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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
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  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Fähigkeit von Bakteriophagen, DNA zwischen Bakterienzellen zu bewegen, macht sie zu wirksamen Werkzeugen für die genetische Manipulation ihrer bakteriellen Wirte. Hier wird eine Methodik zur Induktion, Wiederherstellung und Verwendung von φBB-1, einem Bakteriophagen von Borrelia burgdorferi, vorgestellt, um heterologe DNA zwischen verschiedenen Stämmen der Lyme-Borreliose Spirochäte zu transduzieren.

Zusammenfassung

Das Einbringen von Fremd-DNA in die Spirochäte Borrelia burgdorferi erfolgte fast ausschließlich durch Umwandlung mittels Elektroporation. Dieser Prozess hat deutlich geringere Wirkungsgrade in der Lyme-Borreliose-Spirochäte im Vergleich zu anderen, besser charakterisierten gramnegativen Bakterien. Die Erfolgsrate der Transformation hängt stark von konzentrierten Mengen hochwertiger DNA aus spezifischen Hintergründen ab und unterliegt einer signifikanten Variabilität von Stamm zu Stamm. Alternative Mittel zum Einbringen fremder DNA (d.h. Shuttle-Vektoren, fluoreszierende Reporter und Antibiotikaresistenzmarker) in B. burgdorferi könnten eine wichtige Ergänzung zum Arsenal nützlicher Werkzeuge für die genetische Manipulation der Lyme-Borreliose-Spirochäte sein. Bakteriophagen sind als natürliche Mechanismen für die Bewegung von DNA zwischen Bakterien in einem Prozess namens Transduktion anerkannt. In dieser Studie wurde eine Methode entwickelt, um den ubiquitären Borrelialphagen φBB-1 zu verwenden, um DNA zwischen B. burgdorferi-Zellen mit demselben und unterschiedlichem genetischen Hintergrund zu transduzieren. Die transduzierte DNA umfasst sowohl borreliale DNA als auch heterologe DNA in Form von kleinen Shuttle-Vektoren. Diese Demonstration legt eine mögliche Verwendung der Phagen-vermittelten Transduktion als Ergänzung zur Elektroporation für die genetische Manipulation der Lyme-Borreliose-Spirochäte nahe. Dieser Bericht beschreibt Methoden zur Induktion und Reinigung von Phage φBB-1 aus B. burgdorferi, die Verwendung dieses Phagens in Transduktionsassays und die Auswahl und das Screening potenzieller Transduktanten.

Einleitung

Die Entwicklung von Werkzeugen zur genetischen Manipulation des Spirochätenbakteriums Borrelia burgdorferi hat dem Verständnis der Natur der Borreliose 1,2,3,4 einen unermesslichen Mehrwert verliehen. B. burgdorferi hat ein ungewöhnlich komplexes Genom, das aus einem kleinen linearen Chromosom und sowohl linearen als auch zirkulären Plasmiden besteht 5,6. Spontaner Plasmidverlust, intragene Umlagerung (Bewegung von Genen von einem Plasmid zum anderen innerhalb desselben Organismus) und horizontaler Gentransfer (HGT, die Bewegung von DNA zwischen zwei Organismen) haben zu einer schwindelerregenden genetischen Heterogenität bei B. burgdorferi geführt (als Beispiel siehe Schutzer et al.7). Die resultierenden Genotypen (oder "Stämme") sind alle Mitglieder derselben Art, haben aber genetische Unterschiede, die ihre Fähigkeit beeinflussen, verschiedene Säugetierwirte zu übertragen und zu infizieren 8,9,10,11. In diesem Bericht wird der Begriff "Stamm" verwendet, um sich auf B. burgdorferi mit einem bestimmten natürlichen genetischen Hintergrund zu beziehen; Der Begriff "Klon" wird verwendet, um sich auf einen Stamm zu beziehen, der für einen bestimmten Zweck oder als Ergebnis experimenteller Manipulation genetisch verändert wurde.

Die molekulare Toolbox, die für den Einsatz in B. burgdorferi zur Verfügung steht, umfasst selektierbare Marker, Genreporter, Shuttle-Vektoren, Transposon-Mutagenese, induzierbare Promotoren und gegenselektierbare Marker (für eine Übersicht siehe Drektrah und Samuels12). Die effektive Anwendung dieser Methoden erfordert die künstliche Einführung heterologer (fremder) DNA in einen interessierenden B. burgdorferi-Stamm. Bei B. burgdorferi erfolgt die Einführung heterologer DNA fast ausschließlich durch Elektroporation, eine Methode, die einen Stromimpuls verwendet, um eine Bakterienmembran vorübergehend durchlässig für kleine DNA-Stücke zu machen, die in das Medium eingebracht werden1. Die Mehrheit der Zellen (geschätzt ≥99,5%) wird durch den Puls abgetötet, aber die verbleibenden Zellen haben eine hohe Häufigkeit, die heterologe DNAzu behalten 13. Obwohl sie als eine der effizientesten Methoden zur Einführung von DNA in Bakterien gilt, ist die Häufigkeit der Elektroporation in B. burgdorferi sehr gering (von 1 Transformator in 5 × 104 bis 5 × 106 Zellen)13. Die Hindernisse für das Erreichen höherer Transformationsfrequenzen scheinen sowohl technischer als auch biologischer Natur zu sein. Technische Hindernisse für die erfolgreiche Elektroporation von B. burgdorferi umfassen sowohl die Menge an DNA>, die notwendig ist, als auch die Anforderung der Spirochäten, sich in genau der richtigen Wachstumsphase (Mitte log, zwischen 2 × 10 7 Zellen·mL−1 und 7 × 107 Zellen·ml−1) bei der Herstellung elektrokompetenter Zellen12,13 zu befinden. Diese technischen Barrieren sind jedoch möglicherweise leichter zu überwinden als die biologischen Barrieren.

Borreliose-Forscher erkennen, dass B. burgdorferi-Klone in Bezug auf ihre Fähigkeit, genetisch manipuliert zu werden, in zwei große Kategorien unterteilt werden können13,14. Laborangepasste Isolate mit hoher Passage sind oft leicht transformierbar, haben aber in der Regel die für die Infektiosität essentiellen Plasmide verloren, verhalten sich physiologisch abweichend und sind nicht in der Lage, einen Säugetierwirt zu infizieren oder innerhalb eines Zeckenvektors zu persistieren12,13. Während diese Klone nützlich waren, um die Molekularbiologie der Spirochäte im Labor zu sezieren, sind sie für die Untersuchung der Spirochäte im biologischen Kontext des enzootischen Zyklus von geringem Wert. Infektiöse Isolate mit geringer Passage hingegen verhalten sich physiologisch und spiegeln einen infektiösen Zustand wider und können den Infektionszyklus abschließen, sind aber in der Regel widerspenstig gegenüber der Einführung heterologer DNA und daher für Studie12,13 schwer zu manipulieren. Die Schwierigkeit bei der Umwandlung von Isolaten mit geringer Passage hängt mit mindestens zwei verschiedenen Faktoren zusammen: (i) Isolate mit niedriger Passage verklumpen oft fest, insbesondere unter den für die Elektroporation erforderlichen Bedingungen mit hoher Dichte, wodurch viele Zellen entweder die vollständige Anwendung der elektrischen Ladung oder den Zugang zur DNA in den Medien blockieren13,15; und (ii) B. burgdorferi kodiert mindestens zwei verschiedene plasmidgetragene Restriktionsmodifikationssysteme (R-M), die in Hochpassageisolaten verloren gehen können14,16. R-M-Systeme haben sich entwickelt, damit Bakterien fremde DNA erkennen und eliminieren können17. Tatsächlich haben mehrere Studien an B. burgdorferi gezeigt, dass die Transformationseffizienz zunimmt, wenn die Quelle der DNA B. burgdorferi und nicht Escherichia coli13,16 ist. Leider ist der Erwerb der erforderlichen hohen DNA-Konzentration für die Elektroporation von B. burgdorferi eine teure und zeitaufwendige Angelegenheit. Ein weiteres potenzielles Problem bei der Elektropolierung und Auswahl von Isolaten mit geringer Passage ist, dass der Prozess Transformatoren zu bevorzugen scheint, die das kritische Virulenz-assoziierte Plasmid lp2514,18,19 verloren haben; Daher kann der Akt der genetischen Manipulation von B. burgdorferi-Isolaten mit geringer Passage durch Elektroporation für Klone selektieren, die für eine biologisch relevante Analyse innerhalb des enzootischen Zyklus nicht geeignet sind20. Angesichts dieser Probleme könnte ein System, in dem heterologe DNA elektrotransformiert in B. burgdorferi-Klone mit hoher Passage und dann durch eine andere Methode als die Elektroporation in infektiöse Isolate mit geringer Passage übertragen werden könnte, eine willkommene Ergänzung der wachsenden Sammlung molekularer Werkzeuge sein, die für den Einsatz in der Lyme-Borreliose Spirochäte zur Verfügung stehen.

Neben der Transformation (der Aufnahme nackter DNA) gibt es zwei weitere Mechanismen, durch die Bakterien regelmäßig heterologe DNA aufnehmen: die Konjugation, d.h. der Austausch von DNA zwischen Bakterien in direktem physischen Kontakt miteinander, und die Transduktion, bei der es sich um den Austausch von DNA handelt, der durch einen Bakteriophagen vermitteltwird 21. Tatsächlich wurde die Fähigkeit von Bakteriophagen, HGT zu vermitteln, als experimentelles Werkzeug zur Analyse der molekularen Prozesse in einer Reihe von Bakteriensystemenverwendet 22,23,24. B. burgdorferi ist von Natur aus nicht für die Aufnahme nackter DNA zuständig, und es gibt wenig Hinweise darauf, dass B. burgdorferi den Apparat kodiert, der notwendig ist, um eine erfolgreiche Konjugation zu fördern. Frühere Berichte haben jedoch die Identifizierung und vorläufige Charakterisierung von φBB-1, einem gemäßigten Bakteriophagen von B. burgdorferi25,26,27,28, beschrieben. φBB-1 packt eine Familie von 30 kb Plasmiden, die in B. burgdorferi25 gefunden wurden; Die Mitglieder dieser Familie wurden als CP32S bezeichnet. In Übereinstimmung mit einer Rolle von φBB-1 bei der Teilnahme an HGT unter B. burgdorferi-Stämmen berichteten Stevenson et al. über ein identisches cp32, das in zwei Stämmen mit ansonsten unterschiedlichen cp32s gefunden wurde, was auf eine kürzliche Aufteilung dieses cp32 zwischen diesen beiden Stämmen hindeutet, wahrscheinlich über Transduktion29. Es gibt auch Hinweise auf eine signifikante Rekombination über HGT unter den cp32s in einem ansonsten relativ stabilen Genom30,31,32,33. Schließlich wurde die Fähigkeit von φBB-1, sowohl cp32s als auch heterologe Shuttle-Vektor-DNA zwischen Zellen desselben Stammes und zwischen Zellen zweier verschiedener Stämme zu transduzieren, zuvor nachgewiesen27,28. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde φBB-1 als weiteres Werkzeug vorgeschlagen, das für die Zerlegung der Molekularbiologie von B. burgdorferi entwickelt werden soll.

Das Ziel dieses Berichts ist es, eine Methode zur Induktion und Reinigung von Phage φBB-1 aus B. burgdorferi zu beschreiben sowie ein Protokoll für die Durchführung eines Transduktionstests zwischen B. burgdorferi-Klonen und die Auswahl und das Screening potenzieller Transduktanten bereitzustellen.

Protokoll

Alle Experimente mit rekombinanter DNA und BSL-2-Organismen wurden vom Quinnipiac University Institutional Biosafety Committee überprüft und genehmigt.

1. Aufbereitung der B. burgdorferi-Kultur zur Herstellung von φBB-1

  1. Barbour-Stoenner-Kelly-Medium mit 6,6% hitzeinaktiviertem normalem Kaninchenserum (BSK)15 zubereiten. Für 1 l 1x BSK die in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten in 900 ml Wasser mischen, den pH-Wert mit 1 N Natronlauge auf 7,6 einstellen und bei 4 °C 2-4 h langsam mischen. Nachdem das Mischen abgeschlossen ist, überprüfen und regulieren Sie den pH-Wert bei Bedarf auf 7,6 und erhöhen Sie das Volumen mit Wasser auf 1 L. Sterilisieren Sie das Medium durch einen 0,22-μM-Filter (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie es frisch oder lagern Sie es bei 4 °C für ≤2 Monate.
  2. Impfen Sie drei bis fünf Tage vor Beginn des Transduktionsprotokolls 150 μL des entsprechenden B. burgdorferi-Klons in 15 ml 1x BSK in dicht verschlossenen sterilen konischen Zentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle). Ergänzen Sie das Medium mit der entsprechenden Konzentration von Antibiotika oder einer Kombination von Antibiotika zur Selektion und Erhaltung heterologer DNA innerhalb des/der B. burgdorferi-Klons (Tabelle 2).
    HINWEIS: B. burgdorferi ist ein Organismus der Biosicherheitsstufe 2. Treffen Sie alle geeigneten Vorsichtsmaßnahmen, während Sie mit diesem Organismus arbeiten. Führen Sie alle Arbeiten mit lebenden Kulturen von B. burgdorferi in einer zertifizierten und ordnungsgemäß desinfizierten Biosicherheitswerkbank der Klasse II durch. Entsorgen Sie das gesamte Material, das mit B. burgdorferi und den Organismen selbst in Kontakt kommt, ordnungsgemäß gemäß den CDC-Richtlinien34.
  3. Die Kulturen werden bei 33 °C ohne Schütteln inkubiert, bis die Kulturen eine Dichte von ≥5 × 107 Spirochäten·mL−1 erreicht haben, was etwa 3-5 Tage dauert.

2. Bestimmung der Dichte der B. burgdorferi-Kultur (en) (modifiziert von Samuels)15

  1. Für Dichten, die voraussichtlich über 5 × 106 Zellen·ml−1 liegen, bestimmen Sie die Zelldichte mittels Spektroskopie.
    1. 1 ml Kultur in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben und bei 8.000 x g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
    2. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,8 mM KH2PO4). Die gesamte Zellsuspension in eine semi-mikro-UV-transparente Küvette überführen.
    3. Bestimmung der optischen Dichte der resuspendierten Probe bei einer Wellenlänge von 600 nm (A600). Null das Spektralphotometer (siehe Materialtabelle) gegen PBS.
    4. Um die Konzentration der Spirochäten·mL−1 in der ursprünglichen Kultur zu berechnen, multipliziert man die optische Dichte bei A600 mit 1,4 × 109.
  2. Für Dichten, die voraussichtlich zwischen 5 × 104 Zellen·ml−1 und 5 × 106 Zellen·mL−1 liegen, bestimmen Sie die Zelldichte mit einer Petroff-Hausser-Zählkammer (siehe Materialtabelle), um die Anzahl der Spirochäten direkt zu zählen. Dieses Verfahren kann auch für höhere Dichten nach entsprechender Verdünnung verwendet werden.
    HINWEIS: Die Visualisierung von lebenden Spirochäten erfordert ein mit einem Dunkelfeldkondensator modifiziertes Mikroskop.
    1. 10 μL Probe in die Zählkammer geben und mit geeignetem Deckglas abdecken. Bei Dichten über 1 × 107 wird die Probe in PBS verdünnt, um 50-100 Spirochäten pro Feld zu erhalten.
    2. Zählen Sie die Zellen mit einem Dunkelfeldmikroskop bei einer Vergrößerung von 200x-400x. Zählen Sie das gesamte Feld von 25 Gruppen von 16 kleinen Quadraten in allen Ebenen.
    3. Multiplizieren Sie die gezählte Zahl mit dem Verdünnungsfaktor (falls vorhanden) und 5 × 104 , um Zellen ·mL−1 der ursprünglichen Kultur zu erhalten.

3. Induktion von B. burgdorferi phage φBB-1

HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Glaswaren und Kunststoffwaren durch Autoklavieren; sterilisieren alle Lösungen durch Autoklavieren oder Filtrieren durch einen 0,22 μM-Filter. Die folgenden Schritte basieren auf Volumina von 15 ml, aber die Methode ist je nach den individuellen Anforderungen des Experiments auf kleinere oder größere Volumina skalierbar.

  1. Für die B. burgdorferi-Kultur , aus der Phagen hergestellt werden (der Spender), verwenden Sie die nach einer der Methoden in Schritt 2 berechneten Konzentration, um das Volumen der Starterkultur zu bestimmen, das benötigt wird, um 4 ml 2 × 108 Spirochäten ·mL−1 zu erhalten. Dies ergibt eine Endkonzentration von 5 × 107 Spirochäten·ml−1 in 15 ml während der Erholungsphase (Schritt 3.6 unten).
  2. Zentrifugieren Sie das in Schritt 3.1 berechnete Kulturvolumen bei 6.000 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 4 ml frischem BSK. Übertragen Sie die Probe in das kleinste verfügbare sterile Röhrchen, um die Probe mit minimalem Kopfraum aufzunehmen.
  3. Die entsprechende Menge des induzierenden Mittels wird der empfohlenen Konzentration (Tabelle 3) basierend auf einem Kulturvolumen von 4 ml zugesetzt, um die Phagenproduktion zu induzieren. Verschließen Sie das Röhrchen fest und mischen Sie es gründlich.
  4. Die Probe wird bei 33 °C für 2-4 h inkubiert.
  5. Nach der Inkubation wird die Probe in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Probe bei 6.000 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand.
  6. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 15 ml 1x BSK.
    HINWEIS: Nach der Induktion des Phagens gibt es zwei verschiedene Möglichkeiten, mit dem Transduktionstest fortzufahren. Diese Methoden sind in Abbildung 1 sowie in Schritt 4 und Schritt 6 dargestellt.

4. Transduktion während der Kokultur nach Exposition des Spenders gegenüber dem induzierenden Wirkstoff (Abbildung 1A)

HINWEIS: Dieses Protokoll kann nur verwendet werden, wenn der Phagen-produzierende Stamm (Spender) eine Resistenz gegen ein bestimmtes Antibiotikum aufweist und der zu übertragende Stamm (Empfänger) eine Resistenz gegen ein anderes Antibiotikum aufweist.

  1. Bereiten Sie eine B. burgdorferi-Kultur vor, die als Empfänger in Transduktionsassays verwendet wird, wie für den Spenderstamm in Schritt 1 oben beschrieben. Berechnen Sie basierend auf der gemäß Schritt 2 bestimmten Dichte das Volumen, das benötigt wird, um 15 ml von 1 × 107 Spirochäten·mL−1 zu erhalten.
  2. Zentrifugieren Sie das in Schritt 4.1 berechnete Kulturvolumen bei 6.000 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand.
  3. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Kultur aus Schritt 3.6 (resuspendierter Phagenspender). Fügen Sie den resuspendierten Empfänger wieder in die Kultur mit dem Spender ein. Nicht mit Antibiotika ergänzen. Das Gesamtvolumen, das beide Kulturen enthält, beträgt 15 ml.
  4. Bei 33 °C 72-96 h inkubieren.
  5. Führen Sie die Auswahl der Transduktanten durch Festphasenbeschichtung nach der Kokultur durch, wie in Schritt 7 beschrieben.

5. Fällung von Polyethylenglykol (PEG) zur Gewinnung von Phagen zur Verwendung im Transduktionstest

HINWEIS: Dieses Protokoll kann in Fällen verwendet werden, in denen der Phagen-produzierende Stamm (Spender) eine Resistenz gegen ein bestimmtes Antibiotikum aufweist und der zu übertragende Stamm (Empfänger) entweder keine Antibiotikaresistenz oder eine Resistenz gegen ein anderes Antibiotikum aufweist.

  1. Ergänzen Sie die Kultur aus Schritt 3.6 mit dem entsprechenden Antibiotikum in der in Tabelle 2 angegebenen Konzentration. Die Probe wird bei 33 °C für 72-96 h inkubiert.
  2. Bereiten Sie Lösungen für die PEG-Fällung vor.
    1. Bereiten Sie 500 ml 5 M NaCl vor. Durch Autoklavieren sterilisieren und vor Gebrauch abkühlen lassen. Bei Raumtemperatur lagern.
    2. Bereiten Sie 500 ml 40% PEG vor, indem Sie 200 g PEG8000 in 400 ml Wasser auflösen; Unter Rühren vorsichtig erhitzen, bis die Lösung gut durchmischt ist. Bringen Sie das Volumen mit Wasser auf 500 ml. Um das PEG8000 vollständig aufzulösen und die Lösung zu sterilisieren, autoklavieren Sie die Lösung und kühlen Sie sie vor Gebrauch ab. Bei Raumtemperatur lagern.
    3. Bereiten Sie 100 ml Suspensionsmedium vor (SM; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4 und 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]). Durch Autoklavieren sterilisieren. Bei 4 °C lagern.
  3. Für die PEG-Fällung von Phagen aus dem Spender-B. burgdorferi-Klon (aus Schritt 3.6) zentrifugieren Sie die Proben nach 72-96 h Inkubation bei 8.000 x g für 20 min bei 4 °C.
  4. Dekantieren Sie den Überstand in ein sauberes 50 ml konisches Rohr; Entsorgen Sie das Zellpellet. 5 M NaCl zu einer Endkonzentration von 1 M hinzufügen. Bei Raumtemperatur 1 h schonend schaukeln.
  5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 8.000 x g für 10 min bei 4 °C. Dekantieren Sie den Überstand in ein sauberes 50 ml konisches Rohr; Das Pellet kann klein sein oder fehlen. 40% PEG8000-Lösung in den Überstand zu einer Endkonzentration von 10% geben. Gut mischen und länger als 1 Stunde bis über Nacht auf Eis legen.
    HINWEIS: Längere Zeiten scheinen nicht mit einer signifikant erhöhten Phagenerholung zu korrelieren.
  6. Zentrifugieren Sie die Proben bei 8.000 x g für 20 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand und entfernen Sie so viel überschüssige Flüssigkeit wie möglich, ohne ein Pellet zu verlieren, das die Phagenpartikel enthält.
  7. Resuspendieren Sie das Pellet in einem minimalen Volumen von SM, verwenden Sie das SM, um die Seite der Flasche abzuwaschen und mögliche Phagenpartikel zu sammeln. Das empfohlene Verhältnis beträgt 400 μL SM pro 10 ml ursprünglichen Überstand, aber je nach Größe des Pellets kann mehr oder weniger SM für eine vollständige Resuspension erforderlich sein.
  8. Behandeln Sie die gewonnene Phagenprobe mit einem gleichen Volumen Chloroform, basierend auf dem Volumen der Resuspension. Die Probe gut mischen und dann bei 8.000 x g für 10 min zentrifugieren. Entfernen Sie die wässrige (obere) Schicht in ein sauberes Röhrchen und vermeiden Sie die dicke Grenzflächenschicht.
    HINWEIS: φBB-1 ist ein unbehüllter Bakteriophagen und nicht anfällig für eine Chloroformbehandlung25. Dieser Schritt wird durchgeführt, um membrangebundene Strukturen (d. H. Zellen oder Bläschen) weiter zu stören und potenzielle zelluläre Verunreinigungen abzutöten. Chloroform ist ein flüchtiger organischer Stoff und darf nur in einem gut belüfteten Abzug verwendet werden; chloroformhaltiges Material als organischen Abfall entsorgen.
  9. Bestimmen Sie das nach der ersten Chloroformbehandlung gewonnene Volumen und behandeln Sie die Probe erneut mit einer Menge Chloroform, die 10% dieses Volumens entspricht. Gut mischen und bei 8.000 x g 10 min zentrifugieren. Entfernen Sie die wässrige (obere) Schicht und achten Sie darauf, die Grenzfläche oder organische Schicht zu vermeiden. Die wässrige Schicht in ein sauberes Röhrchen geben.
  10. Verwenden Sie den Phagen sofort (wie in Schritt 6 beschrieben) oder lagern Sie ihn bei 4 °C.
    HINWEIS: Das Einfrieren von φBB-1-Phagenproben wird nicht empfohlen. Obwohl die Stabilität von φBB-1 bei 4 °C nicht gründlich untersucht wurde, wurden Proben, die bis zu 1 Monat nach der Wiederfindung bei 4 °C gelagert wurden, erfolgreich in Transduktionsassays verwendet.

6. Transduktionsassay nach PEG-Fällung von φBB-1 (Abbildung 1B)

  1. Bereiten Sie B. burgdorferi-Kulturen vor, die als Empfänger in Transduktionsassays verwendet werden sollen, wie für den Spenderstamm in Schritt 1 oben beschrieben. Basierend auf der gemäß Schritt 2 bestimmten Dichte wird das Kulturvolumen des Empfängers berechnet, das benötigt wird, um 15 ml 1 × 107 Spirochäten·mL−1 zu erhalten.
  2. Zentrifugieren Sie das in Schritt 6.1 berechnete Kulturvolumen bei 6.000 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 14,5 ml frischem BSK.
  3. Geben Sie ≤500 μL PEG-gefällte Phagenprobe (aus Schritt 5) in die Kultur des Empfängerklons. Gut mischen und bei 33 °C 72-96 h inkubieren.
    HINWEIS: Die Menge an Phagen, die während der PEG-Fällung gewonnen wird, kann abhängig von einer Reihe von Faktoren variabel sein. Aus der 15-ml-Kultur des induzierten B. burgdorferi-Stammes CA-11.2A enthalten 500 μL jedoch typischerweise 50-1.000 lebensfähigePhagen-28. Volumina der Phagengewinnung ≥500 μL beeinträchtigen das Wachstum von B. burgdorferi , wahrscheinlich aufgrund des erhöhten Verhältnisses von SM zu BSK.
  4. Die Auswahl der Transduktanten erfolgt durch Festphasenbeschichtung nach Mischen mit PEG-gefälltem Phagen, wie in Schritt 7 beschrieben.

7. Auswahl der Transduktanten

HINWEIS: Die Festphasenbeschichtung potenzieller Transduktanten erfolgt unter Verwendung einer einschichtigen Modifikation des erstmals in Samuels15 beschriebenen Protokolls. B. burgdorferi-Kolonien wachsen innerhalb des Agars, so dass für die Auswahl von Transduktanten durch Festphasenbeschichtung die Proben dem Medium zugesetzt werden müssen, während die Platten gegossen werden. Ein alternatives Verfahren zur Auswahl von Transformatoren unter Verwendung eines Verdünnungsverfahrens in 96-Well-Platten wurde ebenfalls zuvorbeschrieben 35. Diese Technik könnte auch für die Auswahl von Transduktanten wirksam sein, wurde aber zu diesem Zweck noch nicht ausprobiert.

  1. Bestimmen Sie die Anzahl der Platten, die für die Auswahl der Transduktanten benötigt werden, basierend auf der Anzahl der Proben aus den Transduktionsassays und Kontrollen, die beschichtet werden sollen.
    HINWEIS: Typischerweise werden zwei Platten pro Probe gegossen, eine entspricht etwa 10% des Kulturvolumens und eine, die den Rest der Kultur enthält. Gießen Sie zusätzlich Platten, die als Negativkontrollen dienen, um einzeln zu testen, ob das Phagenpräparat und / oder die Elternklone, die als Spender und Empfänger verwendet werden, nicht in Gegenwart des bei der Auswahl verwendeten Antibiotikums wachsen. Es wird auch empfohlen, Beschichtungsmaterial für mindestens zwei zusätzliche Platten vorzubereiten. Wenn beispielsweise die Anzahl der zu plattierenden Proben und Kontrollen acht beträgt, bereiten Sie genügend Beschichtungsmischung für 10 Platten vor.
  2. Bereiten Sie Lösungen für die Beschichtung wie unten beschrieben vor.
    HINWEIS: Jede Platte besteht aus 30 ml, bestehend aus 20 ml 1,5x BSK für die Beschichtung und 10 ml 2,1% Agarose (Verhältnis 2: 1). Dies ergibt eine Platte mit Endkonzentrationen von 1x BSK und 0,7% Agarose. Bereiten Sie beispielsweise für 10 Platten eine Gesamtbeschichtungsmischung von 300 ml vor, bestehend aus 200 mL 1,5x BSK und 100 ml 2,1% Agarose.
    1. Bereiten Sie 1 l 1,5x BSK vor, wie für 1x BSK in Schritt 1.1 beschrieben, wobei die Mengen jeder Komponente verwendet werden, die in Tabelle 1 für 1,5x BSK aufgeführt sind. Wie beschrieben für 1x BSK lagern.
    2. 2,1% Agarose in Wasser und Autoklav zubereiten. Verwenden Sie die Agaroselösung frisch oder lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Bei Lagerung bei Raumtemperatur mit lockerem Deckel in die Mikrowelle eintauchen, bis er vor der Beschichtung vollständig geschmolzen ist.
    3. Bestimmen Sie das Volumen des Antibiotikums/der Antibiotika, das erforderlich ist, um die geeignete Konzentration (Tabelle 2) auf der Grundlage der gesamten Beschichtungsmischung zu erreichen.
      HINWEIS: Wenn das Gesamtvolumen der endgültigen Beschichtungslösung 300 ml beträgt, mischen Sie 200 ml 1,5x BSK und genügend Antibiotikum, um sicherzustellen, dass die gesamten 300 ml die richtige endgültige Antibiotikakonzentration aufweisen. Wenn sowohl der Spender als auch der Empfänger im Transduktionstest unterschiedliche Antibiotikaresistenzgene aufweisen, sollte die Plattierungsmischung beide Antibiotika enthalten. Wenn der PEG-präzipitierte Phage des Spenders (wie in Schritt 5 hergestellt) einen Antibiotikaresistenzmarker kodiert und der Empfänger keinen hat, sollte die Beschichtungsmischung nur das eine Antibiotikum enthalten.
  3. Basierend auf der Anzahl der zu gießenden Platten wird die entsprechende Menge von 1,5x BSK und Antibiotikum in eine sterile Flasche gegeben, die groß genug ist, um die gesamte Galvanikmischung aufzunehmen. Im Wasserbad bei 56 °C für ≥15 min ausgleichen.
  4. Geschmolzene Agarose aus dem Autoklaven oder der Mikrowelle in einem 56 °C warmen Wasserbad für ≥15 min ausgleichen.
  5. Nach der Equilibrierung die ermittelte Menge von 2,1% Agarose mit dem 1,5x BSK (mit Antibiotikum) in die Flasche geben und die Galvanisierungslösung wieder für 10-15 min bei 42 °C in das Wasserbad geben.
    HINWEIS: Höhere Temperaturen können die Spirochäten beschädigen oder töten36. Wenn Sie das gleiche Wasserbad wie oben verwenden, kühlen Sie das Wasserbad auf 42-45 °C ab, bevor Sie den Timer für den Ausgleich starten. Lassen Sie die Beschichtungslösung nicht länger als 20 min bei 42 °C im Gleichgewicht sein, da sie sonst beim Gießen der Platten zu erstarren beginnt.
  6. Während der Equilibrierung bereiten Sie die B. burgdorferi-Proben für die Beschichtung vor. Die zu plattierende Menge wird in ein steriles 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen überführt (siehe Materialtabelle).
    1. Wenn Sie eine Menge von weniger als 1,5 ml (<5% des endgültigen 30-ml-Plattenvolumens) plattieren, geben Sie die Probe in das neue Röhrchen und fügen Sie die Beschichtungsmischung während der Beschichtung direkt zur Probe hinzu.
    2. Bei größeren Volumina das gewünschte Kulturvolumen in das neue Röhrchen überführen und dann bei 6.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Dekantieren Sie alle bis auf 100-500 μL des Überstands und verwenden Sie den Rest, um das Pellet vor der Beschichtung vollständig zu resuspendieren.
    3. Für Kontrollplatten nach Kokultur ≥107 Zellen der Spender- oder Empfängerklone in sterile 50-ml-konische Zentrifugenröhrchen geben. Wenn das Volumen mehr als 1,5 ml beträgt, zentrifugieren und resuspendieren Sie das Pellet wie in Schritt 7.6.2. Wenn ein Transduktionsassay mit dem PEG-präzipitierten Phagen durchgeführt wurde, fügen Sie zusätzlich zum Empfängerklon 100-250 μL der Phagenprobe zur Beschichtung in ein steriles 50-ml-konisches Röhrchen ein.
  7. Nachdem die Beschichtungslösung 10-15 min bei 42-45 °C ausgeglichen ist, werden 30 mL der Beschichtungslösung in ein Röhrchen mit der entsprechenden Probe überführt. Geben Sie sofort die Beschichtungsmischung und die Probe in eine beschriftete Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer frischen Pipette für jede zu beschichtende Probe.
  8. Lassen Sie die Platten 15-20 min erstarren und legen Sie sie dann in einen 33 °C Inkubator, der mit 5% CO2 ergänzt wird. Drehen Sie die Platten mindestens 48 Stunden nach dem Eingießen nicht um.
  9. Überprüfen Sie je nach Hintergrund des Empfängerklons, ob die Kolonien innerhalb der Agarose nach 10-21 Tagen Inkubation auf den Selektionsplatten erscheinen. Wählen Sie mindestens 5-10 Kolonien aus, die in Gegenwart beider Antibiotika mit einer sterilisierten Baumwollpipette 5,75 in Borosilikatpipette auf dem Teller wachsen (siehe Materialtabelle) und impfen Sie sie in 1,5 ml 1x BSK mit dem entsprechenden Antibiotikum.
  10. Wachsen Sie die beimpften Kolonien bei 33 °C wie in Schritt 1.3 für 3-5 Tage oder bis sie eine Dichte von ca. 20-40 Spirochäten pro Feld bei 200-facher Vergrößerung mittels Dunkelfeldmikroskopie erreichen.
    HINWEIS: Nach dem Screening (siehe Schritt 8) können die Spirochäten für die Langzeitlagerung bei −80 °C eingefroren werden, indem ein gleiches Kulturvolumen mit einer Mischung aus 60% Glycerin und 40% 1x BSK gemischt wird, die durch Filtration durch einen 0,22 μm-Filter sterilisiert wird.

8. Überprüfung potenzieller Transduktanten

HINWEIS: Untersuchen Sie die Klone, die in Gegenwart von zwei Antibiotika auf Platten wachsen, um sicherzustellen, dass sie echte Transduktanten im erwarteten (Empfänger-) Hintergrund darstellen. Diese Methoden basieren auf der Amplifikation und möglichen Sequenzierung bestimmter Regionen durch die Polymerase-Kettenreaktion. Detaillierte Protokolle und Praktiken zur Durchführung der PCR bei B. burgdorferi werden an anderer Stelle beschrieben (für ein aktuelles Beispiel siehe Seshu et al.37). Wählen Sie die für das Screening der Transduktanten verwendeten Primer basierend auf den verwendeten Stämmen aus. Im Folgenden werden einige Vorschläge zum Screening der Transduktanten beschrieben.

  1. B. burgdorferi-Lysate für das PCR-Screening vorbereiten.
    HINWEIS: Das folgende Protokoll wird verwendet, um gewaschene B. burgdorferi-Lysate aus kultivierten Zellen herzustellen, die gemäß Schritt 7.9 zur sofortigen Analyse der DNA mittels PCR gezüchtet wurden. Diese Methode wurde entwickelt, um die Interferenz potenzieller Inhibitoren in BSK zu minimieren, wird jedoch nicht für die Herstellung hochwertiger DNA für die Sequenzierung oder Speicherung empfohlen. Verwenden Sie zu diesem Zweck ein Protokoll oder Kit für die Extraktion des gesamten Genoms (siehe Materialtabelle). Es wird dringend empfohlen, Lysate aus den Elternklonen (sowohl Spender- als auch Empfängerstämme) gleichzeitig vorzubereiten, um sie in jede Analyse einzubeziehen.
    1. 500 μL jedes ausgewählten und kultivierten potentiellen Transduktmittels wie in Schritt 7.10 in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
    2. Zentrifugieren Sie die Kulturen für 10 min bei 8.000 x g bei Raumtemperatur.
    3. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in 500 μL TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). 5 min bei 8.000 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
    4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie jedes Pellet in 50 μL Wasser in PCR-Qualität. Kochen Sie die Proben für 10 min. Lassen Sie sie kurz abkühlen und zentrifugieren Sie sie dann bei 8.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur.
    5. Verwenden Sie für jede PCR sofort 2 μL von der Oberseite der zentrifugierten Probe; Vermeiden Sie es, das Pellet zu stören.
  2. Screenen Sie die potenziellen Transduktanten auf die spezifischen Gene, die für Antibiotikaresistenz kodieren, mittels PCR. In Tabelle 4 finden Sie die Primer für das Screening von Antibiotikaresistenzmarkern, die üblicherweise in Transduktionsassays verwendet werden.
    HINWEIS: Obwohl nach unserer Erfahrung selten, kann eine spontane Mutation der Aminoglykosid-Antibiotika auftreten, die für die Selektion heterologer DNA in B. burgdorferi verwendet werden.
  3. Screenen Sie die potenziellen Transduktanten auch mit einem anderen Stamm- oder Klonmarker, um zu bestätigen, dass der Hintergrund der des Empfängers ist. Beziehen Sie sowohl die Spender- als auch die Empfänger-Elternklone in diese Analysen ein. Screening auf stammspezifische Marker unter Verwendung von Sequenzen basierend auf den verwendeten Stämmen und individuellen Laborprotokollen zur Bestimmung der Stammintegrität.
  4. Wenn Sie versuchen, in virulente Klone zur Verwendung innerhalb des Zeckenvektors oder Säugetierwirts oder zum direkten Vergleich mit einem anderen Klon zu transduzieren, bestimmen Sie den vollständigen Plasmidgehalt der Transduktanten und der Elternklone. Dies geschieht, um den gleichen Plasmidgehalt wie der Vergleichsstamm oder das Vorhandensein der genetischen Elemente sicherzustellen, die für die Vermehrung innerhalb des enzootischen Zyklus notwendig sind, wie an anderer Stelle 18,19,37,38,39 beschrieben.

Ergebnisse

Die Verwendung von Bakteriophagen zum Transport von DNA zwischen leichter transformierbaren B. burgdorferi-Stämmen oder Klonen, die der Elektrotransformation widerspenstig sind, stellt ein weiteres Werkzeug für die weitere molekulare Untersuchung der Determinanten der Lyme-Borreliose dar. Der hierin beschriebene Transduktionsassay kann nach Bedarf modifiziert werden, um die Bewegung von DNA zwischen beliebigen Klonen von Interesse zu erleichtern, wobei entweder ein oder zwei Antibiotika für die Auswahl potenz...

Diskussion

Die Verwendung der Transduktion könnte eine Methode darstellen, um zumindest einige der biologischen und technischen Barrieren zu überwinden, die mit der Elektrotransformation von B. burgdorferi 1,4,13,37 verbunden sind. In vielen Systemen können Bakteriophagen Wirts-DNA (Nicht-Prophage) zwischen Bakterienzellen durch generalisierte oder spezialisierte Transduktion bewegen 22,23,24,...

Offenlegungen

Der Autor hat nichts offenzulegen.

Danksagungen

Der Autor dankt Shawna Reed, D. Scott Samuels und Patrick Secor für ihre nützliche Diskussion und Vareeon (Pam) Chonweerawong für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das Department of Biomedical Sciences und Forschungsstipendien der Fakultät an Christian H. Eggers von der School of Health Sciences der Quinnipiac University unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)Millipore SigmaS2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)USA Scientific1450-0810holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)Millipore SigmaCAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)Thermo Fisher Scientific13-678-8Aautoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LEDot Scientific inc.AGLE-500
Bacto NeopeptoneGibcoDF0119-17-9
Bacto TC YeastolateGibco255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)Gemini Bio-Products700-104P
Chloroform (for molecular biology)Thermo Fisher ScientificBP1145-1CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)US BiologicalC5900-01cell culture grade
ErythromycinResearch Products International CorpE57000-25.0
Gentamicin reagent solutionGibco15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)Thermo Fisher ScientificBP350-500
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-500
Kanamycin sulfateThermo Fisher Scientific25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)Millipore SigmaSLGSM33SSto filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin CThermo Fisher ScientificBP25312CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamineMP Biomedicals, LLC100068
Oligonucleotides (primers for PCR)IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)G Biosciences786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)Thermo Fisher ScientificFB0875712
Petroff-Hausser counting chamberHausser scientificHS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glassHausser scientificHS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)Thermo Fisher ScientificBP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)Pel-Freez Biologicals31119-3heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettesUSA Scientific9750-9150
Sodium bicarbonateThermo Fisher ScientificBP328-500
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificBP358-1
Sodium pyruvateMillipore SigmaP8674-25G
Spectronic Genesys 5Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solutionMillipore SigmaS6501-50G
Trisodium citrate dihydrateMillipore SigmaS1804-500Gsodium citrate for BSK

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