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摘要

噬菌体在细菌细胞之间移动DNA的能力使其成为细菌宿主遗传操作的有效工具。这里介绍的是一种诱导、恢复和使用 φBB-1（ 伯氏疏螺旋体噬菌体）在莱姆病螺旋体的不同菌株之间转导异源 DNA 的方法。

摘要

将外源DNA引入伯氏螺旋体伯 氏疏螺旋 体几乎完全通过使用电穿孔的转化来完成。与其他特征更好的革兰氏阴性细菌相比，这一过程在莱姆病螺旋体中的效率显着降低。 转化的成功率高度依赖于来自特定背景的高质量DNA的浓缩量，并且受到显着的菌株间变异性的影响。将外源DNA（即穿梭载体、荧光报告基因和抗生素耐药性标记物）引入 伯氏螺旋体 的替代方法可能是莱姆病螺旋体遗传操作有用工具的重要补充。噬菌体已被公认为DNA在称为转导过程中在细菌之间移动的天然机制。在这项研究中，已经开发出一种使用无处不在的疏螺旋体噬菌体φBB-1在相同和不同遗传背景的 伯氏疏螺旋体 细胞之间转导DNA的方法。转导的DNA包括小穿梭载体形式的疏螺旋体DNA和异源DNA。这一证明表明，噬菌体介导的转导作为电穿孔的补充，用于莱姆病螺旋体的遗传操作。本报告描述了从 伯氏疏螺旋体中诱导和纯化噬菌体φBB-1的方法，该噬菌体在转导测定中的应用，以及潜在转导剂的选择和筛选。

引言

螺旋体细菌伯氏疏螺旋体遗传操作工具的开发为理解莱姆病的性质增加了不可估量的价值1，2，3，4。伯氏双歧杆菌具有异常复杂的基因组，由一条小的线性染色体以及线性和环状质粒5，6组成。自发质粒丢失、基因内重排（基因在同一生物体内从一个质粒移动到另一个质粒）和水平基因转移（HGT，两个生物体之间的DNA移动）在伯氏双歧杆菌中引起了令人眼花缭乱的遗传异质性（例如，参见Schutzer等人7）。由此产生的基因型（或"菌株"）都是同一物种的成员，但具有遗传差异，影响它们传播和感染不同哺乳动物宿主的能力8，9，10，11。在本报告中，术语"菌株"将用于指具有特定自然来源遗传背景的伯氏双歧杆菌;术语"克隆"将用于指为特定目的或作为实验操作结果而进行基因改造的菌株。

可用于伯氏芽孢杆菌的分子工具箱包括可选标记、基因报告基因、穿梭载体、转座子诱变、诱导启动子和反选择性标记（有关综述，请参阅Drektrah和Samuels12）。这些方法的有效使用需要人工将异源（外来）DNA引入感兴趣的伯氏疏螺旋体菌株中。在伯氏疏螺旋体中，异源DNA的引入几乎完全是通过电穿孔实现的，电穿孔是一种利用电脉冲使细菌膜瞬时渗透到引入培养基中的小块DNA的方法1。大多数细胞（估计为≥99.5%）被脉冲杀死，但其余细胞保留异源DNA的频率很高13。虽然被认为是将DNA引入细菌的最高效方法之一，但电穿孔到伯氏疏螺旋体的频率非常低（范围从5×104到5×106细胞中的1个转化体）13。实现更高频率转变的障碍似乎是技术和生物方面的。在制备电感受态细胞时，伯氏疏螺旋体成功电穿孔的技术障碍包括所需的 DNA 量 （>10 μg） 和螺旋体在制备电感受态细胞时完全处于正确的生长期（对数中期，在 2 × 10 7 个细胞·mL−1 和 7 × 107 个细胞·mL−1 之间）的要求12，13。然而，这些技术障碍可能比生物障碍更容易克服。

莱姆病研究人员认识到，伯氏疏螺旋体克隆可分为两大类，就其遗传操纵能力而言13，14。高传代、实验室适应的分离株通常很容易转化，但通常已经失去了感染性所必需的质粒，行为异常，并且无法感染哺乳动物宿主或持续存在于蜱载体12，13 中。虽然这些克隆对于在实验室内剖析螺旋体的分子生物学很有用，但它们对于在地方性动物病循环的生物学背景下研究螺旋体几乎没有价值。另一方面，低传代感染分离株以反映感染状态的生理方式表现，可以完成感染周期，但通常难以引入异源DNA，因此难以操作用于研究12，13。转化低传代分离株的困难至少与两个不同的因素有关:（i）低传代分离株通常紧密聚集在一起，特别是在电穿孔所需的高密度条件下，从而阻止许多细胞充分应用电荷或获取培养基中的DNA13，15;（ii）伯氏双歧杆菌编码至少两种不同的质粒携带的限制性限制性修饰（R-M）系统，这些系统可能在高传代分离株14，16中丢失。R-M系统已经进化到允许细菌识别和消除外来DNA17。事实上，对伯氏芽孢杆菌的几项研究表明，当DNA的来源是伯氏疏螺旋体而不是大肠杆菌时，转化效率会提高13，16。不幸的是，从伯氏疏螺旋体获得电穿孔所需的高浓度DNA是一个昂贵且耗时的前景。电泳和选择低传代分离物时的另一个潜在问题是，该过程似乎有利于失去关键毒力相关质粒lp2514，18，19的转化体;因此，通过电穿孔对低传代伯氏疏螺旋体分离株进行遗传操作的行为可能会选择不适合在地方性动物病循环20中进行生物学相关分析的克隆。鉴于这些问题，一个可以将异源DNA电转化为高传代伯氏疏螺旋体克隆，然后通过电穿孔以外的方法转移到低传代感染性分离株中的系统可能是可用于莱姆病螺旋体的越来越多的分子工具集合的受欢迎的补充。

除了转化（裸DNA的摄取）之外，细菌还定期吸收异源DNA的另外两种机制:偶联，这是细菌之间直接物理接触的DNA交换，以及转导，这是由噬菌体介导的DNA交换21。事实上，噬菌体介导HGT的能力已被用作解剖许多细菌系统内分子过程的实验工具22，23，24。B. burgdorferi不能天然地摄取裸DNA的能力，并且几乎没有证据表明B. burgdorferi编码促进成功偶联所需的装置。 然而，以前的报告已经描述了φBB-1的鉴定和初步表征，φBB-1是B. burgdorferi25，26，27，28的温带噬菌体。φBB-1 包装了在伯氏疏螺旋体25 中发现的 30 kb 质粒家族;该家族的成员被指定为CP32。与φBB-1在伯氏疏螺旋体中参与HGT的作用一致，Stevenson等人报告了在两种菌株中发现的相同的cp32，在其他方面不同的cp32s中，表明最近在这两种菌株之间共享该cp32，可能是通过转导29。还有证据表明，在其他相对稳定的基因组30，31，32，33中，cp32s通过HGT进行了显着重组。最后，φBB-1在同一菌株的细胞之间以及两种不同菌株的细胞之间转导cp32s和异源穿梭载体DNA的能力已在先前证明27，28。鉴于这些发现，φBB-1已被提议作为另一种用于解剖伯氏疏螺旋体分子生物学的工具。

本报告的目的是详细介绍一种从 伯氏疏螺旋体中诱导和纯化噬菌体φBB-1的方法，并提供一种在 伯氏疏螺旋体 克隆之间进行转导测定以及选择和筛选潜在转导剂的方案。

研究方案

所有使用重组DNA和BSL-2生物体的实验都经过昆尼皮亚克大学机构生物安全委员会的审查和批准。

1. 伯氏芽孢杆菌 培养物的制备，用于生产φBB-1

  1. 准备补充有 6.6% 热灭活正常兔血清 （BSK） 的巴伯-斯托纳-凯利培养基15。对于 1 L 的 1x BSK，将表 1 中列出的组分混合在 900 mL 水中，使用 1 N 氢氧化钠将 pH 调节至 7.6，并在 4 °C 下缓慢混合 2-4 小时。混合完成后，如有必要，检查并重新调节pH值至7.6，并用水将体积增加到1L。通过0.22μM过滤器（见 材料表）对培养基进行灭菌，并使用新鲜的或在4°C下储存≤2个月。
  2. 在开始转导方案前三到五天，将 150 μL 适当的 伯氏疏螺旋体 克隆接种到 15 mL 的 1x BSK 中，放入密闭的无菌锥形离心管中（参见 材料表）。用适当浓度的抗生素或抗生素组合补充培养基，以选择和维持 伯氏疏螺旋体 克隆内的异源DNA（表2）。
    注意:伯氏疏螺旋体是一种生物安全2级生物。在使用这种生物体时采取一切适当的预防措施。在经过认证和适当消毒的II类生物安全柜中对伯氏疏螺旋体的活培养物进行所有工作。根据CDC指南34正确处理与伯氏疏螺旋体接触的所有物质和生物体本身。
  3. 将培养物在33°C下孵育而不摇动，直到培养物达到≥5×107 螺旋体·mL−1的密度，大约需要3-5天。

2. 确定 伯氏双歧杆菌 培养物的密度（由塞缪尔斯改性）15

  1. 对于预期密度高于 5 × 106 个细胞·mL−1，使用光谱法确定细胞密度。
    1. 将 1 mL 培养物转移到 1.7 mL 微量离心管中，并在室温下以 8，000 x g 离心 5 分钟。
    2. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于1mL磷酸盐缓冲盐水（PBS;137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na 2 HPO 4和1.8mM KH2PO4）中。将整个细胞悬液转移到半微量紫外线透明比色皿中。
    3. 确定重悬样品在600nm（A600）波长处的光密度。将分光光度计（见 材料表）对PBS进行归零。
    4. 要计算原始培养物中螺旋体·mL−1 的浓度，请将A600 处的光密度乘以1.4×109。
  2. 对于预计在 5 × 104 细胞·mL−1 和 5 × 106 细胞·mL−1 之间的密度，使用彼得罗夫-豪瑟计数室（见 材料表）确定细胞密度，直接计数螺旋体的数量。该方法也可用于适当稀释后的更高密度。
    注意:活螺旋体的可视化需要用暗场聚光镜修改显微镜。
    1. 将 10 μL 样品涂在计数室中，并盖上适当的盖玻片。对于密度高于 1 × 107，将样品稀释在 PBS 中，以每场产生 50-100 个螺旋体。
    2. 使用暗场显微镜以200x-400x的放大倍率计数细胞。计算所有平面上 25 组 16 个小方块的整个字段。
    3. 将计数的数量乘以稀释因子（如果有的话）和 5 × 104 得到 原始培养物的细胞·mL−1 。

3. 伯氏疏 螺旋体噬菌体φBB-1的诱导

注意:通过高压灭菌对所有玻璃器皿和塑料器皿进行消毒;通过高压灭菌或通过0.22μM过滤器过滤对所有溶液进行灭菌。以下步骤基于15 mL的体积，但该方法可根据实验的个体需求扩展到更小或更大的体积。

  1. 对于将产生噬菌体的 伯氏疏螺旋 体培养物（供体），使用步骤 2 中任一方法计算的浓度来确定产生 4 mL 2 × 108 螺旋体·mL−1 所需的起始培养物体积。这将在恢复阶段（下面的步骤3.6）在15 mL中产生5×107 个螺旋体·mL−1 的最终浓度。
  2. 将步骤3.1中计算的培养物体积以6，000× g 离心10分钟。倒出上清液并将沉淀重悬于4 mL新鲜BSK中。 将样品转移到最小的无菌管中，以最小的顶部空间容纳样品。
  3. 根据4mL的培养体积，将适量的诱导剂加入至推荐浓度（表3），以诱导噬菌体的产生。盖紧管子并充分混合。
  4. 将样品在33°C孵育2-4小时。
  5. 孵育后，将样品转移到 15 mL 离心管中。将样品以6，000× g 离心10分钟。倒出上清液。
  6. 将细胞沉淀重悬于 15 mL 的 1x BSK 中。
    注意:诱导噬菌体后，有两种不同的方法可以进行转导测定。这些方法如图 1 以及步骤 4 和步骤 6 所示。

4.供体暴露于诱导剂后共培养期间的转导（图1A）

注意:仅当噬菌体生产菌株（供体）对特定抗生素具有抗性并且要转导的菌株（受体）对另一种抗生素具有耐药性时，才能使用此协议。

  1. 制备伯 氏疏螺旋 体培养物，用作转导测定中的受体，如上述步骤1中供体菌株所述。根据步骤 2 中确定的密度，计算产生 1 × 107 螺旋体·mL−1 的 15 mL 所需的体积。
  2. 将步骤4.1中计算的培养物体积以6，000× g 离心10分钟。倒出上清液。
  3. 将沉淀重悬于步骤3.6（重悬噬菌体供体）中的1mL培养物中。将重新悬浮的接受者与捐赠者一起重新添加到文化中。不要补充抗生素。含有两种培养物的总体积为 15 mL。
  4. 在33°C孵育72-96小时。
  5. 如步骤7所述，在共培养后通过固相电镀进行转导剂的选择。

5. 聚乙二醇（PEG）沉淀以回收噬菌体用于转导测定

注意:该方案可用于噬菌体生产菌株（供体）对特定抗生素具有抗性并且要转导的菌株（受体）没有抗生素耐药性或对另一种抗生素具有耐药性的情况。

  1. 用 表2所示浓度的适当抗生素补充步骤3.6中的培养物。将样品在33°C孵育72-96小时。
  2. 准备PEG沉淀溶液。
    1. 准备 500 mL 的 5 M 氯化钠。使用前通过高压灭菌并冷却。在室温下储存。
    2. 通过将 200 g PEG8000 溶解在 400 mL 水中来制备 500 mL 的 40% PEG;搅拌时轻轻加热，直到溶液充分混合。用水使体积达到 500 mL。要完全溶解PEG8000并对溶液进行灭菌，请在使用前对溶液进行高压灭菌并冷却。在室温下储存。
    3. 准备 100 mL 悬浮培养基（SM;100 mM 氯化钠、10 mM MgSO4 和 50 mM Tris-HCl [pH 7.5]）。通过高压灭菌灭菌。储存在4°C。
  3. 对于来自 供体B. burgdorferi 克隆的噬菌体的PEG沉淀（来自步骤3.6），孵育72-96小时后，将样品在4°C下以8，000× g 离心20分钟。
  4. 将上清液倒入干净的 50 mL 锥形管中;处理细胞沉淀。加入5M NaCl至终浓度为1 M.充分混合。在室温下轻轻摇摆1小时。
  5. 将样品在4°C下以8，000× g 离心10分钟。 将上清液倒入干净的 50 mL 锥形管中;颗粒可能很小或不存在。向上清液中加入40%PEG8000溶液至终浓度为10%。搅拌均匀，在冰上放置1小时以上至过夜。
    注意:较长的时间似乎与噬菌体回收率显着增加无关。
  6. 将样品在4°C下以8，000× g 离心20分钟。 弃去上清液并尽可能多地去除多余的液体，而不会损失任何含有噬菌体颗粒的沉淀。
  7. 将沉淀重悬于最小体积的SM中，使用SM冲洗瓶子的侧面并收集任何潜在的噬菌体颗粒。推荐的比例为每 10 mL 原始上清液 400 μL SM，但根据沉淀的大小，完全重悬可能需要或多或少的 SM。
  8. 根据重悬液体积，用等体积的氯仿处理回收的噬菌体样品。充分混合样品，然后以8，000× g 离心10分钟。将水性（顶部）层移到干净的管中，避免任何厚界面层。
    注意:φBB-1是一种无包膜噬菌体，对氯仿处理不敏感25。完成此步骤是为了进一步破坏任何膜结合结构（即细胞或泡）并杀死任何潜在的细胞污染物。氯仿是一种挥发性有机物，只能在通风良好的通风橱中使用;将含有氯仿的材料作为有机废物丢弃。
  9. 确定第一次氯仿处理后回收的体积，并再次用等于该体积10%的氯仿处理样品。充分混合并以8，000 x g 离心10分钟。去除水性（顶部）层，小心避免任何界面或有机层。将水层转移到干净的管中。
  10. 立即使用噬菌体（如步骤6中所述）或储存在4°C。
    注意:不建议冷冻φBB-1噬菌体样品。虽然φBB-1在4°C下的稳定性尚未得到严格研究，但样品在回收后在4°C下储存长达1个月已成功用于转导测定。

6. φBB-1 PEG 沉淀后的转导测定（图 1B）

  1. 准备 伯氏疏螺旋 体培养物以用作转导测定中的受体，如上述步骤1中对供体菌株所述。根据步骤2中确定的密度，计算产生15 mL 1 × 107 螺蜥·mL−1所需的受者培养体积。
  2. 将步骤6.1中计算的培养物体积以6，000× g 离心10分钟。倒出上清液并将沉淀重悬于 14.5 mL 新鲜 BSK 中。
  3. 将 ≤500 μL PEG 沉淀的噬菌体样品（来自步骤 5）添加到受体克隆的培养物中。充分混合并在33°C孵育72-96小时。
    注意:PEG沉淀期间回收的噬菌体量可以变化，具体取决于许多因素。然而，从 15 mL 诱导 伯氏疏螺旋体 菌株 CA-11.2A 培养物中，500 μL 通常含有 50-1，000 个活噬菌体28。噬菌体回收量≥500 μL对 伯氏疏螺旋体 的生长产生不利影响，可能是由于SM与BSK的比例增加。
  4. 如步骤7所述，在与PEG沉淀的噬菌体混合后，通过固相电镀进行转导剂的选择。

7. 转导剂的选择

注意:潜在转导剂的固相电镀是使用Samuels首次描述的协议的单层修改进行的。 伯氏疏螺旋体 菌落在琼脂内生长，因此为了通过固相电镀选择转导剂，必须在倒入平板时将样品添加到培养基中。在96孔板中使用稀释法选择转化体的替代方法也已在前面描述35。该技术也可能对转导剂的选择有效，但尚未为此目的进行尝试。

  1. 根据转导测定和对照中要接种的样品数量，确定选择转导剂所需的板数。
    注意:通常，每个样品倒入两个板，一个相当于培养体积的约10%，另一个包括培养物的其余部分。此外，倒入作为阴性对照的平板，以单独测试用作供体和受体的噬菌体制剂和/或亲本克隆在选择期间使用的抗生素存在下不会生长。还建议为至少两个额外的板准备电镀材料。例如，如果要铺板的样品和对照数量为8个，则为10个板准备足够的电镀混合物。
  2. 如下所述制备电镀溶液。
    注意:每个板将为 30 mL，包括 20 mL 用于电镀的 1.5x BSK 和 10 mL 2.1% 琼脂糖（2:1 比例）。这将产生终浓度为1x BSK和0.7%琼脂糖的板。例如，对于 10 个板，准备 300 mL 的总电镀混合物，包括 200 mL 1.5x BSK 和 100 mL 2.1% 琼脂糖。
    1. 按照步骤1.1中对1x BSK的描述，使用 表1中列出的1.5x BSK的每种组分的量制备1 L的1.5x BSK。按照 1x BSK 的说明进行存储。
    2. 在水中制备2.1%琼脂糖并高压灭菌。使用新鲜的琼脂糖溶液或在室温下储存。如果在室温下储存，请在电镀前松散地盖上盖子微波炉，直到完全熔化。
    3. 根据整个电镀混合物确定达到适当浓度所需的抗生素体积（表2）。
      注意:如果最终电镀液的总体积为 300 mL，请混合 200 mL 的 1.5x BSK 和足够的抗生素，以确保整个 300 mL 具有正确的最终抗生素浓度。如果转导测定中的供体和受体具有不同的抗生素抗性基因，则铺板混合物应包含两种抗生素。如果来自供体的PEG沉淀噬菌体（如步骤5中制备的）编码抗生素耐药性标记物并且受体没有抗生素耐药性标记物，则板混合物应仅包含一种抗生素。
  3. 根据要倒入的板数，将适量的 1.5x BSK 和抗生素转移到足够大的无菌瓶中，以容纳整个电镀混合物。在56°C的水浴中平衡≥15分钟。
  4. 在56°C水浴中平衡高压釜或微波中的熔融琼脂糖≥15分钟。
  5. 平衡后，用1.5x BSK（含抗生素）将测定量的2.1%琼脂糖加入瓶中，并将电镀溶液放回42°C的水浴中10-15分钟。
    注意:较高的温度会损坏或杀死螺旋体36。如果使用与上述相同的水浴，请在启动平衡计时器之前将水浴冷却至42-45°C。不要让电镀液在42°C平衡超过20分钟，否则在倒入板时会开始凝固。
  6. 在平衡过程中，准备要电镀的 伯氏双歧杆菌 样品。将要接种的量转移到无菌的50 mL锥形离心管中（参见 材料表）。
    1. 如果电镀量小于 1.5 mL（最终 30 mL 板体积的 <5%），则将样品转移到新管中，并在电镀过程中将电镀混合物直接添加到样品中。
    2. 对于更大的体积，将所需体积的培养物转移到新管中，然后在室温下以6，000× g 离心10分钟。倒出除 100-500 μL 上清液以外的所有上清液，并在电镀前使用剩余的完全重悬沉淀。
    3. 对于共培养后的对照板，将供体或受体克隆的≥ 10 7 个细胞添加到无菌 50 mL 锥形离心管中。如果体积超过 1.5 mL，请按照步骤 7.6.2 离心并重悬沉淀。如果使用PEG沉淀的噬菌体进行转导测定，则除了受体克隆外，还将100-250μL噬菌体样品加入无菌的50 mL锥形管中进行电镀。
  7. 电镀液在42-45°C平衡10-15分钟后，将30mL电镀液转移到装有适当样品的管中;立即将电镀混合物和样品分配到标记的板中。对要铺板的每个样品重复使用新鲜移液管。
  8. 让板凝固15-20分钟，然后将它们置于补充有5%CO2的33°C培养箱中。倒入后至少48小时不要倒置板。
  9. 根据受体克隆的背景，在孵育10-21天后检查菌落是否出现在选择板上的琼脂糖内。使用无菌棉塞 5.75 硼硅酸盐移液管（参见 材料表）在两种抗生素存在下挑选至少 5-10 个在平板上生长的菌落，并将它们接种到 1.5 mL 的 1x BSK 中与适当的抗生素。
  10. 如步骤1.3所示，在33°C下培养接种的菌落3-5天，或使用暗场显微镜在200倍放大倍率下达到每场约20-40个螺旋体的密度。
    注意:筛选后（参见步骤8），通过将等体积的培养物与60%甘油和40%1x BSK的混合物混合，通过0.22μm过滤器过滤灭菌，可以将螺旋体冷冻以在-80°C下长期储存。

8. 验证潜在的转导剂

注意:在两种抗生素存在的情况下筛选在平板上生长的克隆，以验证它们在预期（受体）背景中是否代表真正的转导剂。这些方法基于聚合酶链反应对特定区域的扩增和潜在测序。在 伯氏疏螺旋体 中进行PCR的详细方案和实践在别处描述（有关最近的示例，请参阅Seshu等人37）。根据所使用的菌株选择用于筛选转导剂的引物。关于如何筛选转导剂的一些建议如下所述。

  1. 准备 伯氏疏螺旋体 裂解物用于PCR筛选。
    注意:以下协议用于从步骤7.9中生长的培养细胞中产生洗涤的 伯氏疏螺旋体裂解物 ，以便通过PCR立即分析DNA。该方法旨在最大限度地减少BSK中潜在抑制剂的干扰，但不建议用于生产用于测序或储存的高质量DNA。为此，请使用方案或试剂盒进行全基因组提取（见 材料表）。强烈建议同时制备来自亲本克隆（供体和受体菌株）的裂解物，以包含在每次分析中。
    1. 将步骤7.10中选择和培养的每种潜在转导剂的500μL转移到干净的微量离心管中。
    2. 在室温下以8，000× g 离心培养物10分钟。
    3. 除去上清液并将每个沉淀重悬于500μLTE（10mM Tris Cl，pH 8.0;1mM EDTA，pH 8.0）中。在室温下以8，000× g 离心5分钟。
    4. 除去上清液并将每个沉淀重悬于 50 μL PCR 质量的水中。将样品煮沸10分钟。让它们短暂冷却，然后在室温下以8，000× g 离心10分钟。
    5. 对于每个PCR，立即从离心样品顶部使用2μL;避免干扰颗粒。
  2. 使用PCR筛选编码抗生素耐药性的特定基因的潜在转导剂。用于筛选转导测定中常用的抗生素耐药性标志物的引物参见 表4 。
    注意:虽然在我们的经验中很少见，但可能发生用于选择 伯氏疏螺旋体 异源DNA的氨基糖苷类抗生素的自发突变。
  3. 也使用另一个菌株或克隆标记筛选潜在的转导剂，以确认背景是受体的背景。在这些分析中包括供体和受体亲本克隆。使用基于所用菌株的序列和用于确定菌株完整性的单个实验室方案筛选菌株特异性标记物。
  4. 如果试图转导成毒力克隆以在蜱载体或哺乳动物宿主中使用或与另一个克隆直接比较，请确定转导剂和亲本克隆的完整质粒含量。这样做是为了确保质粒含量与比较菌株的质粒含量相同，或者存在在地方动物病循环中繁殖所需的遗传元件，如其他地方所述18，19，37，38，39。

结果

使用噬菌体在更容易转化的 伯氏疏螺旋体 菌株或难以电转化的克隆之间移动DNA，代表了对莱姆病决定因素进行持续分子研究的另一种工具。本文描述的转导测定可以根据需要进行修改，以促进DNA在任何感兴趣的克隆之间的移动，使用一种或两种抗生素来选择潜在的转导剂。高传代菌株CA-11.2A克隆与高传代菌株B31克隆和菌株297的低传代毒力克隆之间的噬菌体DNA和异源 大肠杆菌/伯氏...

讨论

转导的使用可以代表一种克服至少一些与伯氏疏螺旋体1，4，13，37电转化相关的生物学和技术障碍的方法。在许多系统中，噬菌体可以通过广义或特化的转导在细菌细胞之间移动宿主（非噬菌体）DNA22，23，24，49

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者希望感谢Shawna Reed，D. Scott Samuels和Patrick Secor的有益讨论以及Vareeon （Pam） Chonweerawong的技术援助。这项工作得到了生物医学科学系的支持，并为昆尼皮亚克大学健康科学学院的Christian H. Eggers提供了研究资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size)Millipore SigmaS2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene)USA Scientific1450-0810holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG)Millipore SigmaCAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile)Thermo Fisher Scientific13-678-8Aautoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene)USA Scientific1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LEDot Scientific inc.AGLE-500
Bacto NeopeptoneGibcoDF0119-17-9
Bacto TC YeastolateGibco255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade)Gemini Bio-Products700-104P
Chloroform (for molecular biology)Thermo Fisher ScientificBP1145-1CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder)US BiologicalC5900-01cell culture grade
ErythromycinResearch Products International CorpE57000-25.0
Gentamicin reagent solutionGibco15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous)Thermo Fisher ScientificBP350-500
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-500
Kanamycin sulfateThermo Fisher Scientific25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size)Millipore SigmaSLGSM33SSto filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin CThermo Fisher ScientificBP25312CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamineMP Biomedicals, LLC100068
Oligonucleotides (primers for PCR)IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit)G Biosciences786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm)Thermo Fisher ScientificFB0875712
Petroff-Hausser counting chamberHausser scientificHS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glassHausser scientificHS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG)Thermo Fisher ScientificBP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS)Pel-Freez Biologicals31119-3heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettesUSA Scientific9750-9150
Sodium bicarbonateThermo Fisher ScientificBP328-500
Sodium chlorideThermo Fisher ScientificBP358-1
Sodium pyruvateMillipore SigmaP8674-25G
Spectronic Genesys 5Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solutionMillipore SigmaS6501-50G
Trisodium citrate dihydrateMillipore SigmaS1804-500Gsodium citrate for BSK

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