АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Способность бактериофага перемещать ДНК между бактериальными клетками делает их эффективными инструментами для генетических манипуляций с их бактериальными хозяевами. Здесь представлена методология индуцирования, восстановления и использования φBB-1, бактериофага Borrelia burgdorferi, для трансдукции гетерологичной ДНК между различными штаммами спирохеты болезни Лайма.

Аннотация

Введение чужеродной ДНК в спирохету Borrelia burgdorferi было почти исключительно осуществлено путем трансформации с использованием электропорации. Этот процесс имеет заметно более низкую эффективность спирохеты болезни Лайма по сравнению с другими, лучше охарактеризованными грамотрицательными бактериями. Скорость успеха трансформации в значительной степени зависит от наличия концентрированных количеств высококачественной ДНК из определенных фонов и подвержена значительной изменчивости от штамма к штамму. Альтернативные средства для введения чужеродной ДНК (т.е. челночных векторов, флуоресцентных репортеров и маркеров устойчивости к антибиотикам) в B. burgdorferi могут стать важным дополнением к арсеналу полезных инструментов для генетической манипуляции спирохетой болезни Лайма. Бактериофаги были хорошо известны как естественные механизмы движения ДНК среди бактерий в процессе, называемом трансдукцией. В этом исследовании был разработан метод использования вездесущего боррелиального фага φBB-1 для трансдукции ДНК между клетками B. burgdorferi как одного, так и разного генетического происхождения. Трансдуцированная ДНК включает в себя как боррелиальную ДНК, так и гетерологичную ДНК в виде небольших челночных векторов. Эта демонстрация предполагает потенциальное использование фаговой трансдукции в качестве дополнения к электропорации для генетических манипуляций со спирохетой болезни Лайма. В настоящем отчете описываются методы индукции и очистки фага φBB-1 от B. burgdorferi, использование этого фага в анализах трансдукции, а также отбор и скрининг потенциальных трансдуктантов.

Введение

Разработка инструментов для генетической манипуляции спирохетальной бактерией Borrelia burgdorferi добавила неизмеримую ценность пониманию природы болезни Лайма 1,2,3,4. B. burgdorferi имеет необычно сложный геном, состоящий из небольшой линейной хромосомы и как линейных, так и круговых плазмид 5,6. Спонтанная потеря плазмид, внутригенная перестройка (перемещение генов из одной плазмиды в другую в пределах одного организма) и горизонтальный перенос генов (HGT, движение ДНК между двумя организмами) привели к головокружительному количеству генетической гетерогенности среди B. burgdorferi (например, см. Schutzer et al.7). Полученные генотипы (или «штаммы») являются членами одного и того же вида, но имеют генетические различия, которые влияют на их способность передавать и заражать разных хозяев млекопитающих 8,9,10,11. В настоящем докладе термин «штамм» будет использоваться для обозначения B. burgdorferi с особым естественным генетическим фоном; термин «клон» будет использоваться для обозначения штамма, который был генетически модифицирован для определенной цели или в результате экспериментальных манипуляций.

Молекулярный набор инструментов, доступный для использования у B. burgdorferi, включает выбираемые маркеры, генные репортеры, векторы челноков, транспозонный мутагенез, индуцируемые промоторы и контризбираемые маркеры (для обзора см. Drektrah and Samuels12). Эффективное использование этих методологий требует искусственного введения гетерологичной (чужеродной) ДНК в интересующий штамм B. burgdorferi. У B. burgdorferi введение гетерологичной ДНК достигается почти исключительно с помощью электропорации, метода, который использует импульс электричества, чтобы сделать бактериальную мембрану временно проницаемой для небольших кусочков ДНК, введенных в среду1. Большинство клеток (по оценкам, ≥99,5%) погибают от пульса, но остальные клетки имеют высокую частоту удержания гетерологичной ДНК13. Хотя это считается одним из наиболее высокоэффективных методов введения ДНК в бактерии, частота электропорации в B. burgdorferi очень низкая (в пределах от 1 трансформанта в 5 × 104 до 5 × 106 клеток)13. Барьеры для достижения более высоких частот трансформации, по-видимому, являются как техническими, так и биологическими. Технические барьеры для успешной электропорации B. burgdorferi включают как необходимое количество ДНК (>10 мкг), так и требование к спирохетам находиться именно в правильной фазе роста (средняя бревна, от 2 × 107 клеток·мл−1 до 7 × 107 клеток·мл−1) при получении электрокомпетентных ячеек12,13. Однако эти технические барьеры может быть легче преодолеть, чем биологические барьеры.

Исследователи болезни Лайма признают, что клоны B. burgdorferi можно разделить на две широкие категории в отношении их способности к генетическому манипулированию13,14. Высокопроходимые, адаптированные к лабораторным исследованиям изоляты часто легко трансформируются, но обычно теряют плазмиды, необходимые для инфекционности, ведут себя физиологически аберрантно и не способны заражать хозяина млекопитающих или сохраняться в клещевом векторе12,13. Хотя эти клоны были полезны для препарирования молекулярной биологии спирохеты в лаборатории, они не имеют большой ценности для изучения спирохеты в биологическом контексте энзоотического цикла. С другой стороны, низкопроходимые инфекционные изоляты ведут себя физиологически, отражая инфекционное состояние, и могут завершать инфекционный цикл, но обычно непокорны к введению гетерологичной ДНК и, следовательно, трудно манипулировать для исследования12,13. Трудность преобразования изолятов низкого прохода связана, по меньшей мере, с двумя различными факторами: (i) изоляты низкого прохода часто плотно слипаются вместе, особенно в условиях высокой плотности, необходимых для электропорации, тем самым блокируя многие клетки либо от полного применения электрического заряда, либо от доступа к ДНК в среде13,15; и ii) B. burgdorferi кодирует по меньшей мере две различные плазмидные системы рестрикции-модификации (R-M), которые могут быть потеряны в изолятах с высоким проходом14,16. Системы R-M эволюционировали, чтобы позволить бактериям распознавать и устранять чужеродную ДНК17. Действительно, несколько исследований b. burgdorferi показали, что эффективность трансформации увеличивается, когда источником ДНК является B. burgdorferi, а не Escherichia coli13,16. К сожалению, приобретение необходимой высокой концентрации ДНК для электропорации у B. burgdorferi является дорогостоящей и трудоемкой перспективой. Другая потенциальная проблема при электропорации и выборе изолятов низкого прохода заключается в том, что процесс, по-видимому, благоприятствует трансформантам, которые потеряли критическую плазмиду, связанную с вирулентностью, lp25 14,18,19; таким образом, сам акт генетического манипулирования низкопроходными изолятами B. burgdorferi посредством электропорации может отбирать клоны, которые не подходят для биологически значимого анализа в энзоотическом цикле20. Учитывая эти проблемы, система, в которой гетерологичная ДНК может быть электротрансформирована в высокопроходные клоны B. burgdorferi, а затем перенесена в инфекционные изоляты низкого прохода методом, отличным от электропорации, может быть желанным дополнением к растущей коллекции молекулярных инструментов, доступных для использования в спирохете болезни Лайма.

Помимо трансформации (поглощения голой ДНК), существуют два других механизма, с помощью которых бактерии регулярно поглощают гетерологичную ДНК: конъюгация, которая представляет собой обмен ДНК между бактериями, находящимися в прямом физическом контакте друг с другом, и трансдукция, которая представляет собой обмен ДНК, опосредованный бактериофагом21. Действительно, способность бактериофага опосредуть HGT была использована в качестве экспериментального инструмента для препарирования молекулярных процессов в ряде бактериальных систем 22,23,24. B. burgdorferi от природы не компетентен для поглощения голой ДНК, и существует мало доказательств того, что B. burgdorferi кодирует аппарат, необходимый для успешного спряжения. Однако в предыдущих докладах описывалась идентификация и предварительная характеристика φBB-1, умеренного бактериофага B. burgdorferi 25,26,27,28. φBB-1 упаковывает семейство плазмид размером 30 кб, обнаруженных в B. burgdorferi25; члены этого семейства были обозначены cp32s. В соответствии с ролью φBB-1 в участии в HGT среди штаммов B. burgdorferi, Stevenson et al. сообщили об идентичном cp32, обнаруженном в двух штаммах с разрозненными cp32s, предполагая недавнее разделение этого cp32 между этими двумя штаммами, вероятно, через трансдукцию29. Есть также доказательства значительной рекомбинации через HGT среди cp32s в относительно стабильном геноме 30,31,32,33. Наконец, способность φBB-1 трансдуцировать как cp32s, так и гетерологичную челночную векторную ДНК между клетками одного и того же штамма и между клетками двух разных штаммов была продемонстрирована ранее27,28. Учитывая эти результаты, φBB-1 был предложен в качестве еще одного инструмента, который будет разработан для вскрытия молекулярной биологии B. burgdorferi.

Целью настоящего доклада является детализация метода индуцирования и очистки фага φBB-1 от B. burgdorferi, а также предоставление протокола для выполнения трансдукционного анализа между клонами B. burgdorferi и отбора и скрининга потенциальных трансдуктантов.

протокол

Все эксперименты с использованием рекомбинантной ДНК и организмов BSL-2 были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по биобезопасности Университета Куиннипиак.

1. Подготовка культуры Б. бургдорфери для получения φBB-1

  1. Приготовить среду Барбура-Стеннера-Келли с добавлением 6,6% инактивированной теплом нормальной кроличьей сыворотки (BSK)15. Для 1 л 1x BSK смешайте компоненты, перечисленные в таблице 1 , в 900 мл воды, отрегулируйте рН до 7,6, используя 1 N гидроксида натрия, и медленно перемешайте при 4 °C в течение 2-4 ч. После завершения перемешивания проверьте и при необходимости перенастройте рН до 7,6, а затем увеличьте объем до 1 л водой. Стерилизуют среду, проходя через фильтр 0,22 мкМ (см. Таблицу материалов), и используют в свежем виде или хранят при температуре 4 °C в течение ≤2 месяцев.
  2. За три-пять дней до начала протокола трансдукции инокулируют 150 мкл соответствующего клона (клонов) B. burgdorferi в 15 мл 1x BSK в плотно закрытых стерильных конических центрифужных трубках (см. Таблицу материалов). Дополнить среду соответствующей концентрацией антибиотиков или комбинацией антибиотиков для отбора и поддержания гетерологичной ДНК в клоне () B. burgdorferi (таблица 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: B. burgdorferi является организмом уровня биобезопасности 2. Принимайте все соответствующие меры предосторожности при работе с этим организмом. Выполняйте все работы с живыми культурами B. burgdorferi в сертифицированном и надлежащим образом продезинфицированном шкафу биобезопасности II класса. Правильно утилизируйте весь материал, который контактирует с B. burgdorferi и самими организмами на основе рекомендаций CDC34.
  3. Инкубируют культуры при 33 °C без встряхивания до тех пор, пока культуры не достигнут плотности ≥5 × 107 спирохет·мл−1, что занимает примерно 3-5 дней.

2. Определите плотность культуры (культур) B. burgdorferi (модифицированной от Samuels)15

  1. Для плотностей, которые, как ожидается, будут выше 5 × 106 клеток·мл−1, определите плотность клеток с помощью спектроскопии.
    1. Переложить 1 мл культуры в микроцентрифужную трубку и центрифугу объемом 1,7 мл при 8 000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS; 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2PO4). Перенесите всю клеточную суспензию в полумикро-УФ-прозрачную кювету.
    3. Определить оптическую плотность повторно суспендированного образца на длине волны 600 нм (A600). Обнулите спектрофотометр (см. Таблицу материалов) по отношению к PBS.
    4. Чтобы рассчитать концентрацию спирохет·мл−1 в исходной культуре, умножьте оптическую плотность при А600 на 1,4 × 109.
  2. Для плотностей, которые, как ожидается, будут между 5 × 104 ячейками·мл−1 и 5 × 106 клетками·мл−1, определите плотность клеток с помощью счетной камеры Петроффа-Хауссера (см. Таблицу материалов) для непосредственного подсчета количества спирохет. Этот метод также может быть использован для более высоких плотностей после соответствующего разбавления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации живых спирохет требуется микроскоп, модифицированный конденсатором темного поля.
    1. Нанесите 10 мкл образца на счетную камеру и накройте соответствующим покровным стеклом. Для плотностей выше 1 × 107 разбавьте образец в PBS до получения 50-100 спирохет на поле.
    2. Подсчитывайте клетки с помощью микроскопа темного поля с увеличением 200x-400x. Подсчитайте все поле из 25 групп по 16 маленьких квадратов во всех плоскостях.
    3. Умножьте число, подсчитанное на коэффициент разбавления (если таковой имеется) и 5 × 104 , чтобы получить клетки·мл−1 исходной культуры.

3. Индукция фага Б. бургдорфери φBB-1

ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте всю стеклянную и пластиковую посуду путем автоклавирования; стерилизуют все растворы путем автоклавирования или фильтрации через фильтр 0,22 мкМ. Приведенные ниже шаги представлены на основе объемов 15 мл, но метод масштабируется до меньших или больших объемов в зависимости от индивидуальных потребностей эксперимента.

  1. Для культуры B. burgdorferi , из которой будет получен фаг (донор), используйте концентрацию, рассчитанную любым методом на этапе 2, чтобы определить объем закваски, необходимый для получения 4 мл 2 × 108 спирохет·мл-1. Это даст конечную концентрацию 5 × 107 спирохет·мл−1 в 15 мл на стадии восстановления (стадия 3.6 ниже).
  2. Центрифугу объема культуры рассчитывают на стадии 3.1 при 6000 х г в течение 10 мин. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 4 мл свежего BSK. Перенесите образец в самую маленькую стерильную трубку, доступную для хранения образца с минимальным пространством головки.
  3. Добавьте соответствующее количество индуцирующего агента к рекомендуемой концентрации (таблица 3) на основе объема культуры 4 мл, чтобы индуцировать производство фагов. Плотно закройте тюбик и тщательно перемешайте.
  4. Инкубировать образец при 33 °C в течение 2-4 ч.
  5. После инкубации перенесите образец в центрифужную трубку объемом 15 мл. Центрифугирование образца при 6 000 х г в течение 10 мин. Декант супернатанта.
  6. Повторное суспендирование ячейки гранулы в 15 мл 1x BSK.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После индукции фага есть два разных способа продолжить трансдукционный анализ. Эти методы представлены на рисунке 1 , а также на шаге 4 и шаге 6.

4. Трансдукция во время кокультуры после воздействия на донора индуцирующего агента (Рисунок 1А)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть использован только в том случае, если фагопродуцирующий штамм (донор) имеет устойчивость к определенному антибиотику, а штамм, подлежащий трансдукции (реципиент), имеет устойчивость к другому антибиотику.

  1. Подготовьте культуру B. burgdorferi для использования в качестве реципиента в трансдукционных анализах, как описано для донорского штамма на этапе 1 выше. Исходя из плотности, определенной как на шаге 2, рассчитайте объем, необходимый для получения 15 мл 1 × 107 спирохет·мл−1.
  2. Центрифуга объема культуры рассчитывается на стадии 4.1 при 6000 х г в течение 10 мин. Декант супернатанта.
  3. Повторно суспендировать гранулу в 1 мл культуры со стадии 3.6 (повторноуспендированный донор фагов). Добавьте повторно суспендированного реципиента обратно в язык и региональные параметры вместе с донором. Не принимайте добавки с антибиотиками. Общий объем, содержащий обе культуры, составляет 15 мл.
  4. Инкубировать при 33 °C в течение 72-96 ч.
  5. Выполните отбор трансдуктантов путем твердофазного покрытия после совместного культивирования, как описано в шаге 7.

5. Осаждение полиэтиленгликоля (ПЭГ) для восстановления фага для использования в трансдукционном анализе

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть использован в случаях, когда фагообразующий штамм (донор) имеет устойчивость к определенному антибиотику, а штамм, подлежащий трансдукции (реципиент), либо не имеет устойчивости к антибиотикам, либо устойчивости к другому антибиотику.

  1. Дополнить культуру со стадии 3.6 соответствующим антибиотиком в концентрации, указанной в таблице 2. Инкубировать образец при 33 °C в течение 72-96 ч.
  2. Подготовьте растворы для осаждения ПЭГ.
    1. Приготовьте 500 мл 5 М NaCl. Стерилизуйте путем автоклавирования и дайте остыть перед использованием. Хранить при комнатной температуре.
    2. Приготовить 500 мл 40% ПЭГ растворив 200 г ПЭГ8000 в 400 мл воды; осторожно нагревать во время перемешивания до тех пор, пока раствор не будет хорошо перемешан. Доведите объем до 500 мл водой. Чтобы полностью растворить PEG8000 и стерилизовать раствор, автоклавируйте раствор и охладите перед использованием. Хранить при комнатной температуре.
    3. Приготовьте 100 мл суспензионной среды (SM; 100 мМ NaCl, 10 мМ MgSO4 и 50 мМ Tris-HCl [рН 7,5]). Стерилизуют автоклавированием. Хранить при температуре 4 °C.
  3. Для ПЭГ-осаждения фага из донорского клона B. burgdorferi (со стадии 3.6) после 72-96 ч инкубации центрифугируют образцы при 8000 х г в течение 20 мин при 4 °C.
  4. Декантировать супернатант в чистую коническую трубку объемом 50 мл; утилизируйте ячейку гранулы. Добавьте 5 М NaCl к конечной концентрации 1 М. Хорошо перемешать. Качать осторожно при комнатной температуре в течение 1 ч.
  5. Центрифугирование образцов при 8 000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Декантировать супернатант в чистую коническую трубку объемом 50 мл; гранула может быть маленькой или отсутствовать. Добавьте 40% раствор ПЭГ8000 к надосадочному веществу до конечной концентрации 10%. Хорошо перемешать и поставить на лед более чем на 1 ч до ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время, по-видимому, не коррелирует со значительно увеличенным восстановлением фагов.
  6. Центрифугирование образцов при 8 000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант и удалите как можно больше лишней жидкости без потери гранул, которые содержат частицы фага.
  7. Повторно суспендируйте гранулу в минимальном объеме SM, используя SM для промывки боковой части бутылки и сбора любых потенциальных частиц фага. Рекомендуемое соотношение составляет 400 мкл СМ на 10 мл исходного супернатанта, но в зависимости от размера гранулы для полной повторной суспензии может потребоваться больше или меньше СМ.
  8. Обработайте восстановленный образец фага равным объемом хлороформа на основе объема повторного суспензии. Хорошо перемешайте образец, а затем центрифугируйте при 8 000 х г в течение 10 мин. Удалите водный (верхний) слой в чистую трубку, избегая любого толстого пограничного слоя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: φBB-1 представляет собой бактериофаг без оболочки и не поддается обработке хлороформом25. Этот шаг делается для дальнейшего разрушения любых связанных с мембраной структур (то есть клеток или блебов) и для уничтожения любых потенциальных клеточных загрязнителей. Хлороформ является летучим органическим веществом и должен использоваться только в хорошо вентилируемой вытяжке; выбрасывать материал, содержащий хлороформ, в качестве органических отходов.
  9. Определите объем, восстановленный после первой обработки хлороформом, и снова обработайте образец количеством хлороформа, равным 10% от этого объема. Хорошо перемешать и центрифугировать при 8 000 х г в течение 10 мин. Удалите водный (верхний) слой, стараясь избегать любого интерфейсного или органического слоя. Переложите водный слой в чистую трубку.
  10. Используйте фаг немедленно (как описано в шаге 6) или храните при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замораживание образцов фагов φBB-1 не рекомендуется. Хотя стабильность φBB-1 при 4 °C не была тщательно исследована, образцы, хранящиеся при 4 °C в течение 1 месяца после восстановления, были успешно использованы в анализах трансдукции.

6. Анализ трансдукции после осаждения ПЭГ φBB-1 (Рисунок 1B)

  1. Подготовьте культуры B. burgdorferi для использования в качестве реципиента в анализах трансдукции, как описано для донорского штамма на этапе 1 выше. Исходя из плотности, определяемой как на шаге 2, рассчитывают объем культуры реципиента, необходимый для получения 15 мл 1 × 107 спирохет·мл−1.
  2. Центрифуга объема культуры рассчитана на стадии 6,1 при 6000 х г в течение 10 мин. Декантируйте супернатант и повторно суспендируйте гранулы в 14,5 мл свежего БСК.
  3. Добавьте ≤500 мкл осажденного ПЭГ образца фага (с этапа 5) в культуру клона-реципиента. Хорошо перемешать и инкубировать при 33 °С в течение 72-96 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество фагов, извлеченных во время осаждения ПЭГ, может быть переменным в зависимости от ряда факторов. Однако из 15 мл культуры индуцированного штамма B. burgdorferi CA-11.2A, 500 мкл обычно содержит 50-1000 жизнеспособных фагов28. Объемы извлечения фагов ≥500 мкл отрицательно влияют на рост B. burgdorferi , вероятно, из-за увеличения соотношения SM к BSK.
  4. Выполняют отбор трансдуктантов твердофазным покрытием после смешивания с ПЭГ-осажденным фагом, как описано на этапе 7.

7. Подбор трансдуктантов

ПРИМЕЧАНИЕ: Твердофазное покрытие потенциальных трансдуктантов выполняется с использованием однослойной модификации протокола, впервые описанного Сэмюэлсом15. Колонии B. burgdorferi растут внутри агара, поэтому для отбора трансдуктантов путем твердофазного покрытия образцы необходимо добавлять в среду во время заливки пластин. Альтернативный метод отбора трансформаторов методом разрежения в 96-луночных плитах также был описан ранее35. Этот метод также может быть эффективным для выбора трансдуктантов, но еще не был опробован для этой цели.

  1. Определите количество пластин, необходимых для выбора трансдуктантов, на основе количества образцов из анализов трансдукции и контрольных элементов, подлежащих покрытию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, на образец заливают две пластины, одна из которых эквивалентна приблизительно 10% объема культуры, а другая включает оставшуюся часть культуры. Кроме того, заливайте пластины, которые служат отрицательным контролем, чтобы индивидуально проверить, что фаговый препарат и / или родительские клоны, используемые в качестве донора и реципиента, не растут в присутствии антибиотика (ов), используемого во время отбора. Также рекомендуется подготовить гальванический материал по крайней мере для двух дополнительных пластин. Например, если количество образцов и элементов управления, подлежащих покрытию, составляет восемь, приготовьте достаточное количество гальванической смеси на 10 пластин.
  2. Подготовьте растворы для нанесения покрытий, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая пластина будет 30 мл, состоящая из 20 мл 1,5x BSK для покрытия и 10 мл 2,1% агарозы (соотношение 2:1). Это даст пластину с конечными концентрациями 1x BSK и 0,7% агарозы. Например, для 10 пластин приготовьте общую гальваническую смесь 300 мл, состоящую из 200 мл 1,5x BSK и 100 мл 2,1% агарозы.
    1. Подготовьте 1 л 1,5x BSK, как описано для 1x BSK на шаге 1.1, используя количества каждого компонента, указанного для 1,5x BSK в таблице 1. Хранить так, как описано для 1x BSK.
    2. Готовят 2,1% агарозы в воде и автоклаве. Используйте раствор агарозы в свежем виде или храните при комнатной температуре. При хранении при комнатной температуре разверните микроволновую печь с крышкой до полного расплавления перед нанесением покрытия.
    3. Определить объем антибиотика (ов), необходимый для достижения соответствующей концентрации (таблица 2), на основе всей смеси покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если общий объем окончательного раствора для нанесения покрытия составляет 300 мл, смешайте 200 мл 1,5x BSK и достаточно антибиотика, чтобы убедиться, что все 300 мл имеют правильную конечную концентрацию антибиотика. Если и донор, и реципиент в трансдукционном анализе имеют разные гены устойчивости к антибиотикам, гальваническая смесь должна содержать оба антибиотика. Если осажденный ПЭГ фаг от донора (подготовленный на этапе 5) кодирует маркер устойчивости к антибиотикам, а у реципиента его нет, гальваническая смесь должна содержать только один антибиотик.
  3. В зависимости от количества пластин, которые нужно налить, переложите соответствующее количество в 1,5 раза BSK и антибиотика (ов) в стерильный флакон, достаточно большой, чтобы вместить всю гальваническую смесь. Уравновешивайте на водяной бане при 56 °C в течение ≥15 мин.
  4. Уравновешивайте расплавленную агарозу из автоклава или микроволновой печи на водяной бане при температуре 56 °C в течение ≥15 мин.
  5. После уравновешивания добавляют в флакон определенное количество 2,1% агарозы с 1,5x BSK (с антибиотиком) и ставят гальванический раствор обратно на водяную баню при 42 °C в течение 10-15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие температуры могут повредить или убить спирохеты36. Если вы используете ту же водяную баню, что и выше, охладите водяную баню до 42-45 °C перед запуском таймера для равновесия. Не позволяйте гальваническому раствору уравновешиваться при 42 °C более 20 минут, иначе он начнет затвердевать при заливке тарелок.
  6. Во время уравновешивания подготовьте образцы B. burgdorferi к покрытию. Перенесите количество, подлежащее покрытию, в стерильную коническую центрифужную трубку объемом 50 мл (см. Таблицу материалов).
    1. При покрытии в количестве менее 1,5 мл (<5% от конечного объема пластины в 30 мл) перенесите образец в новую пробирку и добавьте гальваническую смесь непосредственно в образец во время гальванического покрытия.
    2. Для больших объемов переложите нужный объем культуры в новую трубку, а затем центрифугу при 6000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Декантируйте все, кроме 100-500 мкл супернатанта, и используйте оставшуюся часть для полного повторного суспендирования гранулы до нанесения покрытия.
    3. Для контрольных пластин после кокультуры добавляют ≥107 клеток донорских или реципиентных клонов в стерильные конические центрифужные трубки объемом 50 мл. Если объем превышает 1,5 мл, центрифугируют и повторно суспендируют гранулу, как показано на этапе 7.6.2. Если трансдукционный анализ проводили с использованием осажденного ПЭГ фага, то в дополнение к клону реципиента добавляют 100-250 мкл образца фага в стерильную коническую трубку объемом 50 мл для нанесения покрытия.
  7. После того, как гальванический раствор уравновешен при 42-45 °С в течение 10-15 мин, переложить 30 мл гальванического раствора в пробирку с соответствующим образцом; немедленно распределите гальваническую смесь и образец в маркированную тарелку. Повторите со свежей пипеткой для каждого образца, который должен быть покрыт.
  8. Дайте пластинам затвердеть в течение 15-20 минут, а затем поместите их в инкубатор с температурой 33 °C, дополненный 5% CO2. Не переворачивайте пластины в течение как минимум 48 ч после заливки.
  9. В зависимости от фона клона-реципиента, проверьте, появляются ли колонии в пределах агарозы на селекционных пластинах после 10-21 дня инкубации. Соберите не менее 5-10 колоний, которые растут на пластине в присутствии обоих антибиотиков, используя стерилизованную хлопковую 5,75 в боросиликатной пипетке (см. Таблицу материалов) и привите их в 1,5 мл 1x BSK соответствующим антибиотиком (антибиотиками).
  10. Выращивайте привитые колонии при 33 °C, как на стадии 1,3 в течение 3-5 дней или до тех пор, пока они не достигнут плотности примерно 20-40 спирохет на поле при 200-кратном увеличении с использованием микроскопии темного поля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После просеивания (см. этап 8) спирохеты могут быть заморожены для длительного хранения при −80 °C путем смешивания равного объема культуры со смесью 60% глицерина и 40% 1x BSK стерилизованы фильтрацией через фильтр 0,22 мкм.

8. Проверка потенциальных трансдуктантов

ПРИМЕЧАНИЕ: Скрининг клонов, которые растут на пластинах в присутствии двух антибиотиков, чтобы убедиться, что они представляют истинные трансдуктанты в ожидаемом (реципиентном) фоне. Эти методы основаны на амплификации и потенциальном секвенировании определенных областей полимеразной цепной реакцией. Подробные протоколы и методы проведения ПЦР у B. burgdorferi описаны в другом месте (недавний пример см. в Seshu et al.37). Выберите праймеры, используемые для скрининга трансдуктантов, на основе используемых штаммов. Некоторые предложения относительно того, как подходить к скринингу трансдуктантов, описаны ниже.

  1. Подготовьте лизаты B. burgdorferi для ПЦР-скрининга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол используется для получения промытых лизатов B. burgdorferi из культивируемых клеток, выращенных на этапе 7.9, для немедленного анализа ДНК с помощью ПЦР. Этот метод предназначен для минимизации интерференции потенциальных ингибиторов в BSK, но не рекомендуется для получения высококачественной ДНК для секвенирования или хранения. Для этого используйте протокол или комплект для полного извлечения генома (см. Таблицу материалов). Настоятельно рекомендуется, чтобы лизаты из родительских клонов (как донорских, так и реципиентных штаммов) также были подготовлены одновременно для включения в каждый анализ.
    1. Перенесите 500 мкл каждого выбранного и культивируемого потенциального трансдуктивного вещества, как на этапе 7.10, в чистую микроцентрифужную трубку.
    2. Центрифугировать культуры в течение 10 мин при 8 000 х г при комнатной температуре.
    3. Удалить супернатант и повторно суспендировать каждую гранулу в 500 мкл TE (10 мМ Tris Cl, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Центрифуга в течение 5 мин при 8 000 х г при комнатной температуре.
    4. Удалите супернатант и повторно суспендируйте каждую гранулу в 50 мкл воды качества ПЦР. Варить образцы в течение 10 мин. Дайте им ненадолго остыть, а затем центрифугируйте при 8000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    5. Для каждой ПЦР немедленно используйте 2 мкл сверху центрифугированного образца; не нарушайте гранулу.
  2. Скрининг потенциальных трансдуктантов для конкретных генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам, с помощью ПЦР. См. Таблицу 4 для праймеров для скрининга маркеров устойчивости к антибиотикам, обычно используемых в анализах трансдукции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это редкость в нашем опыте, спонтанная мутация в аминогликозидные антибиотики, используемые для отбора гетерологичной ДНК у B. burgdorferi , может произойти.
  3. Проверьте потенциальные трансдуктанты также с помощью другого штамма или маркера клона, чтобы подтвердить, что фон является фоном получателя. Включите в эти анализы как донора, так и родительского клона реципиента. Скрининг на специфические для деформации маркеры с использованием последовательностей, основанных на используемых штаммах и отдельных лабораторных протоколах для определения целостности деформации.
  4. При попытке трансдукции в вирулентные клоны для использования в клещевом векторе или хозяине млекопитающих или для прямого сравнения с другим клоном, определите полное содержание плазмид трансдуктантов и родительских клонов. Это делается для обеспечения того же содержания плазмид, что и у сравнительного штамма, или наличия генетических элементов, необходимых для размножения в энзоотическом цикле, как описано в другом месте 18,19,37,38,39.

Результаты

Использование бактериофага для перемещения ДНК между более легко трансформируемыми штаммами B. burgdorferi или клонами, которые непокорны электротрансформации, представляет собой еще один инструмент для продолжения молекулярного исследования детерминант болезни Лайма. Трансдукцион...

Обсуждение

Использование трансдукции может представлять собой один из методов преодоления, по меньшей мере, некоторых биологических и технических барьеров, связанных с электротрансформацией B. burgdorferi 1,4,13,37. Во многих сист?...

Раскрытие информации

Автору нечего раскрывать.

Благодарности

Автор хотел бы поблагодарить Шону Рид, Д. Скотта Сэмюэлса и Патрика Секора за их полезную дискуссию и Вареона (Пэм) Чонвиравонга за их техническую помощь. Эта работа была поддержана Департаментом биомедицинских наук и исследовательскими грантами факультета Кристиану Х. Эггерсу из Школы наук о здоровье в Университете Куиннипиак.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)Millipore SigmaS2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)USA Scientific1450-0810holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)Millipore SigmaCAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)Thermo Fisher Scientific13-678-8Aautoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LEDot Scientific inc.AGLE-500
Bacto NeopeptoneGibcoDF0119-17-9
Bacto TC YeastolateGibco255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)Gemini Bio-Products700-104P
Chloroform (for molecular biology)Thermo Fisher ScientificBP1145-1CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)US BiologicalC5900-01cell culture grade
ErythromycinResearch Products International CorpE57000-25.0
Gentamicin reagent solutionGibco15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)Thermo Fisher ScientificBP350-500
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-500
Kanamycin sulfateThermo Fisher Scientific25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)Millipore SigmaSLGSM33SSto filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin CThermo Fisher ScientificBP25312CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamineMP Biomedicals, LLC100068
Oligonucleotides (primers for PCR)IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)G Biosciences786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)Thermo Fisher ScientificFB0875712
Petroff-Hausser counting chamberHausser scientificHS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glassHausser scientificHS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)Thermo Fisher ScientificBP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)Pel-Freez Biologicals31119-3heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettesUSA Scientific9750-9150
Sodium bicarbonateThermo Fisher ScientificBP328-500
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificBP358-1
Sodium pyruvateMillipore SigmaP8674-25G
Spectronic Genesys 5Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solutionMillipore SigmaS6501-50G
Trisodium citrate dihydrateMillipore SigmaS1804-500Gsodium citrate for BSK

Ссылки

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066 (2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195 (2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131 (1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331 (2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi.. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61 (2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165 (2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994 (2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7 (2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298 (1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S., Saier, M. H., Garcia-Lara, J. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. , 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. . Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

187Borrelia burgdorferi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены