicals, LLC100068
Oligonucleotides (primers for PCR)IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)G Biosciences786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)Thermo Fisher ScientificFB0875712
Petroff-Hausser counting chamberHausser scientificHS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glassHausser scientificHS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)Thermo Fisher ScientificBP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)Pel-Freez Biologicals31119-3heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettesUSA Scientific9750-9150
Sodium bicarbonateThermo Fisher ScientificBP328-500
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificBP358-1
Sodium pyruvateMillipore SigmaP8674-25G
Spectronic Genesys 5Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solutionMillipore SigmaS6501-50G
Trisodium citrate dihydrateMillipore SigmaS1804-500Gsodium citrate for BSK

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